Name: 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 보존 용량 분석 결과 및 캘리포니아2 +-미토 콘 드 리아 붓기 분석 결과 발생 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: 학습하세요 SH-SY5Y 세포에서 미토콘드리아 칼슘 보존 용량과 칼슘 유도 미토콘드리아 팽창을 분석하는 방법을. 이 기술은 미토콘드리아 기능 장애와 세포 에너지 대사 연구에 필수적입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 산동의 뛰어난 과학자 (JQ201421)와 NSFC (81371226)에서 부여의 부여에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

1입니다. 미토 콘 드리 아의 격리
참고: 모든 솔루션 및 장비 0-4 ° C에 precooled와 있어야 얼음에 보관 합니다.
<ol><li>10 cm 세포 배양 접시 당 종자 약 3 x 106 SH SY5Y 셀. 높은 포도 당 Dulbecco에 문화 세포의 10% 태아 둔감 한 혈 청, 페니실린 (100 U/mL)와 글 중간을 수정-스 (100 µ g/mL). 밤새 5% CO2 를 포함 하는 인큐베이터에서 37 ° C에서 유지 합니다. 참고: 107 SH SY5Y 셀 x 적어도 1-2 각 격리 분석 결과 대 한 필요.</li>
	<li>매체를 제거 하 고 세척 약 1 mL 10 cm 세포 배양 접시에 얼음 차가운 PBS의 셀 3 번.</li>
	<li>10 cm 세포 배양 접시에 얼음 차가운 PBS의 새로운 1 mL을 추가 하 고 새로운 1.5 mL 튜브에 부착 세포를 긁어. 4 ° c.에서 10 분 동안 800 x g에서 원심 분리기</li>
	<li>원심 분리, 동안 5 mL 미토 콘 드 리아 절연 버퍼 (250 m m 자당, 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethanesulfonic 산), 10mm KCl, 1.5 m m MgCl2, 1 mM EDTA) protease 억제제 주식의 50 μ 보완 준비 솔루션 (100 x 농도; 1 EDTA 무료 태블릿 ddH2O의 500 µ L에 용 해).</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 미토 콘 드리 아 절연 버퍼의 1 mL와 펠 릿을 resuspend. 30 분 동안 얼음에 1.5 mL 튜브를 품 어.</li>
	<li>Lyse 유리 균질 화기 (15-25 선)와 일시 중단 된 셀 아래로 수동으로 얼음에. 참고: 저기 없는 거품 세포 무 균 다는 것을 확인 하십시오. 현미경에 의해 그대로 셀과 드러난된 핵을 시각적으로 계산 하 고 확인 > 90% 셀 파손 발생 했습니다.</li>
	<li>1.5 mL 튜브 및 (핵 및 나머지 그대로 셀) 파편을 제거 하 4 ° C에서 5 분 동안 1000 x g에서 원심 분리기에는 homogenate를 전송 합니다.</li>
	<li>새로운 1.5 mL 튜브를 5 분 동안 1000 x g에서 원심 분리기에는 상쾌한 전송 4 ° c.</li>
	<li>새로운 튜브와 15 분 동안 14000 x g에서 원심 분리기에는 상쾌한 전송 4 ° c.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 미토 콘 드리 아 절연 버퍼의 1 mL와 함께 미토 콘 드리 아를 포함 하는 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>침전은 미토 콘 드리 아를 14000 x g 4 ° C에서 15 분에 대 한 솔루션을 원심.</li>
	<li>결과 미토 콘 드리 아 펠 릿 얼음에 보관 되어야 하며 50-100 μ KCl 미디어 (125 m KCl m, 2 m m K2HPO41 m m MgCl2, 20 mM HEPES, 5mm 조미료, 5mm malate, 및 2 μ M로 테 논, pH 7.4) 어떤 엉덩이 전에 펠 릿 볼륨에 따라 resuspended 불안.</li>
	<li>미토 콘 드 리아 솔루션의 5 μ를 사용 하 여 표준 BCA 분석 결과, OD562를 측정 하 여 미토 콘 드리 아 단백질 농도 측정 하는 플레이트 리더13를 사용 하 여.</li>
</ol>2. 미토 콘 드리 아 캘리포니아2 + 보존 용량 결정
<ol><li>KCl 미디어를 준비 하 고 추가 Ca2 +-실험 전에 0.5 μ M의 최종 농도에 녹색 형광 염료를 바인딩.</li>
	<li>고립 된 미토 콘 드리 아 (0.4 mg/mL)에 포함 된 0.5 μ M Ca2 +KCl 미디어의 1 mL를 전송-각 6 잘 플레이트에 녹색 형광 염료를 잘 바인딩.</li>
	<li>품 어는 미토 콘 드리 아 및 캘리포니아2 +-20 mM CaCl2 솔루션 (20 m m CaCl2, 127 m m KCl, 1 mM MgCl2 의 1 분 추가 4 μ aliquots에 대 한 주위 빛에서 보호 하는 실 온에서 6 잘 플레이트에서 녹색 형광 염료를 바인딩 20 mM HEPES, 5mm 조미료, 5mm malate, pH 7.4) 각 6-잘 접시에 잘 사용 하 여 자동 분배 200 nmol Ca2 +/mg 미토 콘 드리 아 단백질을 소개 하는 설정.</li>
	<li>모든 3 형광 변화를 모니터링 하는 형광 분석기 사용 506의 여기 파장을 2 분에 대 한 s 및 531의 방출 파장 nm. 접시 3 600 rpm에서 떨고 갖춘 소프트웨어 (그림 1)에 의해 제어 신호 사이 s.</li>
	<li>각 영역 20 mM CaCl2 솔루션의 추가 4 μ 약 수를 추가 하 고 모든 3 형광 변화를 모니터링 형광 시간 증가 될 때까지이 단계를 반복 하는 2 분에 대 한 s. 참고: 미토 콘 드리 아와 추가 Ca2 + 증가 기록 형광으로 표시도 전했다. mPTP가 열리면 형광 시간이 증가 합니다.</li>
	<li>캘리포니아2 + 는 mPTP Ca2 + 보존 용량으로 열릴 때까지 추가의 총 금액을 해석 합니다.</li>
</ol>3. 결정의 캘리포니아 2 +-미토 콘 드 리아 붓기를 유발
<ol><li>실험 전에 KCl 미디어를 준비 합니다.<ol>
<li>잘 각 6 잘 플레이트에 KCl 미디어에서 고립 된 미토 콘 드리 아 (0.4 mg/mL)의 1 mL를 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미토 콘 드 리아 붓기 하 미토 콘 드리 아 단백질으로 10 μ의 20mm CaCl2 수성 해결책 (500 nmol/mg 미토 콘 드리 아 단백질)를 추가 합니다.</li>
	<li>540에 흡 광도 감소를 기록 nm 매 3 10 분 (그림 2)에 대 한 소프트웨어에 의해 제어 microplate 리더에 s. 형광 변화 미토 콘 드리 아 내 막에 걸쳐 용액의 유입에 의해 발생 합니다. 참고: 540에서 감소 흡 광도 nm 부 미토 콘 드리 아에 해당. 독자 흡 광도 감소 관찰 되지 않는 경우는 더 긴 간격 읽거나 독서 시간을 채택 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Rossi, C. S., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+respiratory+stimulation%2C+accumulation+of+Ca%2B%2B+and+phosphate%2C+and+oxidative+phosphorylation+in+rat+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).</li>
<li>Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+transport%3A+mechanisms+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions.</a> Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).</li>
<li>Crofts, A. R., Chappell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Ion+Accumulation+and+Volume+Changes+of+Isolated+Liver+Mitochondria.+Reversal+of+Calcium+Ion-Induced+Swelling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling.</a> Biochem J. 95, 387-392 (1965).</li>
<li>Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+ions+in+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Calcium ions in neuronal degeneration.</a> IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).</li>
<li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+calcium+and+cell+death%3A+a+deadly+triad+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).</li>
<li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li>
<li>Rajdev, S., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+green-5N%2C+a+novel+fluorescent+probe+for+monitoring+high+intracellular+free+Ca2%2B+concentrations+associated+with+glutamate+excitotoxicity+in+cultured+rat+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons.</a> Neurosci Lett. 162 (1-2), 149-152 (1993).</li>
<li>Stout, A. K., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+calcium+indicators+underestimate+increases+in+intracellular+calcium+concentrations+associated+with+excitotoxic+glutamate+stimulations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations.</a> Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).</li>
<li>Bambrick, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporin+A+increases+mitochondrial+calcium+uptake+capacity+in+cortical+astrocytes+but+not+cerebellar+granule+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons.</a> J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).</li>
<li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-permeable+peptide+antioxidants+targeted+to+inner+mitochondrial+membrane+inhibit+mitochondrial+swelling%2C+oxidative+cell+death%2C+and+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury.</a> J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).</li>
<li>Muriel, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+free+calcium+levels+%28Rhod-2+fluorescence%29+and+ultrastructural+alterations+in+neuronally+differentiated+PC12+cells+during+ceramide-dependent+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death.</a> J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).</li>
<li>Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Azotobacter+vinelandii+with+correlation+of+Coulter+cell+size%2C+flow+cytometric+parameters%2C+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure.</a> Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).</li>
<li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay%3A+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).</li>
<li>Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+permeability+transition+pore%2C+a+voltage-dependent+mitochondrial+channel+inhibited+by+cyclosporin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A.</a> Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).</li>
<li>Pastorino, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+consequences+of+the+sustained+or+transient+activation+by+Bax+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore.</a> J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).</li>
<li>Gunter, T. E., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+possible+functions+of+mitochondrial+Ca%282%2B%29+transport+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).</li>
</ol>

X. 태양 실험을 감독. 웨이 리는 실험을 수행. 첸 장 및 X. 태양 종이 썼다.

여기, 우리는 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 보존 용량 분석 결과 및 캘리포니아2 +에 대 한 간단 하 고 효과적인 프로토콜을 설명-미토 콘 드 리아 붓기 분석 결과 유발.
미토 콘 드리 아 격리에 대 한 모든 자료와 튜브는 얼음, 특히 때 세포 조직 확인 하십시오. 37 ° c.에 5 분 동안 접시에서 세포를 분리 하 0.25% trypsin EDTA는 사용할 수 있습니다. 후에 15-25 선, 그것은 그대로 세포 막 현미경을 관찰 하 고 미토 콘 드리 아 막의 파손을 방지 하는 데 필요한. 그러나, 우리는 고립 된 미토 콘 드리 아 원유 미토 콘 드리 아 및 순화 된 미토 콘 드리 아 1.0 M 통해 얻어질 수 있다 / 1.5M 불연속 자당 기온 변화도. 살아있는 세포에서 미토 콘 드리 아의 생물 학적 특성은 미토 콘 드리 아를 포위 하는 중간 구성 요소의 농도 때문에 그 비보에 보다 고립 된 미토 콘 드리 아에 같은...

미토 콘 드리 아 ATP 산화 인 산화에 의해 포유류 세포에서 사용의 거의 95%를 생산 주요 세포 기관 이다. 그것은 그의 캘리포니아2 + 미토 콘 드리 아에 의해 분리 된 micromolar 집중, ADP와 무기 인산 염의 존재를 사용할 수 있는 합성 ATP1ADP phosphorylate 보고. Cytosolic 캘리포니아2 + 의 농도 임계값 이상 되 면 미토 콘 드리 아 수 이해 캘리포니아2 + 급속 하 게 경과 하 고 그것은 천천히. 따라서, 작동 미토 콘 드리 아 수 유입 증가 cytosolic 캘리포니아2 +. 없는 산화 인 산화에 참여 하는 미토 콘 드 리아 Ca2 + 또한 cytosolic 칼슘 신호에 참여 및 미토 콘 드리 아 내에는 mPTP의 개방을 유도 하 여 미토 콘 드 리아 apoptotic 메커니즘을 활성화 막2. 그것은 널리 인정 되었습니다 세포내 캘리포니아2 + 의 비정상적인 상승 mPTP3여 미토 콘 드리 아 대규모 붓기를 일으킬 수 있다. 따라서,이 프로토콜 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 보존 용량 및 캘리포니아2 +측정 하 여 미토 콘 드리 아 기능을 평가 하는 것을 목표로-유혹 trigged 미토 콘 드 리아 붓기.
캘리포니아2 + 보존 용량 글귀 cytosolic 칼슘을 미토 콘 드리 아의 능력의 측정입니다. 미토 콘 드리 아 무료 cytosolic 칼슘을 버퍼링 하 고 비활성 침전의 형태로 칼슘 통풍 관에 의해 칼슘-의존 세포질 과정을 조절 수 있습니다. 장애인된 캘리포니아2 + 보존 용량 에너지 제한 및 심지어 neurodegenerative 질병4,5와 관련 된 스트레스 현상에서 발생 합니다. 고립 된 미토 콘 드리 아 또는 셀 digitonin permeabilized Ca2 + 보존 용량, 식별 하는 데 수 고 축적 캘리포니아2 + 추가 조미료와 malate 고립 된 미토 콘 드리 아에 의해 상승 된 능력에 의해 영향을 받지는 합니다 미토 콘 드리 아 격리 절차6. 적정 한 양의 digitonin 플라즈마 막 종류의 다른 세포를 permeabilize를 사용 해야 합니다. 캘리포니아2 +의 hexapotassium 소금-녹색 형광 염료, 캘리포니아2 +바인딩-민감한 셀 impermeant 표시 빛 고르기 표시기, 널리7되었습니다. 캘리포니아2 +-(5 분) stimulations8연장 바인딩 녹색 형광 성 염료는 낮은 선호도 표시기 이며 무료 세포내 캘리포니아2 + 농도 동안 상승 계속 표시 하는 데 사용. 이 방법은 방사성 필터 기법 보다 덜 민감한 하지만 매우 간단 하 게 했다. 추가 Ca2 + 칼슘 녹색 형광을 끌어올리고 고 미토 콘 드리 아에 의해 Ca2 + 통풍 관 기준선에 형광을 반환 합니다. 캘리포니아2 + 의 순차적 추가 mitochondria 통풍 관 extramitochondrial Ca2 + 9실패까지 했다. 형광 microplate 리더는 지속적으로 칼슘 녹색 형광을 보고 사용할 수 있습니다.
캘리포니아2 + 축적, 후 미토 콘 드리 아 depolarized, 캘리포니아2 + , 매체에 발표 고 팽창 하기 시작 했다. 캘리포니아2 +-트리거 미토 콘 드리 아 붓기 mPTP 개방을 나타내는 데 사용 됩니다. 전자 현미경 및 측정 캘리포니아2 +데 540 nm 수에 빛 흡 광도 감소-미토 콘 드 리아 붓기10,11을 실행. 앞으로 각 산란12, 흡수도 감소 미토 콘 드 리아 매트릭스의 수동 붓기를 반영 미토 콘 드리 아 볼륨을 직접 확인할 수 있습니다.
여기, 우리는 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 보존 용량 및 캘리포니아2 +검사 방법론 설명-SH-SY5Y 세포에서 고립 된 미토 콘 드리 아에서 미토 콘 드리 아 붓기를 트리거.

<table><tbody><tr><td>SH-SY5Y 세포주</td><td>ATCC (The Global Bioresource Center)</td><td>ATCC 번호: CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Calcium green-5N</td><td>Life Technologies</td><td>c-3737</td><td>Ca2+-binding green fluorescent dye</td></tr><tr><td>complete protease inhibitors</td><td>Roche Molecular Biochemicals</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>glass homogenizer</td><td>Kimble Chase</td><td>9885303002</td><td></td></tr><tr><td>글루타메이트</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>, RES5063G-A7</td><td></td></tr>, <tr><td>말레이트</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>46940-U</td><td></td></tr><tr>,<td>로테논</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>R8875</td><td></td></tr>, <tr><td>HEPES,</td><td>시그마-알드리치</td>, <td>H3375</td><td></td></tr>, <tr><td>MgCl2</td><td>시그마-알드리치</td>, <td>00457</td><td></td></tr>, <tr><td>K2HPO4</td><td>시그마-알드리치</td><td>V900050</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>시그마-알드리치</td><td>V900266</td><td></td></tr><tr><td>바리오스칸 플래시 기기</td><td>Thermo Scientific</td><td>IC100E</td><td></td></tr><tr><td>봉크레케이트</td><td>바이오비전</td><td>1820-100</td><td></td></tr><tr><td>아트랙틸로사이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>C4992</td><td></td></tr><tr><td>고포도당 둘베코' s 변형 이글 배지</td><td>Hyclone</td><td>SH30022</td><td>4.5 g/L 포도당, L-글루타민, 피루브산 나트륨 없이</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Hyclone</td><td>SV30087</td><td></td></tr><tr><td>페니실린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>스트렙토마이신</td><td>Invitrogen</td><td>11860-038</td><td></td></tr><tr><td>BCA 분석 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>NCI3225CH</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>10cm 세포 배양 접시</td><td>NEST</td><td>704001</td><td></td></tr></tbody></table>

미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 보존 용량 분석 결과 및 캘리포니아2 +-미토 콘 드 리아 붓기 분석 결과 발생

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

산화 인 산화에 의해 ATP의 생산은 미토 콘 드리 아의 주 기능은 이다. 더 높은 진핵생물의 미토 콘 드리 아도 참여할 cytosolic 캘리포니아2 + 버퍼링, 그리고 미토 콘 드리 아에서 ATP 생산 intramitochondrial 무료 캘리포니아2 + 농도 의해 중재 될 수 있다. 캘리포니아2 + 보존 용량 미토 콘 드 리아 매트릭스에 칼슘을 유지 하는 미토 콘 드리 아의 기능으로 간주 될 수 있습니다. 축적 된 세포내 캘리포니아2 + 리드 안 미토 콘 드리 아 막의 침투성을 미토 콘 드리 아 침투성 전환 기 공 (mPTP)는 분자와 분자의 유출에는 리드 무게 1.5 kDa의 개통 되 나. 캘리포니아2 +-트리거 미토 콘 드리 아 붓기 mPTP 개방을 나타내는 데 사용 됩니다. 여기, 우리가 설명 하는 Ca2 + 보존 용량 및 캘리포니아2 +검사를 두 분석-고립 된 미토 콘 드리 아에서 미토 콘 드리 아 붓기를 트리거. 특정 양의 캘리포니아2 + 추가 후 모든 단계는 하루에 완료 고 microplate 리더에 의해 기록 될 수 있습니다. 따라서,이 두 가지 간단 하 고 효과적인 분석 평가 Ca2 +채택 될 수-미토 콘 드 리아 기능 관련.

캘리포니아2 + 보존 용량의 대표 결과: 결과 형광 값으로 표현 되었다. 캘리포니아2 + (200 nmols/mg 미토 콘 드리 아 단백질)의 더블 mPTP 오프닝 베이스 위에 증가 하는 형광의 추가 펄스와. 5 μ M Bongkrekate (BKA), 캘리포니아2 +의 억제제-mPTP 개방, 또는 1 μ M atractyloside (ATR), 캘리포니아2 +의 활성 유도-mPTP 개방을 유도, 고립 된 미토 콘 드리 아에 추가 되었다. 양의 총 추가 Ca2 + mPTP 개방 기준 형광 위에 이중 증가 의해 표시 될 때까지 캘리포니아2 + 보존 용량으로 해석 되었다. 우리의 데이터는 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 보존 용량 BKA 치료에 ATR 그룹에서 보다 훨씬 높은 것 나타났다. 이러한 데이터는 미토 콘 ...

이 프로토콜 Ca2 + 보존 용량 및 캘리포니아2 +검사 하는 방법을 설명 하는 것을 목표로-트리거 SH-SY5Y의 고립 된 미토 콘 드리 아의 붓기 미토 콘 드리 아 세포 단계.

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

이 실험의 전반적인 목적은 칼슘으로 유도된 미토콘드리아 팽창 과정에서 미토콘드리아 칼슘 보유 능력을 결정하는 것입니다. 이 방법은 비정상적인 에너지 대사와 같은 미토콘드리아 기능 장애 연구의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 매우 간단하고 효과적이라는 점입니다.먼저, 10 cm 세포 배양 접시당 약 300만 개의 SH-SY5Y 세포를 분주합니다. 배지를 제거하고 10 cm 세포 배양 접시 내의 세포를 약 1 mL의 ice cold PBS로 3회 세척합니다. 10 cm 세포 배양 접시에 ice cold PBS 1 mL를 넣고, 부착된 세포를 긁어내어 새로운 1.5 mL 튜브에 옮깁니다.4°C에서 800 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리하는 동안 50 µL의 프로테아제 억제제 스톡 솔루션을 첨가하여 5 mL의 미토콘드리아 분리 버퍼를 준비합니다. 상층액을 제거하고 펠렛을 1 mL의 미토콘드리아 분리 버퍼로 재현탁합니다.1.5 milliliter 튜브를 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음, 유리 균질기를 사용하여 얼음 위에서 수동으로 상하로 움직여 부유 세포를 용해합니다. 균질화물을 1.5 milliliter 튜브로 옮깁니다.그 다음, 4°C에서 1,000 ×g로 5분 동안 원심분리하여 부유물을 제거합니다. 원심분리 후, 상층액을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮긴 뒤 이전과 동일하게 다시 원심분리합니다. 상층액을 새 튜브로 옮긴 후, 4°C에서 14,000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다.상층액을 제거하고 미토콘드리아가 포함된 펠릿을 1 mL의 미토콘드리아 분리 완충액으로 재현탁합니다. 그런 다음 14,000 ×g, 4 °C에서 15분 동안 원심분리하여 미토콘드리아를 침전시킵니다. 생성된 미토콘드리아 펠릿은 얼음 위에 보관해야 하며, 분석 전 펠릿의 부피에 따라 50~100 µL의 염화칼륨 배지에 재현탁합니다.마지막으로, 5 µL의 미토콘드리아 용액을 사용하여 표준 BCA 분석법으로 미토콘드리아 단백질 농도를 측정하며, 플레이트 리더를 이용해 OD562를 측정합니다. 염화칼륨 배지를 준비하고, 실험 전 칼슘 결합 녹색 형광 염료를 최종 농도 0.5 µM이 되도록 첨가합니다. 미토콘드리아 칼슘 보유 능력을 결정하기 위해, 먼저 0.5 µM 칼슘 결합 녹색 형광 염료가 포함된 염화칼륨 배지 내의 분리된 미토콘드리아 1 mL를 6-웰 플레이트의 각 웰에 옮깁니다.미토콘드리아와 칼슘 결합 녹색 형광 염료를 6-웰 플레이트에 넣고, 주변 빛을 차단한 상태에서 실온에서 1분 동안 배양합니다. 배양 후, 자동 분주 설정을 사용하여 20 millimolar 염화칼슘 용액 4 µL를 6-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하여 미토콘드리아 단백질 1 mg당 200 nanomole의 칼슘이 도입되도록 합니다. 형광 분광 광도계를 사용하여 여기 파장 506 nanometer, 방출 파장 531 nanometer 조건에서 2분 동안 3초 간격으로 형광 변화를 모니터링합니다.플레이트는 소프트웨어에 의해 제어되며, 판독 사이에 600 rpm으로 3초간 흔들어주는 기능이 갖춰져 있습니다. 각 웰에 20 mM 염화칼슘 용액 4 µL를 추가로 분주한 다음, 2분 동안 3초 간격으로 형광 변화를 모니터링합니다. 칼슘으로 유도된 미토콘드리아 팽창을 측정하기 위해, 염화칼륨 배지에 분리된 미토콘드리아 1 mL를 6-웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다.그 다음, 미토콘드리아 팽창을 유도하기 위해 미토콘드리아 단백질에 20 millimolar 염화칼슘 수용액 10 microliters를 첨가합니다. 소프트웨어로 제어되는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 540 nanometers에서 10분 동안 3초 간격으로 흡광도 감소치를 기록합니다. 칼슘 유도 미토콘드리아 투과성 전이공(MPTP) 개방 억제제인 bongkrekic, 칼슘 유도 MPTP 개방 활성제인 atractyloside 및 공시험 대조군의 미토콘드리아 칼슘 보유 능력을 나타내는 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다.예상한 바와 같이, bongkrekic 처리군의 용량은 atractyloside 군보다 훨씬 높습니다. bongkrekic, atractyloside 및 무처리 대조군의 칼슘 유도 미토콘드리아 팽창에 대한 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 540 nanometers에서 측정된 흡광도의 감소는 미토콘드리아의 팽창을 나타냅니다.결과는 BKA가 MPTP 개방을 억제할 수 있는 반면, ATR은 MPTP 개방을 촉진할 수 있음을 시사합니다. 숙련된 경우, 이 기술을 적절하게 수행한다면 5시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 용액을 얼음 위에 보관하는 것이 중요합니다.

mitochondrial-ca2-retention-capacity-assay-ca2-triggered

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 형광 이미징에 의해 mitochondrial 칼슘 fluxes의 실시간 측정을위한 방법을 설명합니다. 이 메서드는 선택 mitochondria로 표현 circularly permutated YFP 기반 듀얼 여기 ratiometric 칼슘 센서 (ratiometric pericam - MT)을 활용합니다.

유전자 변형으로 인코딩된 칼슘 센서를 사용하여 Apoptosis 동안 Mitochondrial 칼슘 레벨에서 동적 변경 사항 모니터링

미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 mitochondrial 투과 전환 기공 개구의 측정을위한 spectrofluorometric 프로토콜이 여기에 제공됩니다. 검정은 미토콘드리아 칼슘의 동시 측정을...

미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 투과율 전환 기공 영업의 다중 매개 변수 측정

이 비디오는 분리된 미토콘드리아에서 미토콘드리아 칼슘 흡수를 측정하기 위한 플레이트 리더 기반 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 칼슘에 민감한 형광 염료의 형광 신호를 분석하여 미토콘드리아 칼슘 흡수 및 칼슘 과부하의 역학을 연구합니다.

미토콘드리아 칼슘 흡수 분석법: 분리된 미토콘드리아에서 칼슘 흡수를 측정하기 위한 플레이트 리더 기반 방법

이 동영상은 배양된 세포에서 미토콘드리아 칼슘 흡수를 측정하기 위한 컨포칼 현미경 이미징 기반 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 칼슘에 민감한 형광 염료 Rhod-2/AM을 사용하여 투과 배양 세포에서 미토콘드리아 칼슘을 측정합니다.

배양된 세포에서 미토콘드리아 칼슘 흡수를 측정하기 위한 칼슘 유입 분석

이 동영상은 미토콘드리아가 칼슘을 흡수함에 따라 형광의 실시간 변화를 모니터링하여 미토콘드리아 칼슘 보유 능력을 평가하는 절차를 보여줍니다. 이 분석은 미토콘드리아 기능 및 세포사멸 및 신경퇴행성 질환을 포함한 칼슘 관련 과정을 연구하는 데 유용합니다.

분리된 미토콘드리아의 칼슘 보유 능력의 결정

미토콘드리아는 그들이 세포질 칼슘을 형성하는 2 + 세포 내 신호 전달 수 (2 + 칼슘)을 칼슘을 격리한다 그들의 내막 (Δ Ψm)에서 전기 잠재력을 활용할 수 있습니다. 우리는 형광 염료 및 공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 동시에 측정 미토콘드리아 칼슘 흡수 및 ΔΨ 분하는 방법을 설명합니다.

형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

여기, 우리는 고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 유입의 측정에 대 한 두 개의 프로토콜을 제시. 고립 된 미토 콘 드리 아에 대 한 우리는 플레이트 리더 기반 Ca2 + 가져오기 세부 분석 결과 사용 하 여 Ca2 + 민감한 염색 칼슘 그린-5N. 경작된 한 세포에 대 한 우리 confocal 현미경 검사 법 방법 Ca2 + 염료 오전-2/로드를 사용 하 여 설명 합니다.

고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 칼슘 유입의 분석

이 작품에서는, 우리는 마이크로 플레이트 기지를 둔 호흡측정과 조합하여 재조합 퍼프렌고리신 O를 사용하여 미토콘드리아 호흡 기질 플럭스를 시험하기 위하여 수정된 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜을 통해 메트포르민이 두 개의 다른 종양 세포주의 미토콘드리아 호흡에 어떻게 영향을 미치는지 보여줍니다.

재조합 퍼프렌고리신 O-퍼메아빌화 세포에서 미토콘드리아 기질 플럭스 측정

이 프락토콜은 성상세포와 뉴런에서 생체 외 및 생체 내 미토콘드리아 Ca2+ 이미징을 위한 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다.

유전자 인코딩 된 Ca2 + 지표 (GECIs)를 사용하여 성상 세포와 뉴런에서 이미징 미토콘드리아 Ca2 + 섭취

이 프로토콜은 Na+의 존재 또는 부재 하에 미토콘드리아 복합 활성 CI+CIII 및 CII+CIII를 사용하여 부분적으로 분할된 기능적 CoQ 풀의 존재를 연구하는 비교 분석을 기술한다.

Na+에 대한 내부 미토콘드리아 막 민감도, 부분적으로 분할된 기능적 CoQ 풀 공개

여기에서 우리는 분자 산소를 소비하는 능력과 독립적으로 포유류 세포의 미토콘드리아 기능을 직접 측정하기 위한 분석 모음을 제시합니다.

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

학습하세요 SH-SY5Y 세포에서 미토콘드리아 칼슘 보존 용량과 칼슘 유도 미토콘드리아 팽창을 분석하는 방법을. 이 기술은 미토콘드리아 기능 장애와 세포 에너지 대사 연구에 필수적입니다.

미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 보존 용량 분석 결과 및 캘리포니아^{2 +}-미토 콘 드 리아 붓기 분석 결과 발생

더 많은 동영상 탐색