유전자 변형으로 인코딩된 칼슘 센서를 사용하여 Apoptosis 동안 Mitochondrial 칼슘 레벨에서 동적 변경 사항 모니터링

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 세포에서 미토콘드리아 칼슘 농도의 변화를 모니터링하는 것입니다. 이는 먼저 칼슘 지시 단백질 비율 메트릭인 peram으로 세포를 transection하여 이루어지며, 이는 transfection 후 1일 또는 2일 후에 미토콘드리아 기질을 표적으로 합니다. 형광 현미경 및 소프트웨어는 살아있는 세포 이미징을 위해 설정되어 있습니다.

그런 다음 칼슘 동원 작용제(calcium mobilizing agonist)를 첨가하여 세포를 발현하는 비율 미터법 페람(peram)의 이미지를 획득합니다. 절차의 마지막 단계는 획득한 이미지의 정량 분석입니다. 궁극적으로, 비율 메트릭 칼슘 지표 단백질을 발현하는 살아있는 세포의 형광 현미경을 통해 미토콘드리아 칼슘 농도의 동적 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

합성 칼슘 지표를 사용하여 칼슘 수치를 측정하는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 비율 메트릭 페람이 유전적으로 암호화되어 미토콘드리아 또는 기타 관심 기관을 표적으로 삼을 수 있다는 것입니다. 안녕하세요, 저는 Benning 박사 연구실의 박사후 연구원인 Ascar 박사이며, 오늘 절차를 시연할 예정입니다 프로토콜 플레이트 헬로 세포를 시작하기 위해 다음 날 transfection에 약 70%con 유창한 밀도로 표준 6웰 배양 플레이트에 배치된 멸균 유리 커버 슬립에 대한 transfection. 다음날 제조업체의 지침에 따라 4마이크로그램의 미터법 페람 미토콘드리아 발현 벡터와 10마이크로리터의 지방 절제술 2000을 각 웰에 대해 0.5ml의 최적으로 희석하여 DNA Lipectomy 2000 복합체를 준비합니다.

다음으로, 각 웰의 D-M-E-M-F-B-S HELOC 배양 배지를 항생제가 없는 동일한 배지 1.5ml로 교체합니다. DNA 용액에 LIPECTOMY 용액을 첨가하고 복합체가 형성된 후 부드럽게 혼합합니다. 플레이트를 부드럽게 흔들어 형질 주입 혼합할 DNA Lipectomy 용액을 각 웰에 적가하고 배양 후 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 세포 배양 인큐베이터에서 4시간 동안 배양합니다.

항생제가 함유된 D-M-E-M-F-B-S로 미디어를 교체합니다. 세포가 겸자를 사용하여 이미징하기 전에 하루에서 이틀 동안 미터법 페람을 발현하도록 합니다. HELOC 세포가 있는 커버 슬립을 이미징 용액이 있는 적절한 이미징 챔버에 부드럽게 놓습니다.

이미징 챔버를 도립 현미경 스테이지에 장착합니다. 다음으로, 40배 이상의 오일 이멀젼 대물렌즈와 380나노미터의 파장을 사용합니다. 비율 메트릭을 발현하는 하나 이상의 세포를 포함하는 관심 영역을 찾기 위해, 페람 380나노미터가 여기에서 사용되어 세포를 비율 메트릭으로 식별합니다.

Peram은 이 파장에서 광표백에 대한 저항력이 떨어집니다. 관심 영역이 확인되면 495 및 380 나노미터에서 이중 여기를 위한 소프트웨어를 설정합니다. 다음으로, 495 및 380 나노미터에서 번갈아 가며 여기하여 이미지를 순차적으로 획득합니다.

작용제를 적용하기 전에 최소 30초 동안 기준선 칼슘 수치의 이미지를 획득합니다. 그런 다음 풍부한 기구를 통해 칼슘 동원 작용제를 적용하고, 각 작용제에 대한 추가 시간, 노출 시간 및 획득 간격은 충분한 시간 분해능을 허용하면서 광 표백을 방지하기 위해 최적화되어야 합니다. 실험이 완료되면 오프라인에서 이미지를 분석할 수 있습니다.

분석을 시작하려면 필드의 빈 영역 내에서 관심 영역을 선택하여 필요한 경우 배경 형광을 뺍니다. 다음으로, 관심 영역의 4 95 3 80 비율 측정값을 Excel 또는 유사한 그래프 소프트웨어로 내보냅니다. 이 이미지 패널은 비율 메트릭 페람과 미토콘드리아의 세포 내 국소화를 보여줍니다.

왼쪽에는 비율 메트릭 페람(metric peram)을 발현하는 헬로 세포의 살아있는 세포 이미지입니다. 중앙에는 미토콘드리아와 선택적 염료 MIT 추적기 빨간색 CMX Ross의 형광 염색이 있습니다. 마지막으로 오른쪽에 표시된 병합된 이미지는 10마이크로몰 A TP로 처리된 미토콘드리아에서 미터 페람 비율을 나타내는 4개의 헬로 세포의 일련의 유사색 4 95, 3 80 나노미터 비율 이미지이며, 이전 4개 세포의 미토콘드리아 칼슘 수치 변화의 정량화는 미토콘드리아에서 미터 페람 비율을 발현하는 헬라 세포의 이 이미지에 나와 있습니다.

개별 미토콘드리아에서 칼슘 반응의 이질성과 미토콘드리아의 현저한 단편화는 60분간의 0.5 마이크로몰 스토 스포린 처리로 분명합니다. 일부 미토콘드리아는 흰색 화살표로 표시된 칼슘의 진동적 증가를 보이는 반면, 다른 미토콘드리아는 노란색 화살표로 표시된 칼슘 수치의 큰 변화를 보이지 않습니다. 이 그래프는 0.5 마이크로몰 스토 스포린으로 120분 동안 세포사멸을 유도한 후 단일 헬로 세포에서 전체 미토콘드리아 칼슘 수치의 변화를 보여줍니다.

이 비디오를 시청한 후에는 미토콘드리아 기질을 선택적으로 표적으로 하는 칼슘 약용 단백질 R 기하학적 페람을 사용하여 다양한 tli에 대한 반응으로 미토콘드리아 칼슘 수치의 동적 변화를 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.