Name: 모니터링 죽습 Caspase - 3 활동 및 칼륨 - 유도 막 탈분극 다음 라이브 세포 이미징 및 Cleaveable 형광 염색 기판을 사용하여 불후의 Oligodendroglial 세포의 Apoptosis (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 학습하세요 NucView 488 기판을 사용한 실시간 형광 현미경으로 불멸화 N19 올리고덴드로글리아 세포의 카스파제-3 매개 세포사멸을 모니터링하는 방법. 이 기술은 신경과학 및 세포생물학 연구에 활용됩니다.

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이 연구소는 건강 연구의 캐나다 연구소, 자연 과학 및 캐나다 공학 연구 협의회, 캐나다 (MSSC)의 다중 경화증 학회에 의해 지원되었습니다. GSTS는 MSSC에서 박사 학생이기의 수신자했다. 우리는이 원고에 많은 도움이 토론과 의견 박사 조안 Boggs (아픈 어린이, 토론토 병원)에 감사하고 있습니다. 우리는 추가 NucView 488 caspase - 3 그들의 관대한 선물 Biotium에 감사하고 있습니다.

1. 해동 및 Culturing 셀 <ol><li> 장기 액체 질소 상점에서 냉동 불후의 N19 - oligodendroglial 세포의 주식을 얻습니다. </li><li> 37 ° C의 물 목욕에서 세포를 포함 빠져 유리병은 세포 현탁액 완전히 해동되기 전까지. </li><li> 높은 포도당 10 % FBS (태아 소 혈청), 1 % 페니실린 / 10cm 문화 판에 스트렙토 마이신과 보충과 DMEM 7 ML (Dulbecco의 수정된 이글 매체)를 추가합니다. </li><li> 세포 현탁액 판 드롭 현명하고, 부드럽게 선동하고 균일하게 세포를 해산하기 위해 페트리 접시 바위를 추가합니다. </li><li> 34 ° C / 5% CO 2 배양기에서 세포 문화. </li><li> 후 4 시간 cryoprotectant로 사용했다 남아있는 DMSO (디메틸 sulphoxide)를 제거하고 신선한 미디어 (7 ML DMEM 높은 포도당 미디어 10% FBS와 보충, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신)로 대체하는 접시에서 대기음 미디어 . </li></ol> 2. Passaging 셀 <ol><li> 70-80%에서합류는 (4-7일 성장), 세포에서 미디어를 기음. </li><li> 접시에 0.25 %의 트립신 1 ML을 추가합니다. 피펫 트립신은 세포를 (5 분) 분리 수 있습니다. </li><li> 실험 조건 및 통과에 대한 적절한 dilutions 세포 밀도가 아니 그보다 0.1 X 10 6 세포 / ML에서 이후의 실험에 대한 추가 10cm 판을 만듭니다. </li></ol> 참고 : 실험에 사용하기 전에 해동 후 최소 두 번 통과하여 세포를해야합니다. 3. 셀을 계산 및 도금 <ol><li> 라이브 세포 이미징을위한 플레이트 세포하려면 앞에서 설명한 것처럼 trypsinize. </li><li> 세포의 약 30 μL를 제거하고 혈구계를 사용하여 계산합니다. </li><li> 6 접시에 잘 uncoated 유리 coverslip을 놓습니다. 34 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, ° C / 5퍼센트 CO 2와 보충이 ML 페놀없는 DMEM 높은 포도당 미디어 0.1 X 10 6 세포 / ML의 밀도에서 잘하는 세포를 추가합니다. </li><li> 허용34시 (16-20 H) 하룻밤 성장 세포 ° C / 5퍼센트 transfection하기 전에 CO 2. </li></ol> 4. Transfection <ol><li> 100 μL 혈청 프리 미디어, 플라스미드 DNA 및 4 μL FuGENE HD (Roche는)을 정화 0.5-4 μg을 결합합니다. 와동 부드럽게 혼합합니다. </li><li> 간략하게 다시 소용돌이와 실온에서 5 분 DNA 복잡하고, 다음 직접 교양 세포 FuGENE의 HD DNA 혼합물을 추가하실 수 있습니다. 가볍게 섞어 접시를 기울이기. </li><li> 34 ° C / 5% 이전 치료 실험에 CO 2에서 추가 48 H에 대한 문화가 세포. </li></ol> 5. 라이브 세포 이미징에 대비하여 전지 (LCI) <ol><li> 당신이 실험을 시작하려면 전에 LCI Chamlide 라이브 셀 인스 트루먼트 컨트롤 박스에 최소한 1 H를 돌려라. 컨트롤 박스는 또한 온도와 LCI Chamlide 내의 습도를 조절하고, premixed 5% CO 2의 흐름을 조절. </li></ol> 참고 :이하는 것이 좋습니다처음 실험은 전체 단계 34 ° C.에 도달하도록하기 전에 최대 3 H에 컨트롤 상자에 설정 이 단계는 이미징 동안 그 온도가 올라가면서 fluxulation 및 금속 무대의 열팽창으로 인해 초점 드리프트를 줄일 수 있습니다. <ol start="2"><li> 흐름 두건에서 일하는 것은, Chamlide 자석 타입 문화 챔버를 스프레이하고, 핀셋, 70 % 에탄올과 그들이 5 분 건조하실 수 있습니다. </li><li> 인큐베이터에서 세포를 제거하고 그들이 건강한 것을 확인합니다. 그들은 자기편 나타나고 수많은 멤브레인 처리로 유리 coverslip에 잘 확산됩니다. transfection에서 스트레스 아르 세포가 실험에 적합하지 있으며, 프로세스 확장의 감소 번호가되며, 종종 불규칙 모양의 핵이 있습니다. </li><li> 6 잘 플레이트의 기울기 조정 및 족집게로 coverslip을 제거합니다. 신속 문화 챔버의 바닥 접시에 coverslip 셀 측면을 넣으십시오. coverslip가 건조하는 것을 허용하지 않습니다. </li><li> 자기 주를 첨부문화 챔버의 신체와 coverslip의 상단에 원래 6 자 판에서 미디어 500 μL를 추가합니다. 다시 사용하여이 미디어 환경 변화에 의한 세포에 게재 스트레스의 양을 감소되며, 또한 세포외 분비 요소를 평가하는 데 유용할 수 있습니다. </li><li> 문화 챔버에 유리 커버를 놓습니다. </li><li> 현미경 방해 coverslip의 바닥에서 잔여 물질을 제거하는 70 %의 에탄올과 분무 KimWipe를 사용합니다. </li><li> 34 문화 챔버를 놓습니다 ° C / 5퍼센트 CO 2 배양기를 30 분. 이 단계는 챔버 자체가 34 체온이 있는지 확인합니다 ° 금속가 따뜻해 짐에 따라 C coverslip의 이동 줄일 수 있습니다. </li></ol> 6. 현미경 설정 이미지는 사용자 지정 릴레이 렌즈 여러 바퀴의 카트리지 로딩을위한 방출 필터 휠 하우징 (정족수 기술 주식 회사, G와 Leica DMIRE2 거꾸로 현미경을 사용하여 여기에 인수되었습니다uelph에). <ol><li> Brightfield - 램프 2.5 V 및 노출 240 MS 시간으로 설정합니다. </li><li> 적색 형광 단백질 (RFP) - 이득은 200 MS 140에 설정합니다. </li><li> 녹색 형광 단백질 (GFP) - 이득은 500 MS 140에 설정합니다. </li><li> 우리의 현미경은 세포가 사용할 수 빛의 양을 제어하는​​ 대신 회전하는 디스크보다 dimmable 램프가 있습니다. 우리는 최대 램프 강도의 90 %에 조명과 함께 실험을 실행합니다. </li></ol> 7. Apoptosis의 Inducers 및 NucView 488 Caspase - 3 기판과 세포의 치료 <ol><li> 농도는 실험 사이의 일관성 수 있도록 미리 apoptosis의 inducers 큰 주식을 준비하고 aliquots에서 그들을 동결하는 것이 중요합니다. </li><li> NucView 488 기판은 빛을 구분합니다. 알루미늄 포일로 덮여 -20 ° C에서 동결 / 해동 및 보관 튜브를 줄이기 위해 15 μL의 aliquots를 준비합니다. NucV의 노출을 줄이기 위해 가능한 한 낮은 주위 실내 조명와 함께iew 488 기판은 사전의 사용, 조명합니다. </li><li> 세포가 온도 감소에 노출되지 않도록 인큐베이터에서 빨리 문화 챔버를 검색합니다. 현미경의 환경 챔버에 문화 챔버를 삽입하고, 이동의 문화 챔버를 유지하기 위해 클램프를 사용합니다. 이 시점에서 당신은 방 불이 희미도한다. </li><li> 듀얼 레귤레이터와 5퍼센트 premixed CO 2 탱크를 켜십시오. </li><li> 10X 목적 사용, 밝은 필드 현미경을 사용하여 컴퓨터 모니터에 세포를 찾기 위해 집중. 참고 : 당신은 노출 시간을 줄이기 위해 원하는 배율로 목표에서 가장 큰 수치 조리개를 사용하고자합니다. </li><li> 세포 (우리의 경우 80 MM의 칼륨, 또는 100 MM의 글루 탐 산염)로 apoptosis의 inducers을 제공, 다음 방법 중 하나를 사용할 수 있습니다. 우리는 우리의 전형적인 문화 미디어에서 10X 집중으로 해산 KCl을 사용하여, 예를 들어 80 MM의 칼륨의 배달을 사용합니다. <ol><li> 미디어 교환 BY 느리고 지역 재관류 : - 80 MM의 칼륨을 포함하는 새로운 미디어와 문화 챔버의 교환 언론에 연동 펌프를 사용합니다. - 튜브의 한쪽 끝을은 챔버에서 미디어를 제거합니다 10 페놀없는 DMEM에 녹아있는 80 MM의 칼륨의 재고 ML, 그리고 튜브의 다른 쪽 끝을 전달합니다. - 당신은 챔버에 남아있는 미디어 칼륨의 정확한 농도를 가지고 있는지 확인하기 위해 미디어 적어도 10X 교환을 원한다. - 미디어가 교환된 후 챔버에있는 미디어 NucView 488 기판의 3 μL를 추가합니다. 섞어 피펫. </li><li> 80 MM K + 및 NucView 문화 챔버에서 미디어에 488 기판의 직접 외에도 : - 페놀없는 DMEM에 녹아있는 80 MM의 칼륨의 10X 재고 솔루션을 준비합니다. - 10X 80 MM의 칼륨 50 μL에 NucView 488 기판의 3 μL를 추가합니다. 섞어 피펫. 문화 챔버 500 μL 페놀 무료 DMEM에 추가합니다. 참고 :이 방법은당신이 성장하거나 원래의 미디어에 존재있을 수 있습니다 기타 분비 요인을 유지하거나 평가에 관심이있다면 선호. 우리는 NucView 488 기판은만큼 36 반장을 지속 실험을위한 세포 배양에 안정적인 것으로 나타났습니다 </li></ol></li></ol> 8. 라이브 세포 이미징 <ol><li> transfected 세포를 표시하는 빨간색 채널을 클릭합니다. </li><li> 선택하고 여러 transfected 세포가 열 프레임 주위에 저장하고, 이러한 "XY 스테이지 포인트"를 저장합니다. 컴퓨터 메모리의 양에 따라, 당신은 당신이 얻을 수있을 것입 무대 포인트의 수가 제한될 수 있습니다. </li><li> 이러한 저장 단계에서 현미경 캡처 이미지를 (밝은 필드, 빨강 채널과 녹색 채널)이하면 매 6 분 가리 킵니다. </li><li> 실험의 초기 단계 동안 표시되는 모든 녹색 얼룩 가능성이 높습니다 인해 일반적으로 transfection 및 / 또는 환경 스트레스에 이미 apoptosis를 겪고 아르 세포를 나타냅니다. Apopt실험 치료로 인한 osis이 실험에서 나중에 timepoint에 감지됩니다. </li></ol> 9. 통계 분석 <ol><li> 각 실험에 대한, 우리는 큰 데이터 세트를 효율적으로 수집하기 위해 여러 XY 포인트를 얻기위한 현미경을 프로그램입니다. 각 실험은 중복되거나 세중의에 수행되며, 데이터는 다른 요일에 수행 별도의 실험에서 컴파일됩니다. 각 데이터 집합에서, 우리는 전망의 15 분야까지 분석하고 caspase - 긍정 세포 (보기 / caspase - 양성 세포의 총수의 분야에서 세포의 총수)에 caspase - 부정적인 세포의 비율을 비교합니다. </li><li> 각 데이터 집합에서 기록 측정은 큰 샘플 집합으로 그룹화되며, 다음 하나 ANOVA 테이블 (P = 0.05가)를 사용하여 다른 비교됩니다. 우리는 각 실험의 의미 (SEM)의 표준 오류를 표시하고 어를 결정하기 위해 Tukey의 의미 비교 테스트 (P = 0.05이)를 수행하여 의미의 차이를 비교ich 트리 트먼트 서로 크게 다릅니다. </li></ol> 10. 대표 결과 우리는 NucView 488 기판이 높은 세포외 칼륨 농도와 치료를 다음과 N19 - OLG 세포 문화의 apoptosis의 증가 속도를 나타낼 수있는 방법을 설명하기위한 실험을 설명했습니다. N19 - 세포가 RFP와 함께 transfected했고, 중 3 μL NucView 488 기판 (제어), 또는 3 μL NucView 488 기판 80 밀리미터로 취급했다 [K +] (치료). 전지는 감시되었고 이미지는 신경 모욕 (그림 1A)을 포함한 연구에 적합 12 H 시간 코스를 통해 인수했다. 통제 조건에서 우리는 80 MM에 비해 apoptosis의 상당한 양을 관찰 아니 [K +] 12 H (그림 1B) 이후 약 45 %의 세포 죽음을 보여주 대우 문화 (해시 상자). 배경 녹색 신호가 관찰컨트롤 상태에서 D는 세포외 칼륨의 추가없이 apoptosis를 겪고있는 셀을 나타냅니다. 다른 상황에서 실험이 더 이상 실행하는 데 필요한 수 있지만 12 H의 시점에 의해 제어 실험 전시 apoptosis에서 세포의 거의 없음. 이미지는 10 배 목표를 사용하여 인수했다. 바 = 100 μm의. <img alt="그림 1A" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1.jpg"> <img alt="그림 1B" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1b.jpg"> 그림 1. N19 OLG 문화 (A) 12 H 시간 과정 실험 48 H NucView 488 기판 (녹색 채널) 3 μL와 함께 RFP - MBP (적색 채널)를 표현 후 transfection. 문화는 어느 80 mm의 최종 농도로 치료되었다 [K +] (왼쪽 패널) 또는 컨트롤 (오른쪽 패널)로 노 치료. 이미지는 6 분 간격으로 인수했고, 죽습 caspase - 3의 상당 활성화 (녹색 신호)은 관찰 수 있습니다죽습 caspase - 3 세포 (에 의한보기의 분야에서 세포의 총 수를 나누어 계산의 D 80 밀리미터로 치료 문화에 [K +] 제어 실험에 비해 세포 핵 (해시 상자) 이내. (B) 비율 caspase - 양성 세포의 총 수). 조건을 제어에 비해, 우리는 K 12 H.에 의해 + - 치료 다음과 같은 약 45 % 세포 사망을 관찰 sVideo 1. N19 - OLG 문화 12 H 시간 과정 실험 48 H 밝은 필드 이미지와 3 방법과 함께, NucView 488 기판 3 μL (녹색 채널)과 RFP - MBP (적색 채널)를 표현 후 transfection 병합된 이미지, 80 밀리미터와 치료에 따라 [K +]. sVideo 2. N19 - OLG 문화 12 H 시간 과정 실험 48 H NucView 488 기판 3 μL (녹색 채널)과 RFP - MBP (적색 채널)를 표현 후 transfection, 함께 밝은 필드 imag로초밖에와 3 방법 병합 이미지. 아무 치료 문화에 적용되지되었으며 N19 - OLGs가 80 밀리미터로 취급 셀 문화와는 달리 현미경 필드를 통해 마이 그 레이션을 볼 수 있습니다 [K +] (sVideo 1 비교).

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</ol>

저자는 공개할 관심 아무런 충돌이 없습니다.

이 apoptosis 탐지에 사용할 수있는 유일한 형광 제품이 아니지만, NucView 488 기판을 사용하여 몇 가지 중요한 이점이 있습니다. 주요 혜택 중 하나는 대부분의 다른 제품 중 세포 용해 필요하거나 가난한 세포 투과성을 가지고 반면, 실시간으로 살고 세포에서 apoptosis를 수행하는 능력입니다. 다른 혜택은 caspase - 3 인식, 높은 세포 투자율, 낮은 세포 독성과 apoptosis의 진행과 함께 간섭없이 높은 감도를 포함합니다. 기판은 또한 그것이 죽습 때까지 낮은 배경 형광을 가지고 있으며 배경 형광을 제거 핵을갑니다. caspase - 3 인식 순서는 3 부정적인 요금을 포함하고있는 DNA - 바인딩 염색 한 긍정적인 요금이 있습니다. DEVD - NucView 488 분자 따라서 caspase가 활성화되지 않은 세포의 DNA에 대한 염료의 활성화 및 바인딩을 방지 그물 부정적인 요금을 가지고 있습니다. 엄마실험 사이 intaining 일관성이 복제 간의 의미있는 비교를 그릴 수 있도록해야합니다. 그것이 transfection의 속도에 영향을 미치는 등 일관성 유지의 주요 매개 변수 중 하나는, 세포 밀도이다. 높은 transfection 속도를 얻기 불후의 N19 - OLG 세포 배양하면 같은 HELA 또는 HEK293 같은 다른 일반적인 세포 라인보다 더 어렵습니다, 우리의 경험 12, 13, 밀도에 크게 의존합니다. 이러한 세포에 대한 최고의 transfection 효율이 Fugene HD (Roche는)를 취득하고 일반적으로 약 15 %입니다,하지만 구성에 따라 30 % 이상에 도달할 수있다. 주의 세포 계수는 일관성있는 transfection 속도를 얻기에 도움이됩니다. apoptosis의 속도를 측정하는 특히 다른 치료에서 환경 스트레스의 동일한 정도로 세포를 노출하는 것도 중요하다. 특히, 세포 transfection 시약의, 또는 빛의 노출의 양을에 노출되는 동안 시간의 길이는 중요한 환경 vari 있습니다ables 고려하고, 실험을 통해 지속적으로 유지됩니다. 우리의 어플 리케이션을 위해, 우리는 필드 수준의보기의 다수를 수집하는 것은 통계 - 중요한 비교를 만들기 위해 충분히 큰 표본 크기를 제공하는 것으로 나타났습니다 [ibid].

특정 시약 및 장비 표 <table border="1"><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 라이브 세포 NucView 488 Caspase - 3 분석 키트 </td><td> Biotium </td><td> 30,029 </td></tr><tr><td> FuGENE의 HD transfection 시약 </td><td> 호슈 </td><td> 04709705001 </td></tr><tr><td> Dulbecco의 수정된 이글 중간 </td><td> Gibco </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> 0.25 %의 트립신 </td><td> Gibco </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Gibco </td><td> 12483-020 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> # 1.5-25 mm 유리 coverslip </td><td> 워너 인 스트 루먼트 </td><td> 64-0715 </td></tr><tr><td> Chamlide CMB 자기 25mm에 대한 문화 챔버 coverslip </td&gt; <td> 쿼럼 기술 </td><td> CM - B - 40 </td></tr><tr><td> Cellstart 조직 문화 10cm 요리에게 </td><td> VWR </td><td> 82050-576 </td></tr><tr><td> BD 팔콘 6 - 잘 조직 문화 요리 </td><td> VWR </td><td> CA62406 - 161 </td></tr></table>

모니터링 죽습 caspase - 3 활동 및 칼륨 - 유도 막 탈분극 다음 라이브 세포 이미징 및 cleaveable 형광 염색 기판을 사용하여 불후의 oligodendroglial 세포의 apoptosis

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

중추 신경계는 강조하고 궁극적으로의 연결 인구와 기능의 감소로 이어질 수많은 불리한 영향을 미칠 수 신경학적인 모욕의 숫자를 경험할 수 있습니다. 손상된 axons은 차례로, astrocytes와 oligodendrocytes 8, 16을 포함하여 지원 glial 세포에 대한 모욕과 부상을 생산할 수있는 세포외 기질로 칼륨 또는 글루 탐 산염을 포함하여 흥분성의 분자를 릴리스 수 있습니다. 모욕가 지속되면 세포가 잘 설립 신호 전달의 폭포 ​​14 숫자 규제 및 활성화 프로그램 세포 사망 (apoptosis)를 받아야합니다. Apoptosis와 조직 괴사는 외상성 뇌 손상, 뇌성 국소 빈혈과 발작이 끝나면 발생할 수 있습니다. apoptotic 규정의 고전 예제 시스테인 종속 aspartate - 감독 프로 테아제, 또는 caspases의 가족입니다. caspases를 포함한 활성 프로 테아제는 만성 신경에 대한 응답으로 세포의 죽음에 연루되어있다알츠하이머 병, 헌팅턴, 그리고 다중 경화증 4, 14, 3, 11, 7을 포함한 퇴행성 질환. 이 프로토콜에서는 이러한 높은 농도 등 다양한 세포 스트레스에 노출 다음, 불후의 N19 - oligodendrocyte (OLG) 세포 배양 15, 5 caspase - 3 매개 apoptosis의 속도를 측정하는 NucView 488 caspase - 3 기판의 사용을 설명 칼륨 또는 글루 탐 산염. 조건부 - 불후의 N19 - OLG 전지 라인 (O2A의 시조를 대표) 박사는 안소니 Campagnoni (신경 과학에 대한 UCLA 시멜은 연구소) 15, 5로부터 얻은 것입니다, 그리고 이전에 myelin의 유전자 발현과 최고의 신호 전달의 분자 메커니즘을 연구하는 데 사용되었습니다 차별화 (예 : 6, 10) OLG 수 있습니다. 우리는 외인성 myelin 기본 단백질 (MBP)로 transfection에 대하여 강력한 것으로이 세포 라인을 찾았 RFP 또는 GFP (빨간색 또는 녹색 형광 단백질) 13, 중 하나에 융합 구조12. 여기, N19 - OLG 세포 문화는 9 apoptosis 유도하는 세포외 매트릭스에 axonal 누출을 모방 80 MM의 칼륨 염화물 또는 100 MM 나트륨 글루 탐 산염 중 하나와 함께 치료를했다. 우리는 DEVD (ASP - GLU - 발 - ASP) caspase - 3 인식 subunit와 DNA 결합 염료 2를 포함하는 이중 기능성 caspase - 3 기판을 사용. 기판을 신속하게 그것이 세포내 caspase - 3에 의해 죽습니다 세포질로 들어간다. 염료, NucView 488가 발표하고 apoptosis 신호, 488 NM에서 DNA와 fluoresces 녹색 바인딩 위치를 세포 핵을 입력합니다. NucView 488 caspase - 3 기판의 사용은 실시간 1, 10에 살고있는 세포 이미징을 허용합니다. 이 비디오에서는, 우리는 또한 culturing 및 transfection 불후의 N19 - OLG의 세포뿐만 아니라 라이브 세포 이미징 기술을 설명합니다.

불후의 N19 - oligodendrocyte 세포 문화에 caspase - 3의 중재 apoptosis의 라이브 세포 이미징의를 사용하여<em&gt; NucView</em&gt; 488 caspase - 3 기판. 이 기술은 세포 유형과 조직의 다양한 실시간으로 프로그램된 세포 사망 assays에 대해 적용됩니다.

모니터링 죽습 Caspase - 3 활동 및 칼륨 - 유도 막 탈분극 다음 라이브 세포 이미징 및 Cleaveable 형광 염색 기판을 사용하여 불후의 Oligodendroglial 세포의 Apoptosis

중추신경계는 다양한 스트레스와 신경학적 손상을 입을 수 있으며, 이는 결과적으로 ...로 이어지는 수많은 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.

본 절차를 통해 oligo DDR 글리아 세포 사멸을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 우선 세포를 배양한 다음, 살아있는 세포 이미징을 위한 준비 과정을 거칩니다. 그다음 단계로 세포에 처리를 수행하고 형광 현미경을 사용하여 그 효과를 모니터링합니다.마지막 단계는 데이터 분석을 수행하는 것입니다. 최종적으로, caspase 활성화 형광 염료의 핵 형광을 모니터링함으로써 처리 또는 자극 후 세포 집단의 세포 사멸률을 확인할 수 있습니다. 면역 염색과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 여러 시점의 데이터를 동시에 수집할 수 있다는 점입니다.이 방법은 약물, 시약 및 다양한 처리에 대한 반응과 같은 세포 생물학의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이제 이 방법을 통해 세포 배양 내의 사멸에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 또한 뇌 절편을 포함한 ex vivo, 기관형 조직(organotypic tissues)과 같은 다른 시스템에도 적용 가능합니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 고정 조직이 아닌 살아있는 조직을 다루는 방식에 적응하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 고정 조직에 비해 살아있는 세포 샘플을 준비하는 단계가 훨씬 많기 때문에, 이 기술의 시각적 시연이 중요합니다. 먼저, 동결된 immortalized N 19 oligo droog glial cells를 37 °C 항온수조에서 해동합니다.10% FBS와 1% penicillin streptomycin이 첨가된 high glucose DMEM 7 mL를 10 cm 배양 접시에 넣습니다. 그런 다음 세포 현탁액을 접시에 한 방울씩 떨어뜨리고, 페트리 접시를 가볍게 흔들어 세포를 고르게 분산시킵니다. 세포를 5% 이산화탄소 배양기 내 34 °C에서 4시간 동안 배양합니다.남아있는 DMSO 및 동결보호제를 제거하기 위해 플레이트에서 배지를 흡입하여 제거합니다. 4~7일간 배양한 후 7mL의 신선한 배지로 교체합니다. 세포가 70~80%의 합쳐짐(confluence)에 도달하면 배지를 흡입하여 제거하고, 세포 시트 위에 1mL의-drips-를 피펫으로 떨어뜨린 후 실온에서 5분 동안 배양합니다.그 다음 세포를 회수하여 10 centimeter 조직 배양 접시에 0.1 × 10⁶ cells/mL의 밀도로 파종하고, 이 접시를 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. 한 번 더 배양한 후, 세포를 라이브 셀 이미징 실험을 위해 플레이팅할 수 있습니다. 이를 위해 이전과 동일하게 세포를 회수한 다음, 세포 현탁액 30 µL를 취하여 혈구계수기(hemocytometer)를 이용해 세포 수를 측정합니다.다음으로, 멸균 핀셋을 사용하여 코팅되지 않은 유리 커버슬립을 배치합니다. 6-웰 플레이트의 각 웰에 0.1 × 10⁶ cells/mL 밀도로 세포를 분주합니다. 10% FBS와 1% penicillin streptomycin이 첨가된 phenol-free DMEM high glucose 배지 2mL 내에서, transfection 전까지 34 °C, 5% CO₂ 조건으로 세포를 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 100 µL의 무혈청 배지와 0.5~4 µg의 정제된 플라스미드 DNA, 그리고 4 µL의 FUgene HD를 혼합합니다. 혼합물을 가볍게 두 번 볼텍싱한 후, 상온에서 5분 동안 DNA 복합체가 형성되도록 둡니다. 배양 시간이 지나면, FUgene HD-DNA 혼합물을 배양 중인 세포에 직접 첨가합니다.플레이트를 부드럽게 기울여 혼합합니다. 그 다음, 처리 또는 실험 전 34 °C, 5% CO2 조건에서 세포를 48시간 동안 추가로 배양합니다. 먼저 LCI Cham light live cell instrument 제어 박스의 전원을 켭니다.스테이지를 충분히 가열하기 위해 실험 시작 3시간 전에 이 작업을 수행해야 합니다. 최소한 실험 시작 1시간 전에는 컨트롤 박스의 전원을 켜야 합니다. 다음으로, 클린벤치 내에서 LCI Cham light magnetic type 배양 챔버와 포셉에 70% ethanol을 분사하고 5분 동안 건조시킵니다.인큐베이터에서 세포를 꺼내 현미경으로 관찰하여 세포의 상태가 건강한지 확인하십시오. 세포는 유리 커버슬립 위에 잘 퍼져 있어야 하며, 수많은 막 돌기(membrane process)가 있는 건강한 모습이어야 합니다. 돌기 연장 수가 적거나 핵의 모양이 불규칙한 세포는 트랜스펙션으로 인해 스트레스를 받았을 가능성이 높으며, 클린벤치(flow hood)에서 진행하는 후속 실험에 부적합합니다.6-웰 플레이트를 기울이고 핀셋으로 커버슬립을 제거합니다. 커버슬립의 세포가 있는 면이 위로 향하게 하여 챔버의 하단 플레이트에 빠르게 놓습니다. 이때 커버슬립이 마르지 않도록 주의하십시오.다음으로, 배양 챔버의 자성 본체를 부착하고 기존 6-well 플레이트의 배지 500 µL를 커버슬립 상단에 추가합니다. 배지를 재사용하면 환경 변화로 인해 세포에 가해지는 스트레스를 줄일 수 있으며, 세포 외 분비 인자를 평가하는 데에도 유용할 수 있습니다. 배지를 추가한 후 배양 챔버 위에 유리 커버를 덮고, 70% 에탄올을 적신 Kim wipes로 커버슬립 바닥면에서 현미경 관찰을 방해할 수 있는 잔여물을 제거합니다.배양 챔버를 34 °C, 5% carbon dioxide 인큐베이터에 30분 동안 둡니다. 이 단계는 챔버 자체를 34 °C로 가열하여 커버슬립의 이동을 줄이기 위함입니다. 금속이 가열됨에 따라, 다음 단계들을 수행하는 동안 주변 조명을 최대한 낮게 유지해야 합니다.먼저, Thora는 이전에 실온에서 nuke view의 elequa를 준비하였습니다. 그 다음 인큐베이터에서 배양 챔버를 꺼내어 신속하게 현미경의 환경 챔버에 배치합니다. 듀얼 레귤레이터가 장착된 5% 혼합 이산화탄소 탱크를 켭니다.다음으로, 현미경 램프를 약 2.5 V로 설정하고 노출 시간을 240 ms로 맞춘 상태에서 10배 대물렌즈를 사용합니다. 명시야 현미경을 사용하여 컴퓨터 모니터에 세포가 보이도록 초점을 맞춥니다. 그 다음, 연동 펌프를 이용한 느린 국소 관류 방식으로 배지를 교체하여 80 mM 농도의 칼륨 이온 또는 다른 세포 사멸 유도제를 세포에 첨가합니다.nuke view 4 88 기판은 최대 36시간 동안 지속되는 실험을 위한 세포 배양 과정에서 안정적입니다. 따라서 이 시간 동안 실험을 수행할 수 있습니다. 먼저 적색 및 녹색 형광 단백질의 형광을 시각화할 수 있도록 현미경을 설정하십시오.그런 다음 레드 채널을 클릭하여 형질전환된 세포를 표시합니다. 형질전환된 세포가 여러 개 관찰되는 프레임을 약 12개 선택하여 저장하고, 해당 XY 스테이지 좌표를 저장합니다. 저장된 스테이지 좌표에서 6분마다 명시야, 레드 채널 및 그린 채널 이미지를 캡처하도록 현미경을 설정합니다.중복 또는 3회 반복 실험에서 여러 XY 지점을 수집한 후, 서로 다른 날에 수행된 개별 실험의 데이터를 취합하고, 서면 프로토콜에 기술된 대로 데이터 분석 및 통계 검정을 수행하여 CASP bay 음성 세포와 CASP bay 양성 세포의 비율을 비교합니다. Nuke view 4 88 기질은 N 19 oligo DDR 글리아 세포 배양의 아포토시스 속도 증가를 나타낼 수 있습니다. 고농도의 세포 외 칼륨 처리 후, 10배 대물렌즈를 사용하여 이러한 기저 이미지를 획득하였습니다.N 19 세포에 RFP를 형질전환시킨 후, 대조군 세포에는 Nuke View 488 기질 3 µL를 처리하였고, 실험군 세포에는 Nuke View 488 기질 3 µL와 80 mM potassium을 처리하였습니다. 이 이미지들은 80 mM potassium 처리 후 3시간, 6시간, 9시간이 경과함에 따라 세포사멸 세포 수가 증가함을 보여줍니다. 대조군 조건에서는 80 mM potassium 처리 배양군과 비교했을 때 상당한 수준의 세포사멸이 관찰되지 않았습니다. 대조군 조건에서 관찰되는 배경 녹색 신호는 세포 외 potassium의 첨가 없이 세포사멸이 진행 중인 세포들을 나타냅니다.신경계 손상과 관련된 연구에는 12시간의 시간 경과 관찰이 적절합니다. 12시간 후, 칼륨 처리된 배양물에서는 약 45%의 세포 사멸이 나타났습니다. 대조군 실험의 세포들은 12시간 시점에서 거의 세포 사멸(apoptosis)을 보이지 않았습니다. 다만, 다른 상황에서는 실험을 더 오래 진행해야 할 수도 있습니다.이 그래프는 12시간의 실험 과정 동안 caspase three 양성 세포의 증가를 보여줍니다. 숙달되면 이 기법은 1시간 이내에 수행할 수 있으며, 적절히 수행될 경우 하룻밤 사이에 데이터를 수집할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 이후의 처리 과정 간에 일관성을 유지하는 것이 중요합니다.연구 대상 경로에 관여하는 다른 하위 단백질을 관찰하기 위해 면역 염색과 같은 다른 방법들을 사용할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 이미징을 위한 샘플 준비 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 데이터 세트를 획득하고 데이터를 분석하십시오.

monitoring-cleaved-caspase-3-activity-apoptosis-immortalized

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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