인간 신경 줄기 세포를 Passaging

안녕하세요, 저는 스티브입니다. 저는 Irvine에 있는 uc의 병리학과에 있는 Flanagan 박사의 실험실에서 일하고 있습니다. 오늘은 인간의 신경 전구 세포를 분리하는 방법을 보여 드리겠습니다.

이 기술은 인간 피브로넥틴 용액으로 새로운 플라스크를 코딩하고, 세포 해리 완충액으로 세포를 들어 올린 다음, 10% 혈청 용액으로 세포 해리 완충액을 중화하고, 세포 현탁액을 원심 주입하고, 세포를 신선, 매체 형태로 현탁액 재생하고, 세포 현탁액을 새로운 플라스크로 옮기는 것을 포함합니다. 우리 연구실에서는 격일로 인간 신경 전구 세포의 절반을 배양하고, 일주일에 한 번 1개에서 2개로 분할하여 배양합니다. 세포를 통과시킬 때, 면역 화학 실험을 위해 세포를 교환하고 싶거나 핵 효과기로 transfection을 하고 싶을 때 세포를 셀 수 있습니다.

세포를 패키징할 때 세포 해리 완충액을 사용하는 것이 중요한데, 그 이유는 먼저 트립신과 달리 비효소적이기 때문에 세포에 훨씬 더 부드럽기 때문입니다. 안녕하세요, 조직 배양실에 계십니다 인간 전구 세포의 융합 플라스크가 어떻게 생겼는지 보여드리기 전에 먼저 조직 배양을 준비하겠습니다. 먼저 자외선을 끄고 빛과 기류를 켭니다.

다음은 에탄올을 70% 함유한 후드를 종이 타월로 뿌리고 후드를 닦아 후드를 소독합니다. 후드에 70% 에탄올을 뿌리면 정말 비싼 HEPA 필터가 손상될 수 있으므로 후드 내부가 아닌 70% 에탄올을 종이 타월에 직접 뿌리는 것이 중요합니다. 다음으로, 모든 시약과 기구를 분사할 것입니다.

마지막으로 진공 호스에 스프레이를 뿌릴 테니 모든 준비가 끝났습니다. 이 세포를 살펴 보겠습니다. 따라서 이 세포는 약 80% 집중하는 것처럼 보입니다.

이들은 인간 태아에서 분리된 인간 신경 전구 세포이며, 우리는 이를 T 25 플라스크에서 성장시킵니다. 우리는 매주 한 번에서 두 번으로 나눕니다. 이제 세포를 통과할 준비가 되었습니다.

먼저 BD biosciences의 인간 피브로넥틴으로 4시간 동안 코팅한 새로운 T 25 플라스크를 가져오겠습니다. 그래서 피브로넥틴 용액을 제거했습니다. 세포를 플라스크로 옮기기 전에 이 플라스크를 BBS로 헹굴 것입니다.

이제 37도 인큐베이터에서 세포를 꺼낼 것입니다. 그들이 있어요. 이제 인간 피브로넥틴으로 코팅된 새 플라스크에서 PBS 세척 용액을 제거하겠습니다.

그리고 2ml의 오래된 컨디셔닝 배지를 새 플라스크에 추가할 것입니다. 그래서 이제 나는 그를 표면에서 떼어내기 전에 PBS로 내 세포를 헹구어야 합니다. 그래서 먼저 남은 배지를 제거하고 세포를 적시지 않고 즉시 약 2mil의 PBS를 추가할 것입니다.

약 2분 정도 기다렸다가 PBS를 제거하고 판매 해리 버퍼를 씌워 플랙 표면에서 판매를 제거하겠습니다. 이제 PBS를 제거하고, 다시 세포가 마르지 않도록 세포 해리 완충액을 바로 추가해 보겠습니다. 그래서 저는 1.5mils의 세포 해리 완충액을 추가하려고 합니다.

PBS와 달리 셀에 직접 추가하고 가능한 한 많은 표면을 덮으려고 합니다. 그래서 저는 이 버퍼를 셀에 천천히 추가하면서 플라스크를 좌우로 움직이고 있습니다. 이제 세포가 표면에서 나오기 시작할 때까지 5분 정도 기다리겠습니다.

그리고 플라스크를 후드의 실온에 두겠습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 세포가 먼저 둥글게 모이기 시작한 다음 표면에서 떨어지기 시작하고 실제로 일부 세포는 이미 떠 있는 것을 볼 수 있습니다. 그리고 플라스크를 옆으로 넓게 두드리면 벗겨지는 데 도움이 됩니다.

5분이 지났고, 보시다시피 용액은 표면에서 떨어져 나온 세포로 정말 빽빽해졌습니다. 이제 배지를 함유한 4.5mil의 혈청을 추가하여 세포 해리 완충액의 효과를 중화할 것입니다. 그래서 D-M-E-M-F 12 배지에 10% 열 비활성화된 소 태아 혈청을 사용하고 플라스크 표면에 직접 추가하여 부착된 세포가 없는지 확인하겠습니다.

그리고 저는 남아있는 세포를 제거하기 위해 위아래로 부드럽게 피펫을 낳을 것입니다. 그런 다음 세포 용액을 15mil 원뿔형 튜브로 옮길 것입니다. 그리고 1분 동안 1,000RPM으로 돌릴 것입니다.

그래서 세포는 회전을 마치고 여기에 아름다운 세포 팔레트가 있습니다. 팔레트를 방해하지 않고 세럼 매체를 매우 조심스럽게 제거할 것입니다. 그런 다음 팔레트를 4mil의 미디어에 다시 매달아 놓을 것입니다.

그래서 저는 펠릿을 다시 현탁시켜 세포 덩어리가 남지 않도록 하여 용액이 균질하게 되고 덩어리를 포함시키지 않도록 할 것입니다. 그리고 저는 1-2 분할을 하고 있기 때문에 4개의 밀 중 2개를 가져와서 이미 2mil의 상태 배지가 들어 있는 새 플라스크로 옮길 것입니다. 마지막으로 플라스크에 세포 유형, 통과 번호 및 날짜를 표시하겠습니다.

이것은 우리가 30분 전에 통과시킨 세포를 살펴본 것입니다. 보시다시피, 그들은, 그들 대부분은 표면에 붙어서 프로세스를 보내기 시작했습니다. 그게 다야.

이제 셀 준비가 되었습니다.