Name: 인간 신경 줄기 세포를 계산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 학습하세요 인간 신경 줄기 세포를 계산하는 방법을 헤마시토미터와 트리판 블루 염료를 사용하여. 살아있는 세포와 죽은 세포를 구분하여 조직 배양 실험의 정확한 세포 수를 측정할 수 있습니다.

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저자는 어린이의 병원, hNSPC 문화를 제공하는 오렌지 카운티 연구소 국립 인간 신경 줄기 세포 자원의 박사 필립 H. 슈워츠을 인정하고 싶습니다.

인간 신경 줄기 세포를 Passaging 참고 : 참조하십시오 <a href="/index/details.stp?ID=263">Passaging 인간 신경 줄기 세포의</a> 세포를 분리하고 resuspend하는 방법에 대한 기사. https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 카운팅에 대한 세포 현탁액을 준비 <ol><li> 0.4 % Trypan 블루 솔루션과 eppendorf 튜브에 세포 미디어 20 μl 장소 25 μl. </li><li> 부드럽게 동질적인 중지를 만드는 미디어 알려진 볼륨에있는 세포가 들어있는 튜브를 감청하여 계산하는 세포를 Resuspend. eppendorf 튜브 이전 단계에서 세포로의 5 μl를 놓습니다. 이 단계는 10의 요인에 의해 세포 농도 dilutes. </li><li> hemacytometer에 덮개 유리를 삽입하고, 세포 현탁액의 11-12 μl에 대한로드합니다. <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_4/262_Figure-01.png" alt="262_Figure - 01" width="511" height="139"> </li></ol> Hemacytometer의 세포를 계산 <ol><li> 위상 대조 현미경에 hemacytometer의 전체 격자를 관찰. 그리드 중 하나 사분면 (예 : 빨간색 하나)에 중점을두고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_5/262_Figure-02.png" alt="262_Figure - 02" width="492" height="278"> </li><li> 자신의 멤브레인 손상 및 Trypan 파란색 염료를 제외 수 없습니다 되었기 때문에 죽었거나 죽어가는 세포는 파란색으로 나타납니다. 가능한 세포는 파란색으로 표시되지 않습니다과 위상 대조에 빛나는 "헤일로"( "위상 밝은"됩니다)에 둘러싸여 것입니다. </li><li> 한 사분면 (지역 1mm 2) 가능한 세포의 수를 계산합니다. 당신은 또한 세포의 총 숫자로 가능한 세포의 수를 나누어 세포 생존을 결정할 수 있습니다. 3-4 무작위 quadrants의 세포를 카운트하고 사분 당 세포의 평균 개수를 결정합니다. 사분면의 볼륨이 10 -4 ML 또는 0.1 μl 것으로 알려져 있기 때문에, 세포의 농도는 결정 수 있습니다 <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_6/262_Figure-03.png" alt="262_Figure - 03" width="741" height="165"> </li><li> 당신은 # 전지 / μl를 결정하기 위해 다음과 같은 바로 가기를 사용할 수 있습니다 : <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_7/262_Figure-04.png" alt="262_Figure - 04" width="368" height="69"> 튜브 # 튜브에 세포의 총 = # 전지 / μl X μl </li></ol>

<ol><li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 
 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> (2007).</li>
<li>Caprette, D. avidR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+Hemacytometer%5BTitle%5D)+AND+%22BioEd+Online%22%5BJournal%5D)">Using a Hemacytometer.</a> BioEd Online. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3">http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3</a> (2008).</li>
<li>Caprette, D. avidR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Chamber+%28Hemacytometer%29%5BTitle%5D)+AND+%22BioEd+Online%22%5BJournal%5D)">Counting Chamber (Hemacytometer).</a> BioEd Online. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2
">http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2
</a> (2008).</li>
</ol>

이 프로토콜은 세포를 포함하는 실험의 다양한 세포 농도를 결정하기 위해 간단한 신속한 방법을 설명합니다. 3D에서 설명하는 바로 가기를 사용하여, 하나는 신속하고 정확하게 세포 농도와 주어진 볼륨에서 전체 휴대폰 번호를 확인할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>위상차 혈구계수기</td><td>도구</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td>표시된 카탈로그 번호로 Fisher에서 공급</td></tr><tr><td>Trypan Blue 염색액 0.4%</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>표시된 카탈로그 번호로 Invitrogen에서 공급</td></tr></tbody></table>

인간 신경 줄기 세포를 계산

Counting Human Neural Stem Cells

세포 현탁액의 주어진 볼륨에서 가능한 세포의 정확한 개수의 지식은 이러한 immunocytochemistry 또는 셀 transfections에 대한 도금 세포 많은 일상적인 조직 문화의 조작을 위해 필요합니다. 이 프로토콜은 살고 죽은 세포 사이의 차별과 세포 농도와 hemacytometer를 사용하여 전체 휴대폰 번호를 quantifying 위해 간단하고 빠른 방법을 설명합니다. 이 절차는 먼저 성장 표면에서 세포를 분리 및 미디어에서 그들을 resuspending 필요합니다. 다음, 전지 Trypan 파랑 (이상 사분면마다 20-50 세포를 줄 수있는 농도)의 용액에 희석하여 hemacytometer에 배치됩니다. 마지막으로, 한 1mm 2 사분면 (0.1 μl)와 희석 계수 곱한의 볼륨에 의해 평균 나누어 여러 무작위로 선택된 quadrants에서 가능한 세포의 수를 평균하면 나도 당 세포의 숫자를 제공합니다 μl의 전체 볼륨을하여 세포 농도를 곱한하면 전체 휴대폰 번호를 제공합니다. 이 프로토콜은 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)를 계산 설명뿐만 아니라, 많은 다른 세포 유형에 사용할 수 있습니다.

가능한 세포의 정확한 수를 지식은 많은 조직 문화 조작이 필요합니다. 이 프로토콜은 살고 죽은 세포 사이의 차별과 hemacytometer를 사용하여 세포를 계량하는 방법에 대해 설명합니다. 그것이 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)를 계산 설명하지만, 그것은 다른 세포 유형에 사용할 수 있습니다.

특정 부피의 세포 현탁액 내에 존재하는 생존 세포의 정확한 수를 아는 것은 ...와 같이 많은 일상적인 조직 배양 조작에 필수적입니다.

이제 인간 신경 전구세포의 수를 세는 방법을 보여드리겠습니다. 세포의 수를 세는 과정은 면역 화학 분석을 위해 세포를 배치하거나, 핵인자 기계로 형질전환을 수행하고자 할 때 필요합니다. 저는 가장자리 그리드가 있는 위상차 혈구계수기를 사용하며, 트립판 블루라는 염색약을 사용합니다. 이 염색약은 살아있는 세포와 죽은 세포를 구분하는 데 유용합니다.죽었거나 죽어가는 세포는 이 염색약을 흡수하여 파란색으로 나타납니다. 혈구계수기(hemocytometer)로 세포를 관찰할 때, 살아있는 세포는 이 염색약을 배제하므로 파란색으로 보이지 않습니다. 이러한 방식으로 세포의 생존율을 결정할 수 있으며, 이를 위해 트립판 블루(trypan blue)와 배지를 혼합하여 용액을 준비하십시오.이 0.5 mL 에피 튜브에 트랩 블루 용액 20 µL를 넣겠습니다. 그런 다음 배지 25 µL를 추가하겠습니다. 이렇게 하면 현재 트랩 블루와 배지 혼합액이 45 µL가 되며, 여기에 세포 현탁액 5 µL를 추가하면 1:10 희석 배수가 됩니다.이제 5 µL의 세포 현탁액을 추가하겠습니다. 먼저 핑거 보텍싱을 통해 세포가 잘 재현탁되었는지 확인하겠습니다. 이제 이 용액이 잘 혼합되었는지 확인하고자 합니다.이제 베드를 몇 번 위아래로 움직여 섞어주겠습니다. 마지막으로 이 세포 현탁액 약 12 µL를 혈구계수기에 로딩합니다. 혈구계수기에는 두 개의 포트가 있으며, 어느 쪽을 사용해도 무방합니다.따라서 이 포트에 용액을 주입하기만 하면 모세관 현상에 의해 액체가 빨려 올라가게 됩니다. 이제 카운팅을 시작할 준비가 되었습니다. 10배율로 관찰한 혈구계수기의 모습이며, 여기 16개의 작은 사각형으로 구성된 구획이 보입니다.보시는 바와 같이, 여기서 살아있는 세포와 죽은 세포를 관찰할 수 있습니다. 여기 이 세포와 이 세포, 그리고 이 세포와 같이 살아있는 세포들이 있으며, 이 세포와 같이 죽은 세포들도 있습니다.보시는 바와 같이, 죽은 세포는 진한 파란색으로 나타나는 반면, 살아있는 세포는 주변에 일종의 후광이 형성되어 있습니다. 이제 모든 살아있는 세포의 수를 세어 보겠습니다. 왼쪽에서 오른쪽으로, 그리고 위에서 아래로 이동하며 진행하겠습니다.1, 2, 3, 4, 5, 6, 33, 1 32, 33, 34, 3 5, 3 6. 따라서 이 사분면에는 총 36개의 세포가 있습니다. 일관성을 유지하기 위해, 여기 이 선을 따라 있는 것처럼 사분면의 경계선에 걸쳐 있는 세포를 셀 때는 왼쪽 경계와 위쪽 경계에 있는 세포들을 카운트합니다.그리고 저는 혈구계수기의 모든 사분면 경계선에 있는 세포들을 일관되게 계산합니다. 이제 마이크로리터당 세포 수를 계산해 보겠습니다. 이를 위해 사분면당 세포 수의 평균인 38에, 챔버의 규격에 의해 결정된 계수인 10을 곱하겠습니다.그리고 이번 사례의 희석 배수인 10을 곱합니다. 최종적으로 마이크로리터당 세포 수를 구하게 되는데, 이 경우 마이크로리터당 3,800 cells가 됩니다.세포 펠렛을 500 µL의 용액에 재현탁했으므로, 총 세포 수를 계산할 수 있습니다. 이제 모든 준비가 완료되었습니다.

Research

연구

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Biology

생물학

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