인간 신경 줄기 세포를 계산
2007년 8월 22일
가능한 세포의 정확한 수를 지식은 많은 조직 문화 조작이 필요합니다. 이 프로토콜은 살고 죽은 세포 사이의 차별과 hemacytometer를 사용하여 세포를 계량하는 방법에 대해 설명합니다. 그것이 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)를 계산 설명하지만, 그것은 다른 세포 유형에 사용할 수 있습니다.
이제 인간 신경 전구 세포를 계수하는 방법을 보여드리려고 하는데, 면역 화학을 위해 세포를 넣거나 핵 인자 기계로 transfection을 하고 싶을 때 세포를 계수할 것입니다. 저는 가장자리 그리드가 있는 위상차 혈구 분석기를 사용하고 트립과 블루라는 염료를 사용합니다. 그리고 염료는 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별할 수 있다는 점에서 유용합니다.
죽거나 죽어가는 세포는 이 염료를 흡수하여 파란색으로 보입니다. 혈구에 있는 세포를 보면 세포분석기와 살아있는 세포가 이 염료를 제외할 수 있고 파란색으로 보이지 않습니다. 그렇게 하면 트립과 블루 및 배지 용액을 준비하기 위해 세포의 생존 능력을 결정할 수 있습니다.
이 0.5mil epi 튜브에 20마이크로리터의 트랩과 파란색 용액을 추가하겠습니다. 그런 다음 25마이크로리터의 미디어를 추가할 것입니다. 이런 식으로 지금 당장 45마이크로리터의 트랩 팬 블루와 미디어 용액을 갖게 되어 5마이크로리터의 세포 현탁액을 추가하면 1에서 10의 희석
이 됩니다.이제 저는 5마이크로리터의 세포 현탁액을 추가하려고 합니다. 먼저 세포가 손가락 소용돌이에 의해 잘 재현 되 현탁되는지 확인할 것입니다. 이제 이 솔루션이 잘 혼합되었는지 확인하고 싶습니다.
그래서 침대를 몇 번 위아래로 놓을 것입니다. 마지막으로 약 12마이크로리터의 이 세포 현탁액을 혈구 분석기에 주입할 것입니다. 그것은 가지고 있고, 두 개의 포트가 있으며, 당신은 할 수 있습니다, 당신은 둘 중 하나를 사용할 수 있습니다.
따라서 이 포트에 용액을 도입하기만 하면 액체가 모세관 작용에 의해 빨려 들어갈 것입니다. 이제 셀 준비가 되었습니다. 다음은 10 x의 혈구 분석기를 살펴본 것이며 여기에는 16 개의 사각형을 포함하는 사분면이 있습니다.
보시다시피 우리는 여기에서 살아있는 세포와 죽은 세포를 관찰할 수 있습니다. 여기 이것, 이것, 저것과 같은 살아있는 세포가 있습니다. 그리고 우리는 또한 이와 같은 죽은 세포를 가지고 있습니다.
눈치채셨다면, 죽은 세포는 짙은 파란색으로 보이는 반면, 살아 있는 세포는 그 주위에 일종의 우박이 있습니다. 이제 살아있는 모든 세포를 세어 보겠습니다. 그래서 왼쪽에서 오른쪽으로, 위에서 아래로 갈 것입니다.
1, 2, 3, 4, 5, 6, 33, 1, 32, 33, 34, 3, 5, 3, 6. 이 사분면에는 총 3개의 6개의 셀이 있습니다. 그래서 바로 여기 이 선을 따라 있는 것과 같이 사분면의 경계선에 있는 셀을 볼 때 일관성을 유지하기 위해 왼쪽 테두리와 위쪽 테두리에 있는 셀을 계산합니다.
그리고 저는 혈세포 분석기의 모든 사분면에 대해 그 경계에 있는 세포를 일관되게 계산합니다. 이제 우리는 마이크로리터당 얼마나 많은 세포가 있는지 계산할 것입니다. 그리고 그렇게 하기 위해 저는 사분면당 셀의 평균인 38을 취하고 챔버의 크기에 의해 결정되는 요인인 10을 곱할 것입니다.
그리고 우리는 또한 10을 곱할 것인데, 이것이 이 경우 희석 계수입니다. 그리고 결국, 우리는 마이크로리터당 세포의 수를 얻게 될 것입니다. 이 경우 마이크로리터당 3, 800개의 셀이 있습니다.
그리고 우리는 500마이크로리터의 용액에 셀 팔레트를 매달아 놓았기 때문에 총 셀 수를 계산할 수 있습니다. 그리고 우리는 모든 준비를 마쳤습니다.
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개요
이 프로토콜은 혈구계수기를 사용하여 인간 신경 줄기/전구 세포(hNSPCs)를 계수하는 방법을 설명합니다. 다양한 조직 배양 응용을 위해 생 세포와 죽은 세포를 구분하는 중요성을 강조합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경 과학
- 세포 생물학
- 조직 배양
배경
- 생 세포 계수는 조직 배양 조작에 매우 중요합니다.
- 생 세포는 특정 염료를 배제할 수 있지만, 죽은 세포는 그렇지 않습니다.
- 혈구계수기는 세포 계수를 위한 표준 도구입니다.
- Trippan 블루 염료는 일반적으로 세포 생존율을 평가하는 데 사용됩니다.
연구 목적
- hNSPCs를 신뢰성 있게 계수할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 생 세포와 죽은 세포를 효과적으로 구분합니다.
- 면역화학이나 형질주입과 같은 추가 실험을 준비하는 연구자를 돕습니다.
사용된 방법
- 단면 대비 혈구계수기의 사용.
- 세포 생존율을 구분하기 위한 Trippan 블루 염료의 적용.
- 현미경 하에서 세포 계수.
- Trippan 블루와 배지의 용액 준비.
주요 결과
- 생 세포와 죽은 세포의 성공적인 구분.
- hNSPCs의 정확한 정량화.
- Trippan 블루 염료의 효과성 시연.
- 혈구계수기의 신뢰성 있는 계수 방법으로서의 검증.
결론
- 이 프로토콜은 세포 계수에 대한 간단한 접근 방법을 제공합니다.
- hNSPCs 이외의 다양한 세포 유형에 적용 가능합니다.
- 세포 생존율을 이해하는 것은 성공적인 조직 배양 실험에 필수적입니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of viable human neural stem/precursor cells (hNSPCs) is essential for reproducible tissue culture workflows in neuroscience drug discovery. This protocol enables reliable cell viability assessment and concentration measurement, supporting consistent experimental seeding for downstream applications such as immunocytochemistry and transfection. By standardizing live/dead discrimination using Trypan blue and hemacytometer-based counting, the method enhances predictive confidence in early-stage target validation and assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise seeding of hNSPCs for target engagement and pathway modulation studies.
- Operational Value: Reduces variability in cell-based assays by ensuring consistent input of viable cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative, reproducible cell concentration data critical for assay standardization.
- Operational Value: Supports scalable preparation of cell suspensions for high-content screening formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains cellular input consistency across discovery-to-preclinical transition stages.
- Operational Value: Facilitates cross-functional collaboration through standardized cell counting practices.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, supporting reliable cell preparation from target validation through assay optimization and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Ensures accurate cell dosing for target validation experiments involving hNSPCs.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable cell inputs necessary for reproducible assay performance.
- Analytics: Generates viable cell concentration and total count outputs used to normalize experimental conditions.
- Translational Research: Supports continuity in cell handling between in vitro discovery and preclinical models.
- Enterprise Reuse: Represents a transferable, low-complexity capability applicable across multiple cell types and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence by minimizing variability in cell-based experimental inputs.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories and teams.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions through reliable assay foundations.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by ensuring data quality in early efficacy screening.
Implementation Considerations
- Requires basic tissue culture technique and microscopy proficiency.
- Dependent on hemacytometer availability and proper cleaning to avoid contamination.
- Necessitates consistent operator training for unbiased quadrant selection and border-counting rules.
- Limited by manual counting throughput; not suited for high-throughput automation without adaptation.
- Relies on correct dilution and mixing to ensure representative sampling of cell suspension.
