유전자 변형으로 인코딩된 칼슘 센서를 사용하여 Apoptosis 동안 Mitochondrial 칼슘 레벨에서 동적 변경 사항 모니터링

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 세포 내 미토콘드리아 칼슘 농도의 변화를 모니터링하는 것입니다. 이는 먼저 미토콘드리아 기질을 표적으로 하는 칼슘 지시 단백질 ratiometric peram으로 세포를 형질전환하고, 형질전환 1~2일 후에 수행됩니다. 형광 현미경과 소프트웨어는 살아있는 세포 이미징을 위해 설정됩니다.

그 후 칼슘 동원 작용제(calcium mobilizing agonist)를 첨가하여 ratio metric peram 발현 세포의 이미지를 획득합니다. 절차의 마지막 단계는 획득한 이미지에 대한 정량 분석입니다. 결과적으로, ratio metric 칼슘 지표 단백질을 발현하는 살아있는 세포의 형광 현미경 관찰을 통해 미토콘드리아 칼슘 농도의 역동적인 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

합성 칼슘 지시자를 사용하여 칼슘 수치를 측정하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 ratio metric peram이 유전적으로 인코딩되어 있어 미토콘드리아나 관심 있는 다른 세포소기관으로 표적화할 수 있다는 점입니다. 안녕하세요, 저는 Dr. Benning 연구실의 박사후 연구원 Dr. Ascar이며, 오늘 실험 절차를 시연하겠습니다. 프로토콜을 시작하기 위해, 전날 밤에 HeLa 세포를 배양합니다. 다음 날 형질전환 시 약 70%의 합치도(confluence)가 되도록 표준 6-웰 배양 플레이트에 놓인 멸균 유리 커버슬립 위에 세포를 분주합니다. 다음 날, 제조업체의 지침에 따라 웰당 4 µg의 metric peram 미토콘드리아 발현 벡터와 0.5 mL의 Opti-MEM에 희석된 10 µL의 Lipofectamine 2000을 사용하여 DNA-Lipofectamine 2000 복합체를 준비합니다.

다음으로, 각 웰의 D-M-E-M-F-B-S HELOC 배양 배지를 항생제가 포함되지 않은 동일한 배지 1.5 milliliters로 교체합니다. LIPECTOMY 용액을 DNA 용액에 첨가하고 복합체가 형성된 후 부드럽게 섞습니다. DNA Lipectomy 용액을 트랜스펙션할 각 웰에 한 방울씩 첨가하고, 플레이트를 부드럽게 흔들어 섞은 다음 37 degrees Celsius, 5% carbon dioxide 조건의 세포 배양 인큐베이터에서 4시간 동안 배양합니다.

배지를 항생제가 포함된 D-M-E-M-F-B-S로 교체합니다. 핀셋을 사용하여 이미징을 수행하기 전, 세포가 metric peram을 1~2일 동안 발현하도록 둡니다. HELOC 세포가 부착된 커버슬립을 이미징 용액이 담긴 적절한 이미징 챔버에 조심스럽게 넣습니다.

이미징 챔버를 도립 현미경 스테이지에 장착합니다. 다음으로, 40배 이상의 오일 침강 렌즈와 380 nm 파장을 사용합니다. 하나 이상의 ratiometric peram을 발현하는 세포가 포함된 관심 영역을 찾기 위해, 여기서는 380 nm를 사용하여 ratiometric 세포를 식별합니다.

Peram은 이 파장에서 광퇴색에 더 취약합니다. 관심 영역을 식별한 후, 소프트웨어를 495 및 380 nm에서 이중 여기하도록 설정하십시오. 다음으로, 495 nm와 380 nm에서 번갈아 여기시켜 이미지를 순차적으로 획득하십시오.

작동제(agonist)를 처리하기 전, 최소 30초 동안 기저 칼슘 수준의 이미지를 획득합니다. 그 다음, 관류 장치를 통해 칼슘 동원 작동제를 처리하며, 각 작동제 노출 시간의 추가 시점을 기록합니다. 이때 광퇴색(photo bleaching)을 방지하면서도 충분한 시간 분해능을 확보할 수 있도록 노출 시간과 획득 간격을 최적화해야 합니다. 실험이 완료되면, 이미지를 오프라인으로 분석할 수 있습니다.

분석을 시작하려면, 필요한 경우 배경 형광을 제거하기 위해 시야 내의 빈 영역에서 관심 영역(region of interest)을 선택하십시오. 다음으로, 관심 영역에서 측정한 495/380 비율 값을 Excel 또는 유사한 그래프 소프트웨어로 내보내십시오. 이 이미지 패널은 ratio metric peram 및 미토콘드리아의 세포 내 국소화를 보여줍니다.

왼쪽은 ratiometric Pericam을 발현하는 HeLa 세포의 라이브 셀 이미지입니다. 가운데는 미토콘드리아의 형광 염색과 선택적 염색약인 MitoTracker Red CMXRos의 이미지입니다. 마지막으로 오른쪽의 병합 이미지는 10 µM ATP를 처리하고 미토콘드리아에 ratiometric Pericam을 발현시킨 4개의 HeLa 세포에 대한 495, 380 nm 비율의 의사색(pseudocolor) 이미지 시리즈이며, 이 이미지에는 앞선 4개 세포의 미토콘드리아 칼슘 농도 변화에 대한 정량 분석 결과가 미토콘드리아에 ratiometric Pericam을 발현하는 HeLa 세포 이미지와 함께 표시되어 있습니다.

0.5 µM staurosporine 처리 60분 후, 개별 미토콘드리아의 칼슘 반응의 이질성과 더불어 상당한 수준의 미토콘드리아 파편화가 뚜렷하게 나타납니다. 흰색 화살표로 표시된 일부 미토콘드리아는 칼슘의 진동성 증가를 보이는 반면, 노란색 화살표로 표시된 다른 미토콘드리아는 칼슘 수치에 유의미한 변화를 보이지 않습니다. 이 그래프는 0.5 µM staurosporine으로 120분 동안 세포 사멸을 유도한 후, 단일 HeLa 세포 내 전체 미토콘드리아 칼슘 수치의 변화를 보여줍니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 미토콘드리아 매트릭스에 선택적으로 표적화되는 칼슘 매개 단백질인 R geometric peram을 사용하여 다양한 tli에 반응하는 미토콘드리아 칼슘 수준의 동적 변화를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.