Name: 유전자 변형으로 인코딩된 칼슘 센서를 사용하여 Apoptosis 동안 Mitochondrial 칼슘 레벨에서 동적 변경 사항 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: 학습하세요 유전자 변형 칼슘 센서를 이용한 라이브 세포의 미토콘드리아 칼슘 역학 측정 방법을. ratiometric pericam-mt를 활용한 이 기술은 세포 대사 및 신호 전달 연구에 필수적인 실시간 이미징 데이터를 제공합니다.

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우리는 ratiometric - pericam - MT 표현 구조와 함께 우리를 제공 아츠시 미야 와키 감사하고 싶습니다. 이 작품은 국립 보건원 (DB)에서 부여 GM081685에 의해 지원되었다.

1. Pericam - MT의 Transfection 및 세포 준비. <ol><li> 표준 6 자 문화 플레이트에 위치 멸균 유리 coverslips에 transfection 전에 플레이트 헬라 세포는 밤. </li><li> 제조 업체 (Invitrogen)에 의해 제안으로 DNA / Lipofectamine 2000 단지를 준비합니다. 우리는 ratiometric - pericam - MT 발현 벡터 4 μg 각 잘 대해 Opti - 멤 0.5 ML에 희석 Lipofectamine 2000 10 μL를 사용합니다. 세포는 transfection 전에 ~ 70 %의 합류해야합니다. </li><li> 항생제없이 동일한 미디어 1.5 ML 각 우물에 헬라 문화 미디어 (Dulbecco의 수정 독수리 중간 10 % FBS, 페니실린 / 스트렙토 마이신) 교체합니다. </li><li> 각 잘 transfected 수에 DNA / Lipofectamine 단지를 추가합니다. 37 O C 5 % CO 2에서 세포 문화 인큐베이터에서 4 시간 동안 신나게 부화와 함께 부드럽게 섞는다. </li><li> 항생제와 문화 매체와 항생제없이 미디어를 교체합니다. 세포 이미징 전에 1-2일에 대한 ratiometric pericam을 표현하도록 허용합니다. </li></ol> 2. 현미경 설정 및 이미지 수집 <ol><li> 107mM NaCl, 7.2mM KCl, 1.2mM MgCl 2, 1mM CaCl 2, 11.5mM 포도당, 0.1 % 소 혈청 알부민 및 20mM HEPES 7.2 : 이미징 솔루션을 적절한 이미지 챔버에 헬라 세포와 coverslip를 놓습니다. 저희 연구실은 Invitrogen에서 Attofluor 셀 챔버를 사용합니다. 거꾸로 현미경 단계에있는 이미징 챔버를 탑재합니다. </li><li> 40x (또는 이상) 기름 침지 목표를 사용하여 ratiometric pericam을 표현하는 하나 이상의 세포를 포함하는 관심 영역을 찾아보십시오. 우리는 ratiometric pericam은 380 nm의에서 photobleaching 적은 강한 것으로 나타났습니다, 그래서 우리는 적당한 세포를 식별이 파장을 사용합니다. 그림 1에서 가져온 이미지의 경우, 1.3 조리개 수치와 니콘 Superfluor 40X 목적은 사용되었다. 높은 배율의 목표는 (60 - 100x) 적절한 것입니다. 사용 여기 필터는 채도 기술 필터 D380/30x했다 (380 + / - 30 nm의)과 D495/10 (495 + / - 5 nm의), beamsplitter가 505DCXR (505nm longpass)이었고, 방사 필터 HQ535/50m (535도 + /되었습니다 - 25nm). 그림 1의 이미지를 획득하는 데 사용되는 우리의 현미경 로퍼 과학 Coolsnap 사령부 CCD 카메라, Ludl MAC6000 빠른 필터 휠과 체인저 및 MetaFluor 데이터 수집 및 분석 소프트웨어를 냉각이 장착된 니콘 TE2000 거꾸로 현미경으로 구성되어 있습니다. 이 프로토콜은 적절한 필터와 ratiometric 이미지를 캡처하고 처리할 소프트웨어를 사용하여 모든 표준 와이드 필드 현미경을 적용할 수 있습니다. </li><li> 495 및 380 nm의 필터를 사용하여 이중 여기에 대한 소프트웨어를 설정합니다. ratiometric pericam에 바인딩 칼슘은 495 nm의 흡광도에서 증가, 따라서 비율은 495 nm의 nm/380로 설정해야합니다. Ratiometric pericam은 415 nm의 4 칼슘 무료 여기 피크 있습니다. 그것이 대부분의 칼슘 이미징 연구소에서 유비 쿼터스 경우에만하기 때문에이 프로토콜에서 우리는 380 nm의 필터를 사용하는 것이 좋습니다. 410 NM 필터를 사용할 경우, 그것은 380 nm의 필터 것이 바람직합니다. </li><li> 495 및 380 nm의에 순차적으로 또는 흥미로운 이미지를 취득. 재관류 장치를 통해 작용제의 응용 프로그램을하기 전에 최소한 30 s에 대한 기준 칼슘 수준의 이미지를 취득. 각 작용제에 대한 추가 시간을 표시합니다. 노출 시간 및 수집 간격은 여전히​​ 충분한 시간적 resolution.For 예제를 허용하면서 작용제의 자극에 대한 응답으로 모니터링 세미 신속한 칼슘 역학 위해 photobleaching 방지하기 위해 최적화해야 이미지가 인물 1B와 C. 더 빨리 획득 속도의 모든 이초을 인수했다 또한 6 가능합니다. staurosporine 관리 후 장기 영상은 인수 사이에 긴 간격 (30) (그림 1 D 및 E)를 함께 인수되었다. </li></ol> 3. 이미지 처리 및 분석 <ol><li> 실험이 완료되면 얻은 이미지는 오프라인 분석하실 수 있습니다. 당신이 칼슘 수준의 변화를 모니터하고자하는 관심 영역 (ROI)을 정의합니다. 필요한 경우 배경을 뺄 분야의 빈 영역 내에서 선택한 투자 수익 (ROI)을 사용합니다. 그것은 mitochondria 꽤 운동성이있는 및 동적 것을 지적하고, 연장 기간 동안 하나의 mitochondrion에을 바탕 이벤트는 항상 그렇지는 않습니다하여야한다. 따라서, 몇몇 세포 유형이 organelle의 높은 운동성을 고려, 투자 수익 (ROI)의 선택은 신중하게 모니터링해야합니다. 또한, 그림 1, 다양한 자극에 heterogeneously mitochondria 대응 입증. 데이터를 오프라인으로 분석하고 프레임으로 프레임 단위로 RO1 배치를 모니터링하는 것이 중요하다. 높은 운동성이있는 mitochondria에 mitochondrial 칼슘을 측정하는 상세한 설명이 다른 일곱 설명되었습니다. </li><li> 투자 수익 (ROI)에서 얻은 비율 측정은 Excel 또는 이와 유사한 graphingsoftware로 가져올 수 있습니다. 데이터는 단일 셀 또는 단일 mitochondrion에서 mitochondrial 칼슘 수준의 변화를 나타내는 성분으로 제시하거나, FL 평균 수여러 투자 수익 (ROI)에서 uorescence 신호. 우리는 또한 파 리간드 8 시까지 유도된 apoptosis를 겪고 lymphocytes의 인구의 평균 mitochondrial 칼슘 수준을 측정하는이 기술을 사용해 왔습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2579/2579fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. ratiometric - pericam - 후지산 (A) Subcellular 지방화. 첫 번째 이미지는 ratiometric - pericam - MT을 표현 라이브 헬라 세포를 보여줍니다. 두 번째 이미지는 mitochondrion - 선택적 염료의 MitoTracker 레드 CMXRos과 형광 염색법을 보여줍니다. 병합된 이미지의 노란색 형광은 ratiometric - pericam - MT 및 MitoTracker의 형광의 공동 지방화를 보여줍니다. (B) pseudocolor 비율 (495:380 NM) 10 MM ATP 취급 MT - ratiometric pericam을 표현하는 4 헬라 세포의 이미지 일련의 . (C) 관심있는 영역 (ROI)에 mitochondrial 칼슘 수준의 변화 부량는 pseudocolor 비율 (495:380 NM) 후지산을 표현 헬라 세포의 이미지 (B) 10 MM ATP 취급. (D) 시리즈에 표시된 - ratiometric pericam 0.5 μm의의 staurosporine과 치료. 개인 mitochondria에있는 칼슘 응답에 이질은 분명뿐만 아니라 60분하여 mitochondria의 중요한 조각이다. 다른 칼슘 수준에서 큰 변화 (노란색 화살표 머리)를 표시하지 않습니다 반면 일부 mitochondria는, 칼슘 (흰색 화살표 머리)에 oscillatory 증가했습니다.와 apoptosis의 유도 후 하나의 헬라 세포의 글로벌 mitochondrial 칼슘 수준 증가 (E) 부량 0.5 μm의의 staurosporine.

<ol><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기 mitochondrial 타겟 ratiometric pericam를 사용하여 mitochondrial 칼슘을 측정하는 매우 간단한 방법을 제시한다. 것처럼 쉽게 허용 신호 대 잡음 비율과 헬라 세포에서 개별 mitochondria를 볼 수 있습니다 없음 deconvolution 표준 위드 광학을 사용하여 그림 1A에 표시됩니다. 공촛점 현미경 또는 기타 전문 장비에 대한 필요성을 obviating 때 자기편 헬라 세포는 문화에 대부분의 세포처럼 크게 버리고 있기 때문입니다. 우리는 폴리 - 리신 코팅 coverslips 8 준수 Jurkat 세포에서 유사한 결과를 발견했다. 염료를 사용하는 방법을 대조적으로, 그것은 비 invasively 같은 ratiometric pericam (그림 1E)로 인코딩된 유전자 칼슘 표시기를 사용하여 시간 mitochondrial 칼슘 수준을 모니터링하는 것도 가능합니다. 세포 죽음 동안 mitochondrial 칼슘을 분석 때 특히 중요합니다. 또한, 그것은 apoptotic 과정에서 분열 / mitochondria의 조각을 시각화하는 것도 가능합니다. 와 같은 인물 1D와 E에 나타난 staurosporine 치료는 20 분 mitochondria있는 봉우리를 선택 subpopulations에서 칼슘 느린 증가됩니다. 칼슘 수준은 다시 이시간 치료 후 다시 올라가기 전에 mitochondrial 조각과 함께 수반하는 내려가. 이것은 Fura - 2 9를 사용하여 측정 staurosporine 처리에 의해 유도된 cytosolic 칼슘 느린 파도와 일치합니다. 따라서, 중요한 운동 정보가있는 정적 측정을 고용하는 방법으로 가능하지 않다 얻을 수 있습니다. 우리가 비율과 그림 1에없는 칼슘 농도를 제시했지만, 그것은 절대 칼슘 레벨 4, 10를 계산하기 위해 현장에서 센서를 보정하는 것이 가능합니다. 고려해야 할 한 가지 중요한 주의해야 할 점은 ratiometric pericam는 산도 4, 10 민감한 때문입니다. 모두 cytosolic 및 mitochondrial 산도 수준은 apoptosis 11 동안 극적으로 변화 수 있듯이, 이것은 중요한 고려 사항이다. 절연 mitochondria 표현 pericam에서 산도의 적정가 입증되는 증가 [H +] 증가 410 nm의에서 여기, 동시에 mitochondrial 칼슘을 모두 측정하는 악용되어 속성에 의해 자극 방출에 약간의 영향으로 495 nm의에서 흥분 pericam의 방출 및 산도 12. 따라서, 선택 410 나노미터 여기와 방출을 모니터링하는 것은 산도에 대한 감소 우려와 비 ratiometrically 모니터 mitochondrial 칼슘하기위한 수단을 제공합니다. 마지막으로, 여기에 제시된 프로토콜은 따라서 대부분의 실험실로이 기술을 이용할 수 있도록, 광범위하게 사용 가능한 필터와 표준 epifluorescent 현미경에 액세스할 수 있어야합니다.

<table><tbody><tr><td>도립 광시야 형광 칼슘 이미징 현미경</td><td>Nikon Instruments</td><td>MEA53310</td><td>380 nm/495 nm 여기 필터와 적절한 롱패스 및 방출 필터가 장착된 모든 도립 광시야 현미경을 본 프로토콜에 쉽게 적용하여 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>이미징 소프트웨어</td><td>Molecular Devices</td><td>Metafluor</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor 세포 챔버</td><td>Invitrogen</td><td>A-7816</td><td>관류가 가능한 도립 현미경용 이미징 챔버라면 무엇이든 적합합니다.</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>대부분의 형질전환 시약 및 프로토콜이 본 연구에 적합합니다.</td></tr><tr><td>MitoTracker Red CMXRos</td><td>Invitrogen</td><td>M7512</td><td></td></tr></tbody></table>

유전자 변형으로 인코딩된 칼슘 센서를 사용하여 apoptosis 동안 mitochondrial 칼슘 레벨에서 동적 변경 사항 모니터링

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

다양한 자극에 대한 응답으로 세포 내 칼슘 농도의 동적 변화는 확산, 분화 및 apoptosis 한 많은 세포 과정을 조절. mitochondria에서 apoptosis, 칼슘 축적하는 동안 프로 apoptotic 요소의 릴리스는 cytosol이에 mitochondria에서 추진하고 있습니다. 직접 apoptosis 동안 현장에서 살아있는 세포에서 mitochondrial 칼슘을 측정하기 위해 관심을 따라서이다. 듀얼 여기 ratiometric 및 비 ratiometric 합성 칼슘 지표 염료와 함께 로드된 세포의 고해상도 형광 이미징은 세포내 칼슘 신호의 다양한 측면을 연구하기위한 신뢰성과 다양한 도구로 입증되었습니다. 이러한 기술을 사용 cytosolic 칼슘 fluxes을 측정하는 것은 비교적 간단합니다. 그러나,로드 &#39;- 2 및로드&#39;- FF로 합성 칼슘 지표를 사용하여 손상 세포 intramitochondrial 칼슘 수준을 측정하는 것은 더욱 어려운 것입니다. mitochondria를 타겟으로 합성 지표 mitochondrial 칼슘 반복 증가에 대한 답변을 무딘하고, mitochondrial 형태학에게 3 중단합니다. 또한, 합성 지표는 장기적인 실험들이 적합하게 몇 시간 동안 mitochondria 밖으로 누설하는 경향이있다. 따라서, mitochondria를 타겟으로하는 녹색 형광 단백질 (GFP) 4 aequorin 5를 기반으로 유전자 인코딩 칼슘 지표는 크게 mitochondrial 칼슘 역학의 측정을 촉진합니다. 여기, 우리는 다른 자극에 대한 응답으로 mitochondrial 칼슘 fluxes의 실시간 측정을위한 간단한 방법을 설명합니다. 방법을 선택 mitochondria을 타겟으로하는 &#39;ratiometric - pericam&#39;의 형광 현미경을 기반으로합니다. Ratiometric pericam는 circularly permuted 노란색 형광 단백질과 calmodulin 4 핵융합 기반으로 칼슘 표시기입니다. 방출 스펙트럼, 봉우리 주변에 515 nm의은 변함이 동안 ratiometric pericam에 칼슘의 바인딩은 415 nm의에 494 nm의 여기로부터 피크의 변화가 발생합니다. Ratiometric pericam는 ~ 1.7 μm의 4 체외에서 상수를 분리하여 하나의 칼슘 이온을 바인딩합니다. ratiometric pericam 이러한 특성 mitochondrial 칼슘 농도에 신속하고 장기적인 변화의 부량을 허용합니다. 또한, 우리는 일반적으로 사용 가능한 필터 세트와 표준 넓은 분야 칼슘 이미징 현미경이 방법의 적응을 설명합니다. 별개의 두 agonists, purinergic 작용제 ATP와 apoptosis - 유도하는 약물 staurosporine을 사용하여, 우리는이 방법은 시간이 초 시간적 해상도 mitochondrial 칼슘 농도의 변화를 모니터링에 적합한 것을 보여줍니다. 또한, 우리는 ratiometric pericam 또한 apoptosis 동안 mitochondrial 분열 / 조각을 측정하는 데 유용 것을 보여줍니다. 따라서 ratiometric pericam은 특히 apoptosis 동안 mitochondrial 칼슘 역학의 지속적인 장기 측정에 가장 적합합니다.

이 프로토콜은 형광 이미징에 의해 mitochondrial 칼슘 fluxes의 실시간 측정을위한 방법을 설명합니다. 이 메서드는 선택 mitochondria로 표현 circularly permutated YFP 기반 듀얼 여기 ratiometric 칼슘 센서 (ratiometric pericam - MT)을 활용합니다.

유전자 변형으로 인코딩된 칼슘 센서를 사용하여 Apoptosis 동안 Mitochondrial 칼슘 레벨에서 동적 변경 사항 모니터링

다양한 자극에 반응하여 나타나는 세포 내 칼슘 농도의 역동적인 변화는 증식과 같은 많은 세포 과정들을 조절합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 세포 내 미토콘드리아 칼슘 농도의 변화를 모니터링하는 것입니다. 이는 먼저 미토콘드리아 기질을 표적으로 하는 칼슘 지시 단백질 ratiometric peram으로 세포를 형질전환하고, 형질전환 1~2일 후에 수행됩니다. 형광 현미경과 소프트웨어는 살아있는 세포 이미징을 위해 설정됩니다.그 후 칼슘 동원 작용제(calcium mobilizing agonist)를 첨가하여 ratio metric peram 발현 세포의 이미지를 획득합니다. 절차의 마지막 단계는 획득한 이미지에 대한 정량 분석입니다. 결과적으로, ratio metric 칼슘 지표 단백질을 발현하는 살아있는 세포의 형광 현미경 관찰을 통해 미토콘드리아 칼슘 농도의 역동적인 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.합성 칼슘 지시자를 사용하여 칼슘 수치를 측정하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 ratio metric peram이 유전적으로 인코딩되어 있어 미토콘드리아나 관심 있는 다른 세포소기관으로 표적화할 수 있다는 점입니다. 안녕하세요, 저는 Dr. Benning 연구실의 박사후 연구원 Dr. Ascar이며, 오늘 실험 절차를 시연하겠습니다. 프로토콜을 시작하기 위해, 전날 밤에 HeLa 세포를 배양합니다. 다음 날 형질전환 시 약 70%의 합치도(confluence)가 되도록 표준 6-웰 배양 플레이트에 놓인 멸균 유리 커버슬립 위에 세포를 분주합니다. 다음 날, 제조업체의 지침에 따라 웰당 4 µg의 metric peram 미토콘드리아 발현 벡터와 0.5 mL의 Opti-MEM에 희석된 10 µL의 Lipofectamine 2000을 사용하여 DNA-Lipofectamine 2000 복합체를 준비합니다.다음으로, 각 웰의 D-M-E-M-F-B-S HELOC 배양 배지를 항생제가 포함되지 않은 동일한 배지 1.5 milliliters로 교체합니다. LIPECTOMY 용액을 DNA 용액에 첨가하고 복합체가 형성된 후 부드럽게 섞습니다. DNA Lipectomy 용액을 트랜스펙션할 각 웰에 한 방울씩 첨가하고, 플레이트를 부드럽게 흔들어 섞은 다음 37 degrees Celsius, 5% carbon dioxide 조건의 세포 배양 인큐베이터에서 4시간 동안 배양합니다.배지를 항생제가 포함된 D-M-E-M-F-B-S로 교체합니다. 핀셋을 사용하여 이미징을 수행하기 전, 세포가 metric peram을 1~2일 동안 발현하도록 둡니다. HELOC 세포가 부착된 커버슬립을 이미징 용액이 담긴 적절한 이미징 챔버에 조심스럽게 넣습니다.이미징 챔버를 도립 현미경 스테이지에 장착합니다. 다음으로, 40배 이상의 오일 침강 렌즈와 380 nm 파장을 사용합니다. 하나 이상의 ratiometric peram을 발현하는 세포가 포함된 관심 영역을 찾기 위해, 여기서는 380 nm를 사용하여 ratiometric 세포를 식별합니다.Peram은 이 파장에서 광퇴색에 더 취약합니다. 관심 영역을 식별한 후, 소프트웨어를 495 및 380 nm에서 이중 여기하도록 설정하십시오. 다음으로, 495 nm와 380 nm에서 번갈아 여기시켜 이미지를 순차적으로 획득하십시오.작동제(agonist)를 처리하기 전, 최소 30초 동안 기저 칼슘 수준의 이미지를 획득합니다. 그 다음, 관류 장치를 통해 칼슘 동원 작동제를 처리하며, 각 작동제 노출 시간의 추가 시점을 기록합니다. 이때 광퇴색(photo bleaching)을 방지하면서도 충분한 시간 분해능을 확보할 수 있도록 노출 시간과 획득 간격을 최적화해야 합니다. 실험이 완료되면, 이미지를 오프라인으로 분석할 수 있습니다.분석을 시작하려면, 필요한 경우 배경 형광을 제거하기 위해 시야 내의 빈 영역에서 관심 영역(region of interest)을 선택하십시오. 다음으로, 관심 영역에서 측정한 495/380 비율 값을 Excel 또는 유사한 그래프 소프트웨어로 내보내십시오. 이 이미지 패널은 ratio metric peram 및 미토콘드리아의 세포 내 국소화를 보여줍니다.왼쪽은 ratiometric Pericam을 발현하는 HeLa 세포의 라이브 셀 이미지입니다. 가운데는 미토콘드리아의 형광 염색과 선택적 염색약인 MitoTracker Red CMXRos의 이미지입니다. 마지막으로 오른쪽의 병합 이미지는 10 µM ATP를 처리하고 미토콘드리아에 ratiometric Pericam을 발현시킨 4개의 HeLa 세포에 대한 495, 380 nm 비율의 의사색(pseudocolor) 이미지 시리즈이며, 이 이미지에는 앞선 4개 세포의 미토콘드리아 칼슘 농도 변화에 대한 정량 분석 결과가 미토콘드리아에 ratiometric Pericam을 발현하는 HeLa 세포 이미지와 함께 표시되어 있습니다.0.5 µM staurosporine 처리 60분 후, 개별 미토콘드리아의 칼슘 반응의 이질성과 더불어 상당한 수준의 미토콘드리아 파편화가 뚜렷하게 나타납니다. 흰색 화살표로 표시된 일부 미토콘드리아는 칼슘의 진동성 증가를 보이는 반면, 노란색 화살표로 표시된 다른 미토콘드리아는 칼슘 수치에 유의미한 변화를 보이지 않습니다. 이 그래프는 0.5 µM staurosporine으로 120분 동안 세포 사멸을 유도한 후, 단일 HeLa 세포 내 전체 미토콘드리아 칼슘 수치의 변화를 보여줍니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 미토콘드리아 매트릭스에 선택적으로 표적화되는 칼슘 매개 단백질인 R geometric peram을 사용하여 다양한 tli에 반응하는 미토콘드리아 칼슘 수준의 동적 변화를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

불후의 N19 - oligodendrocyte 세포 문화에 caspase - 3의 중재 apoptosis의 라이브 세포 이미징의를...

모니터링 죽습 Caspase - 3 활동 및 칼륨 - 유도 막 탈분극 다음 라이브 세포 이미징 및 Cleaveable 형광 염색 기판을 사용하여 불후의 Oligodendroglial 세포의 Apoptosis

이 동영상은 배양된 세포에서 미토콘드리아 칼슘 흡수를 측정하기 위한 컨포칼 현미경 이미징 기반 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 칼슘에 민감한 형광 염료 Rhod-2/AM을 사용하여 투과 배양 세포에서 미토콘드리아 칼슘을 측정합니다.

배양된 세포에서 미토콘드리아 칼슘 흡수를 측정하기 위한 칼슘 유입 분석

샘플 간의 미토콘드리아 막 전위를 비교하면 세포 상태에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있습니다. 형광을 사용하여 미토콘드리아를 분리하고 억제제 및 언커플러에 대한 반응을 평가하기 위한 자세한 단계가 설명되어 있습니다. 이 프로토콜의 방법과 유용성은 세포 배양 및 세포 스트레스의 동물 모델을 사용하여 설명됩니다.

분리 및 배양 세포 및 마우스 조직에서 미토콘드리아의 기능적 분석

소포체 칼슘 항상성은 다양한 병리학에서 파괴됩니다.  분비된 ER 칼슘 모니터링 단백질(SERCaMP) 리포터를 사용하여 ER 칼슘 저장소의 중단을 감지할 수 있습니다.   이 프로토콜은 가우시아 루시페라아제 SERCaMP를 사용하여 ER 칼슘 항상성을 in vitro 및 in vivo에서 검사하는 방법을 설명합니다.

사용 소포체 칼슘 항상성 모니터링<em&gt; Gaussia</em&gt; 루시 페라 제 SERCaMP

미토콘드리아는 그들이 세포질 칼슘을 형성하는 2 + 세포 내 신호 전달 수 (2 + 칼슘)을 칼슘을 격리한다 그들의 내막 (Δ Ψm)에서 전기 잠재력을 활용할 수 있습니다. 우리는 형광 염료 및 공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 동시에 측정 미토콘드리아 칼슘 흡수 및 ΔΨ 분하는 방법을 설명합니다.

형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

이 프로토콜 Ca2 + 보존 용량 및 캘리포니아2 +검사 하는 방법을 설명 하는 것을 목표로-트리거 SH-SY5Y의 고립 된 미토 콘 드리 아의 붓기 미토 콘 드리 아 세포 단계.

미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 보존 용량 분석 결과 및 캘리포니아2 +-미토 콘 드 리아 붓기 분석 결과 발생

여기 선물이 rhodamine 123 미토 콘 드 리아 멤브레인 잠재적인 (MMP)를 식별 하 여 CLIC4 최저 유도 HN4 세포 apoptosis 체 외연구의 응용 프로그램에 대 한 자세한 프로토콜. 일반적인 형광 현미경, 공초점 레이저 스캐닝 형광 현미경 아래는 MMP의 실시간 변화 기록 했다.

CLIC4 최저 유도 HN4 세포 Apoptosis에서 체 외에 미토 콘 드리 아 막 잠재력의 발견

여기, 우리는 고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 유입의 측정에 대 한 두 개의 프로토콜을 제시. 고립 된 미토 콘 드리 아에 대 한 우리는 플레이트 리더 기반 Ca2 + 가져오기 세부 분석 결과 사용 하 여 Ca2 + 민감한 염색 칼슘 그린-5N. 경작된 한 세포에 대 한 우리 confocal 현미경 검사 법 방법 Ca2 + 염료 오전-2/로드를 사용 하 여 설명 합니다.

고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 칼슘 유입의 분석

이 프락토콜은 성상세포와 뉴런에서 생체 외 및 생체 내 미토콘드리아 Ca2+ 이미징을 위한 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다.

유전자 인코딩 된 Ca2 + 지표 (GECIs)를 사용하여 성상 세포와 뉴런에서 이미징 미토콘드리아 Ca2 + 섭취

이 프로토콜은 바이러스에 감염된 인간 장 오가노이드에서 칼슘 이미징을 수행하기 위한 접근 방식을 설명하고 분석에 대한 접근 방식을 제공합니다.

유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용한 바이러스 감염 인간 장 오가노이드 단층의 라이브 칼슘 이미징

학습하세요 유전자 변형 칼슘 센서를 이용한 라이브 세포의 미토콘드리아 칼슘 역학 측정 방법을. ratiometric pericam-mt를 활용한 이 기술은 세포 대사 및 신호 전달 연구에 필수적인 실시간 이미징 데이터를 제공합니다.

유전자 변형으로 인코딩된 칼슘 센서를 사용하여 Apoptosis 동안 Mitochondrial 칼슘 레벨에서 동적 변경 사항 모니터링

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