모니터링 죽습 Caspase - 3 활동 및 칼륨 - 유도 막 탈분극 다음 라이브 세포 이미징 및 Cleaveable 형광 염색 기판을 사용하여 불후의 Oligodendroglial 세포의 Apoptosis

이 절차를 통해 oligo DDR 신경교세포 사멸을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 이는 먼저 세포를 배양한 다음 세포를 살아있는 세포 이미징을 위해 준비함으로써 수행됩니다. 다음 단계는 형광 현미경을 사용하여 세포에 치료를 제공하고 효과를 모니터링하는 것입니다.

마지막 단계는 데이터 분석을 수행하는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 caspase 활성화 fluro 염료의 핵 형광을 모니터링하여 처리 또는 자극 후 세포 집단에서 세포 사멸률을 보여줍니다. 면역 염색과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 여러 시점을 동시에 수집할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 약리학적, 시약 및 다양한 치료에 대한 반응과 같은 세포 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이제 이 방법은 세포 배양 내 사멸에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 뇌 절편을 포함한 생체 외 조직, 유기형 조직과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 고정 조직보다는 살아있는 조직으로 작업하는 데 적응하는 데 어려움을 겪을 것입니다. 이 기술의 시각적 시연은 고정 조직에 비해 살아있는 세포 샘플을 준비하는 데 많은 단계가 있기 때문에 중요합니다. 먼저 세포가 해동되는 동안 섭씨 37도의 수조에서 불멸의 N 19 올리고 droog 신경교세포를 해동합니다.

10cm 배양 접시에 10% FBS와 1% 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 7ml의 고혈당 DMEM을 추가합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 플레이트에 적가적으로 추가하고 페트리 접시를 부드럽게 교반하여 세포를 고르게 분산시킵니다. 섭씨 34도의 5센트 이산화탄소 인큐베이터에서 4시간 후 4시간 동안 세포를 배양합니다.

플레이트에서 매체를 흡입하여 남아 있는 DMSO를 제거합니다. 동결 방지제. 4-7일 동안 자란 후 7ml의 새 배지로 교체하십시오. 세포가 70-80%에 도달하면 Confluence가 배지를 흡인하고 1ml의 물방울을 세포 시트에 피펫으로 주입하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 세포를 다음 종자, 즉 수확된 세포가 0.1 곱하기 10의 밀도에서 밀리리터당 6개의 세포로 이루어진 10cm 조직 배양 접시인 세포를 수확하고 이 접시를 조직 배양 인큐베이터에 놓습니다. 한 번 더 마사지한 후 살아있는 세포 이미징 실험을 위해 세포를 도금할 수 있습니다. 이렇게하려면 이전과 같이 세포를 수확 한 다음 30 마이크로 리터의 세포 현탁액을 제거하고 혈류 세포 분석기를 사용하여 세포를 계수합니다.

다음으로, 멸균 집게를 사용하여 코팅되지 않은 유리 커버 슬립을 놓습니다. 6개의 웰 플레이트의 웰에서 0.1 곱하기 10의 밀도로 웰에 셀을 밀리리터당 6개의 셀에 추가합니다. 2mL의 페놀이 함유 DMEM 고포도당 배지에 10%FBS와 1%페니실린 스트렙토마이신이 보충되어 세포가 섭씨 34도에서 하룻밤 동안 성장하고 5%의 이산화탄소를 섭취한 후 형질주입 전에 세포가 성장할 수 있습니다.

다음날, 100 마이크로 리터의 무혈청 배지 0.5 - 4 마이크로 그램의 정제 된 플라스미드, DNA 및 4 마이크로 리터의 FU gene hd를 결합합니다. 혼합물을 부드럽게 두 번 와류 한 다음 DNA가 실온에서 5 분 동안 복합체가되도록합니다. 배양 시간이 경과한 후 FU gene HD DNA 혼합물을 배양된 세포에 직접 첨가합니다.

접시를 부드럽게 기울여 섞습니다. 그런 다음 처리 또는 실험 전에 섭씨 34도에서 5% 이산화탄소에서 추가로 48시간 동안 세포를 배양합니다. 먼저 LCI Cham light live cell 기기 제어 상자를 켭니다.

이것은 스테이지의 철저한 예열을 보장하기 위해 실험이 시작되기 3 시간 전에 수행되어야합니다. 최소한 실험을 시작하기 1시간 전에 컨트롤 박스를 켜야 합니다. 다음으로, 플로우 후드에서 작업하여 LCI Cham 광 자기 유형 배양 챔버와 겸자에 70% 에탄올을 분사하고 5분 동안 건조시킵니다.

인큐베이터에서 세포를 제거하고 현미경으로 검사하여 건강한지 확인합니다. 세포는 듀란트로 나타나야 하며 유리 덮개 슬립에 수많은 멤브레인 과정으로 잘 퍼져야 합니다. 공정 확장 횟수가 감소하거나 불규칙한 모양의 핵을 가진 세포는 형질주입으로 인해 스트레스를 받을 가능성이 높으며 유동 후드에서 작동하는 추가 실험에 적합하지 않습니다.

6개의 웰 플레이트를 기울이고 집게로 커버 슬립을 제거합니다. 커버 슬립 셀 쪽을 챔버의 바닥 플레이트에 빠르게 놓습니다. 커버 슬립이 건조되지 않도록 하십시오.

다음으로, 배양 챔버의 자기 본체를 부착하고 원래의 6웰 플레이트에서 500마이크로리터의 매체를 커버 슬립 상단에 추가합니다. 배지를 재사용하면 환경 변화로 인해 세포에 가해지는 스트레스의 양이 줄어들고 세포 외 분비 인자를 평가하는 데에도 유용할 수 있습니다. 배지를 추가한 후 배양실에 유리 덮개를 놓고 70%의 김 물티슈 브레이드를 사용하여 커버 슬립 바닥에서 현미경 검사를 방해할 수 있는 잔류 물질을 제거합니다.

배양실을 섭씨 34도, 5% 이산화탄소 인큐베이터에 30분 동안 놓습니다. 이 단계는 챔버 자체가 34도 가열되어 커버 슬립의 이동을 줄이도록합니다. 금속이 예열됨에 따라 다음 단계에서 주변 실내 조명을 가능한 한 낮게 작업해야 합니다.

먼저 Thora는 이전에 실온에서 핵 뷰의 elequa를 준비했습니다. 그런 다음 인큐베이터에서 배양 챔버를 꺼내 현미경의 환경 챔버에 빠르게 배치합니다. 이중 조절기가 있는 5% 사전 혼합 이산화탄소 탱크를 켭니다.

다음으로, 현미경 램프를 약 2.5볼트로 설정하고 노출 시간을 240밀리초로 설정한 상태에서 10배 대물렌즈를 사용합니다. 명시야 현미경을 사용하여 초점을 맞추고 컴퓨터 모니터에서 세포를 시각화합니다. 그런 다음 연동 펌프를 사용하여 느리고 국소적인 관류와 함께 배지 교환을 통해 80밀리몰 농도의 칼륨 이온 또는 기타 세포사멸 유도제를 세포에 추가합니다.

Nuke View 4 88 기질은 세포 배양에서 36시간 동안 지속되는 실험을 위해 안정적입니다. 따라서 이 기간 동안 실험을 수행할 수 있습니다. 먼저 적색 및 녹색 형광 단백질의 형광을 시각화하기 위해 현미경을 설정합니다.

그런 다음 빨간색 채널을 클릭하여 형질주입된 세포를 표시합니다. 여러 개의 transfection된 cell이 있는 약 12개의 프레임을 선택하여 저장하고 이러한 XY 스테이지 포인트를 저장합니다. 현미경이 6분마다 저장된 스테이지 포인트에서 명시야 빨간색 채널과 녹색 채널의 이미지를 캡처하도록 합니다.

중복 또는 삼중 실험에서 여러 XY 포인트를 수집한 후 다른 날에 수행된 별도의 실험에서 데이터를 컴파일하고 서면 프로토콜에 설명된 대로 데이터 분석 및 통계 테스트를 수행하여 CASP 베이의 음성 세포와 CASP 베이의 양성 세포의 비율을 비교합니다. Nuke view 4 88 기질은 N 19 올리고 DDR 신경교세포 배양의 세포사멸 속도 증가를 나타낼 수 있습니다. 세포 외 칼륨 농도가 높은 처리 후, 이러한 기준선 이미지는 10배 대물렌즈를 사용하여 획득되었습니다.

N 19 세포를 RFP로 형질주입하고, 대조 세포를 위한 3마이크로리터 핵 뷰, 4,88 기질, 또는 3마이크로리터 핵 뷰, 4,88 기질 및 80 밀리몰 칼륨으로 처리하였다. 이러한 이미지는 시간이 지남에 따라 세포사멸 세포의 수가 증가하며, 대조군 조건에서 80 밀리몰 칼륨으로 처리한 후 3시간, 6시간 및 9시간 후에 80 밀리몰 칼륨 배양액에 비해 상당한 양의 세포사멸이 관찰되지 않았음을 보여줍니다. 대조 조건에서 관찰된 배경 녹색 신호는 세포외 칼륨이 추가되지 않은 세포사멸을 겪고 있음을 나타냅니다.

12시간 과정은 신경학적 모욕과 관련된 연구에 적합합니다 12시간 후, 칼륨 처리 배양물은 약 45%의 세포 사멸을 보여주었습니다. 대조군 실험에서 12시간 시점까지 세포사멸을 보이는 세포는 거의 없습니다. 다른 상황에서는 실험을 더 오래 실행해야 할 수도 있습니다.

이 그래프는 12시간 실험의 시간 경과에 걸쳐 카스파제 3개의 양성 세포의 증가를 보여줍니다. 이 기술은 한 번 괴롭히면 한 시간 안에 완료할 수 있으며 제대로 수행하면 하룻밤 사이에 데이터를 수집할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 이 절차를 따르는 동안 치료 간에 일관성을 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

면역 염색과 같은 다른 방법을 사용하여 연구된 경로와 관련된 다른 다운스트림 단백질을 살펴볼 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 이미징을 위해 샘플을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 데이터 세트를 획득하고 데이터를 분석합니다.