미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 보존 용량 분석 결과 및 캘리포니아^{2 +}-미토 콘 드 리아 붓기 분석 결과 발생

이 프로토콜 Ca^{2 +} 보존 용량 및 캘리포니아^{2 +}검사 하는 방법을 설명 하는 것을 목표로-트리거 SH-SY5Y의 고립 된 미토 콘 드리 아의 붓기 미토 콘 드리 아 세포 단계.

이 실험의 전반적인 목표는 칼슘 유도 미토콘드리아 팽창에서 미토콘드리아 칼슘 보유 능력을 측정하는 것입니다. 이 방법은 비정상적인 에너지 대사와 같은 미토콘드리아 기능 장애 연구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 매우 간단하고 효과적이라는 것입니다.

먼저 10cm 세포 배양 접시당 약 300만 개의 SH-SY5Y 세포를 파종합니다. 배지를 제거하고 10cm 세포 배양 접시에 약 1ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 10cm 세포 배양 접시에 얼음처럼 차가운 PBS 1ml를 넣고 부착 세포를 긁어내어 새로운 1.5ml 튜브에 넣습니다.

섭씨 4도에서 10분 동안 800배 G로 원심분리기를 사용합니다. 원심분리 중에 50마이크로리터의 프로테아제 억제제 스톡 용액을 보충한 5ml의 미토콘드리아 분리 완충액을 준비합니다. 상층액을 제거하고 펠릿을 1ml의 미토콘드리아 분리 완충액으로 다시 현탁시킵니다.

1.5ml 튜브를 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 유리 균질기로 부유 세포를 얼음 위에서 수동으로 위아래로 용해합니다. 균질산염을 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 1, 000 번 G에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기를 사용하여 파편을 제거합니다. 원심분리 후 상등액을 새 1.5ml 튜브로 옮기고 이전과 같이 다시 원심분리합니다. 새로운 관으로 상등액을 옮긴 후에, 14, 000 시간 G에 4 섭씨 온도에 15 분 동안 원심분리기.

상층액을 제거하고 미토콘드리아가 포함된 펠릿을 1ml의 미토콘드리아 분리 완충액으로 다시 현탁합니다. 그런 다음 14, 000 번 G 및 섭씨 4도에서 15 분 동안 용액을 원심 분리하여 미토콘드리아를 침전시킵니다. 생성된 미토콘드리아 펠릿은 얼음 위에 보관하고 분석 전에 펠릿 부피에 따라 50-100마이크로리터의 염화칼륨 매체에 다시 현탁해야 합니다.

마지막으로, 5마이크로리터의 미토콘드리아 용액을 사용하여 표준 BCA 분석으로 미토콘드리아 단백질 농도를 측정하고 플레이트 리더를 사용하여 OD562를 측정합니다. 염화칼륨 매체를 준비하고 실험 전에 칼슘 결합 녹색 형광 염료를 최종 농도 0.5 마이크로 몰에 첨가하십시오. 미토콘드리아 칼슘 보유 능력을 측정하려면 먼저 0.5마이크로몰 칼슘 결합 녹색 형광 염료를 포함하는 염화칼륨 매체에 있는 분리된 미토콘드리아를 6개의 웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다.

미토콘드리아와 칼슘 결합 녹색 형광 염료를 1분 동안 주변 조명으로부터 보호되는 6웰 플레이트에 1분 동안 배양합니다. 배양 후 자동 투약 설정을 사용하여 6웰 플레이트의 각 웰에 20밀리몰의 염화칼슘 용액에서 4마이크로리터 분취량을 추가하여 미토콘드리아 단백질 밀리그램당 칼슘 200나노몰을 도입합니다. 형광 분광계를 사용하여 506 나노미터의 여기 파장과 531 나노미터의 방출 파장으로 2분 동안 3초마다 형광 변화를 모니터링합니다.

플레이트는 판독 사이에 3초 동안 600rpm에서 진탕 기능이 있으며 소프트웨어로 제어됩니다. 각 웰에 20밀리몰의 염화칼슘 용액을 4마이크로리터 분취량으로 추가로 추가한 다음 2분 동안 3초마다 형광 변화를 모니터링합니다. 칼슘 유도 미토콘드리아 팽창을 측정하려면 염화칼륨 매체에 있는 1밀리리터의 분리된 미토콘드리아를 6개의 웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다.

그런 다음 미토콘드리아 단백질에 20밀리몰 염화칼슘 수용액 10마이크로리터를 첨가하여 미토콘드리아 팽창을 유발합니다. 소프트웨어로 제어되는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 540나노미터에서 10분 동안 3초마다 흡광도 감소를 기록합니다. 칼슘 유도 미토콘드리아 투과성 전이 공극의 억제제인 봉크레킥(bongkrekic) 또는 칼슘 유도 MPTP 개방의 활성제인 아트랙틸로시드(atractyloside) 및 블랭크 대조군의 미토콘드리아 칼슘 보유 능력의 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다.

봉크레킥 치료에서 용량은 예상대로 아트랙틸로사이드 그룹보다 훨씬 높습니다. 칼슘 유도 미토콘드리아 부종의 봉크레킥(bongkrekic), 아트랙틸로사이드(atractyloside) 및 무치료 대조군의 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다. 540나노미터에서 모니터링된 감소된 흡광도는 미토콘드리아 팽창을 나타냅니다.

결과는 BKA가 MPTP 개방을 억제할 수 있는 반면 ATR은 MPTP 개방을 촉진할 수 있음을 시사합니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 5시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 용액을 얼음 위에 보관해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.