세포 세포 상호 작용을 조작에 대한 실리콘 마이크로 칩

안녕하세요, 저는 매사추세츠 공과 대학(MIT)의 Tia 연구실에서 박사 후 연구원으로 근무하고 있는 Elliot Hu입니다. 오늘 우리는 실리콘 마이크로 기계 칩에서 세포 배양을 준비할 것입니다. 이 장치는 서로 고정되는 작은 빗처럼 보이며 서로 다른 두 세포 집단 간의 상호 작용을 정확하게 조작할 수 있습니다.

오늘 우리는 간 간세포와 지지 기질 세포 사이의 상호 작용에 대해 연구할 것입니다. 구체적으로 3 개의 T 3 개의 섬유 아세포 세포가 빗의 윗 표면에 배양되어 있으므로 빗 손가락을 움직여 세포를 움직이고 공간 배열을 변경할 수 있습니다. 각 장치는 두 가지 가능한 구성으로 함께 스냅되는 두 부분으로 나뉩니다.

첫 번째는 두 세포 집단이 서로 접촉하도록 합니다. 두 번째는 세포가 접촉할 수 없도록 두 집단을 약간 분리합니다. 여기서 접촉 상호 작용은 방지되지만 분비된 요인을 통한 상호 작용은 보존됩니다.

핀셋으로 부품을 처리하는 방법에 대해 이야기하는 것으로 시작하겠습니다. 저는 더 큰 테프론 핀셋과 더 작은 라운드 팁 메탈 핀셋을 모두 사용하는 것을 좋아합니다. 더 큰 핀셋을 사용하면 팔이 있는 더 큰 부품으로 가장자리에 있는 부분을 이렇게 집을 수 있으며, 팔은 매우 약하기 때문에 팔이 부러지지 않도록 주의해야 합니다.

그래서 당신은 이와 같이 부품의 뒤쪽에서 그들을 집어 들고 싶습니다. 금속 핀셋을 사용하면 구멍에 손을 뻗어 칩을 직접 집어올릴 수 있습니다. 큰 부품은 12웰 플레이트의 벽에 맞는 반면, 작은 부품은 24웰 플레이트에 맞거나 큰 부품과 쌍을 이룰 수 있습니다.

12웰 플레이트에서는 보통 금속 핀셋을 사용합니다. 플레이트의 부품을 다루어 두 부분을 함께 끼울 때 일반적으로 더 큰 부분을 먼저 우물에 넣고 한쪽으로 끝까지 밀어 넣습니다. 그런 다음 무료 수리를 받아 우물 반대편에 놓고 각 구멍에 하나씩 두 개의 핀셋을 가져다가 함께 밀어 넣었습니다.

이제 갭 구성 또는 접점 구성에서 부품을 함께 잠글 수 있습니다. 부품을 분해하고 싶다면 부품을 갭 구성으로 당긴 다음 수직으로 당겨 부품을 제거하는 것을 좋아합니다. 이제 장치는 실리콘으로 만들어졌으므로 적절한 셀 접착을 위해 코팅해야 합니다.

당신은 아마도 폴리스티렌으로 코팅되고 플라즈마가 처리된 장치를 받게 될 것이므로 그것이 우리의 출발점이라고 가정할 것입니다. 우선, 콜라겐을 사용하여 간세포가 부착될 표면을 코팅할 것입니다. 우리는 간세포 빗을 밀당 50마이크로그램의 콜라겐, 하나의 용액에 넣고 37°C에서 45분 동안 배양할 것입니다.

반면에 섬유아세포 빗은 코팅할 필요가 없습니다. 배양 후, 우리는 콜라겐 용액을 흡인하고 씻고 물을 뿌립니다. 이제 우리는 세포 파종을 위한 평평한 표면을 형성하기 위해 상호 보완 부품과 접촉하여 ES를 함께 잠글 것입니다.

먼저 일부 우물을 70% 에탄올로 채웁니다. 각 우물에 한 쌍을 넣고 함께 잠글 것입니다. 함께 잠근 후 현미경으로 부품을 보고 동일 평면에 있는지 확인하려고 합니다.

때때로 부품이 잘못 정렬되어 함께 잠길 수 있습니다. 그리고 현미경에서 볼 수 있듯이 두 개의 다른 초점면에 있습니다. 이 경우 부품을 분리하고 다시 밀어 넣기만 하면 정렬이 정상인지 확인한 후 부품을 에탄올에 잠시 방치하여 살균합니다.

두르는 경우가 많아서 10분만 담가두죠. 살균 후에는 헹궈야 합니다. 에탄올은 완전히 흡인하고 물로 씻은 다음 흡인하고 다시 물로 씻고 마지막으로 물을 흡인하고 배양 배지로 교체합니다.

이제 장치에 세포를 시드합시다. 전형적으로, 우리는 500, 밀리리터 당 000 세포의 농도에 세포를 현탁시키고, 12의 웰 플레이트를 사용하여 각 빗 쌍에 1 밀리리터 현탁액을 피펫팅합니다. 그래서 우리는 섬유아세포를 두 개의 우물에 1밀리리터당 500,000개의 세포로 파종했습니다.

마찬가지로, 우리는 우물당 500,000개의 간세포를 현탁액으로 만들고 다른 두 개의 우물에 파종했습니다. 이제 배양하기 전에 세포가 고르게 분포되어 있는지 확인하기 위해 세포를 철저히 흔들 것입니다. 그리고 저는 세로로 세 번, 수평으로 세 번 흔든 다음 이것을 세 번 반복하는 것을 좋아합니다.

흔든 후 인큐베이터에 넣고 세포를 15분 동안 그대로 두었다가 다시 흔듭니다. 한 시간 동안 15분마다 흔든 후, 세포 현탁액을 흡인하고 세포의 새로운 현탁액을 사용합니다. 그리고 우리는 세포의 합류 층이 생길 때까지 이것을 반복할 것입니다.

일반적으로 섬유아세포의 경우 하나 또는 두 개의 좌석이 필요합니다. 그리고 간세포의 경우 2-4개의 좌석이 필요할 수 있습니다. 합류 단층을 얻기 위해 세포는 상당히 높은 밀도로 앉고 흔들리며 세포가 고르게 분포되도록 합니다.

첫 번째 앉음 후에는 희박한 세포층이 형성됩니다. 세포는 폴리스티렌과 콜라겐으로 코팅된 손가락에만 부착됩니다. 새로운 세포를 파종하고 한 시간 동안 더 배양한 후 15분마다 흔들면서 다시 세포층이 더 조밀해집니다.

세 번째 파종 후 세포 밀도가 양호하며 이제 세포가 빗에 파종된 후 중지할 수 있습니다. 우리는 세포를 원하는 실험 구성으로 조작하려고 합니다. 이제 장치는 상호 보완 부품에서 분리되어 24시간 동안 배양됩니다.

24시간이 지나면 세포가 퍼져 빗 표면 위에 합류 단층을 형성합니다. 이제 우리는 공동 문화를 형성하고자 합니다. 간세포 빗과 섬유아세포 빗은 이제 동일한 웰로 옮겨져 원하는 초기 구성에 함께 고정됩니다.

원하는 경우. 일정 시간이 지나면 구성을 변경할 수 있습니다. 예를 들어, 18시간 후에 갭 구성으로 이동할 수 있고, 부품은 동일한 곳에 배치되고, 갭 구성에 도달할 때까지 함께 잘 밀어 넣은 다음 갭 구성으로 다시 접촉할 수 있습니다.

이제 빗 하나를 제거하겠습니다. 이제 우리가 할 일은 폴리스티렌의 오래된 코팅을 벗겨내고, 칩을 세척한 다음, 새로운 폴리스티렌 코팅을 씌우고 세포 배양을 준비하는 과정을 거칠 것입니다. 다시 말하지만, 오래된 폴리스티렌 코팅을 벗겨내고 새 코팅을 함으로써 이전 실험의 역사가 새로운 실험을 방해하지 않도록 합니다.

따라서 실험을 마친 후 가장 먼저 할 일은 세포를 표백한 다음 빗과 물을 헹구는 것입니다. 따라서 칩을 토잉에 넣기 전에 칩이 완전히 건조되었는지 확인하고 싶을 것입니다. 그래서 여기 잠시 동안 자연 건조하고 완전히 건조되었는지 확인하기 위해 방금 남겨둔 몇 가지 빗이 있습니다.

이제 우리는 약간의 토잉을 가져 와서이 유리 스피커에 넣을 것입니다. 여기에 유리 피펫을 사용하여 용해시키지 않도록하겠습니다. 할로윈은 플라스틱을 녹이기 때문에 일반적인 폴리스티렌 피펫을 사용할 수 없습니다.

좋아요, 이 정도면 충분합니다. 이제 이 부품 중 몇 개만 가져다가 토잉에 넣고 셰이커를 켜서 교반하고 알루미늄 호일로 덮어 톨루엔이 증발하지 않도록 하겠습니다. 따라서 두 시간 후에 톨루엔이 빗에 있는 대부분의 폴리스티렌을 녹였을 것이고 우리는 그것들을 꺼내서 빗을 자연 건조할 수 있습니다.

핼러윈 헹굼 후에는 부품에 폴리스티렌이 비교적 없어야 하며 비교적 깨끗해야 합니다. 그러나 부품이 매우 깨끗하지 않은 경우 새로운 폴리스티렌 층이 좋은 접착력을 형성할 수 있도록 부품이 매우 깨끗해야 합니다. 폴리 타이는 세포가 당기기 시작할 때 실험 중간에 벗겨지는 경향이 있습니다.

이제 우리가 할 일은 피라냐 산을 청소하는 것입니다. 부품을 유리 스피커에 넣었고 이것을 가열할 것입니다. 그래서 우리는 핫 플레이트를 놓을 것입니다.

그리고 여기에 황산과 과산화수소가 있습니다. 먼저 황산을 붓고 여기에서 모든 칩이 유체 아래에 잠겨 있는지 확인합니다. 때때로 그들은 떠다니는 경향이 있습니다.

또한 이제 우리는 부식성이 강한 화학 물질로 작업하고 있으므로 올바른 보호 장비를 착용하고 있는지 확인하십시오. 여기. 니트릴 장갑을 끼고 있습니다. 이제 우리는 과산화수소를 산에 붓고 발열 반응이기 때문에 여기에서 조심할 것입니다.

그래서 여러분은 그것이 반응할 때 약간 연기가 나는 것을 볼 수 있지만, 우리는 그것이 더 반응할 수 있도록 시스템에 약간의 에너지를 추가하고자 합니다. 이제 우리는 섭씨 120도까지 가열할 것이므로 세포 배양의 잔여물이 칩에서 완전히 제거될 것임을 확신할 수 있습니다. 따라서 이 시점에서는 과산화수소가 모두 소모될 때까지 반응이 완전히 진행되도록 하고 싶습니다.

그리고 그 시점에서 혼합물은 거품을 멈출 것입니다. 따라서 반응이 진행되는 데 약 30분이 걸립니다. 거품이 더 이상 보이지 않으면 핫 플레이트를 끄고 식힐 수 있습니다.

그리고 우리는 그것들을 BAK 곡선 물로 옮길 것입니다. 그리고 다시 한 번, 여기에서 금속이 아닌 테프론 핀셋을 사용하고 있는지 확인하고 집어 들고 옮길 수 있습니다. 그래서 이제 우리는 DDH 2 O.I의 꾸준한 흐름으로 헹구고 보통 Meine에서 직접 가져 와서 여기에서 최소 10 분 동안 작동시킬 것입니다.

그리고 그렇게 함으로써, 우리는 10분 동안 물줄기 아래에서 다진 후 산의 모든 흔적을 씻어낼 것입니다. 산은 칩에서 다시 제거되어야 하며, 우리는 Sigma에서 얻은 폴리스티렌 45, 000 분자량 폴리스티렌을 코팅할 준비가 될 때까지 수중에 보관할 것입니다. 그리고 우리는 여기에서 그 중 소량의 무게를 잴 것입니다.

우리는 400mg을 가지고 있고 그것을 밀리리터당 100mg의 톨루엔에 녹일 것입니다. 따라서 톨루엔은 후드에서 취급해야 합니다. 그리고 또 다른 것은 폴리스티렌을 용해시키기 위해 톨루엔을 사용할 것이기 때문에 폴리스티렌으로 만든 실험실 의류를 사용하지 않도록 하고 싶습니다.

그래서 우리는 폴리프로필렌, 원뿔형 및 유리 피펫을 사용하고 있습니다. 그래서 저는 400밀리그램의 폴리스티렌을 가지고 있기 때문에 4밀리리터의 토잉을 넣을 것입니다.그리고 이제 폴리 스티린이 용해될 때까지 30분 동안 볼렉스할 것입니다. 이제 우리는 약 20분에서 30분 동안 가장 낮은 속도로 튜브를 소용돌이칠 것입니다.

그래서 저는 튜브를 소용돌이에 연결할 것입니다. 나는 그것을 내내 거기에 붙잡고 있을 필요가 없습니다. 20-30분 후에 폴리스티렌이 용해되고 코팅할 준비가 됩니다.

이제 우리는 우리 시설에서 폴리스티렌을 스핀 코팅할 것입니다. 당사의 스핀 코더는 클린룸 시설에 있습니다. 그래서 여기서 우리는 모자, 고글, 가운, 부츠 및 장갑을 착용해야 하지만 귀하의 시설에서는 동일하지 않을 수 있습니다.

이 척을 사용하기 전에 폴리스티렌으로부터 보호하고 싶습니다. 그래서 우리는 그것을 알루미늄 호일로 덮을 것이고, 칩이 표면과 같은 높이에 놓일 수 있도록 이것을 표면에 가능한 한 평평하게 만들고 싶습니다. 칩에 진공 상태를 유지할 수 있도록 중앙에 작은 구멍을 뚫을 것입니다.

스핀 코더는 2, 400RPM 및 30초로 설정됩니다. 이제 칩 중 하나를 가져와서 칩의 중심이 구멍을 덮도록 놓고 폴리스티렌을 씌울 때 먼저 진공 청소기를 끄고 진공 청소기를 켠 다음 스핀을 시작할 것입니다. 따라서 더 작은 부품의 경우 10방울 미만만 떨어뜨릴 수 있습니다.

그리고 더 큰 부분의 경우 폴리스티렌 10방울 이상이 필요합니다. 그리고 2, 400 RPM으로 30초 동안 회전할 것입니다. 이제 우리는 폴리 스티렌 코팅 칩을 가져 와서 폴리스티렌의 유리 전이 점 이상인 120 °C의 오븐에 넣을 것입니다.

따라서 표면을 약간 매끄럽게 하기 위해 리플로우할 것이고 플라스틱을 치밀화하고 단단하게 만들 것입니다. 그래서 보통 오븐에 하룻밤 동안 그대로 둡니다. 프로세스를 완료하는 데 최소 몇 시간이 걸릴 수 있습니다.

따라서 하룻밤 굽고 나면 칩이 플라즈마 처리를 할 준비가 된 것입니다. 이제 우리는 폴리스티렌을 산소 플라즈마에 노출시킬 것이고, 그러면 표면 에너지가 변화하여 단백질과 세포가 더 잘 달라붙을 것입니다. 그래서 우리는 칩을 플라즈마 챔버에 로드하고 진공 상태로 펌핑할 것입니다.

사용하기 좋은 설정은 산소 가스의 흐름에서 1분 동안 200mil, 진공 투어 및 200와트의 전력입니다. 이제 시스템이 펌핑 다운되었으니 산소를 주입할 것입니다. 자, 이제 RF 전원을 켜고 1분 동안 플라즈마를 칠 수 있습니다.

따라서 플라즈마가 작동할 때 실제로 빛납니다. 형광등 전구와 같습니다. 1분 동안 플라즈마에 노출된 후 압력을 다시 대기로 올리고 부품을 빼낼 수 있습니다.

이제 부품은 단백질 코팅 및 세포 공급을 위한 준비가 되었습니다. 이 장치를 설계하는 목표는 조직의 미시 구조를 역동적인 방식으로 조작할 수 있도록 하는 것이었습니다. 따라서 신체 조직의 미시적 조직, 특히 세포가 서로에 대해 배치되는 위치는 실험실 배양에서 각 특정 세포의 기능을 결정하는 데 매우 중요합니다.

최근까지만 해도 우리는 이를 잘 복제할 수 없었지만, 지난 5년 또는 10년 동안 사람들은 조직 배양 기질에 세포를 마이크로 패턴화할 수 있게 되어 조직 배양 플레이트에서 원하는 위치에 세포를 정확히 배치할 수 있게 되었습니다. 그렇게 함으로써 미시적 규모에서 세포 세포 상호 작용의 기본 생물학의 몇 가지 중요한 측면을 발견할 수 있었습니다. 자, 지금까지 우리가 할 수 없었던 것은 그것을 동적으로 하는 것입니다.

그것은 실험의 중간에 세포 배양의 조직을 변경하는 것입니다. 이것이 중요한 이유는 신체에서 조직은 실제로 정적인 환경이 아니기 때문입니다. 우리는 주변을 돌아다니며 재조직하는 세포를 가지고 있으며, 특히 상처 치유 또는 발달 과정에서 그렇습니다.

하지만 항상성의 정상적인 기관에서도 많은 것들이 움직이고 있습니다. 배워야 할 가장 어려운 기술적 측면은 부품을 물리적으로 먹는 방법입니다. 그리고 처음에는 시스템으로 작업을 시작할 때 부품이 얼마나 취약한지 또는 만들어야 하는 감정이 얼마나 작은지 두려워할 수 있습니다.

하지만 잠깐만 연습하면 큰 어려움은 없을 거라고 생각합니다. 예를 들어, 배아 발달에서 이 장치가 역할을 하는 것을 볼 수 있는 장소 중 일부는 세포가 다양한 배아 층을 통해 싹을 틔우기 때문에 세포가 일련의 다른 세포 환경과 접촉하게 됩니다. 그리고 순차적으로 접촉하는 각 층과의 상호 작용은 우리 모두를 특정 분화 경로를 따라 더 멀리 밀어붙이는 것으로 알려져 있습니다.

그래서 우리는 이러한 유형의 장치가 실험실에서 이러한 유형의 이벤트를 복제하는 데 적합할 수 있다고 생각합니다. 우리가 특히 살펴보고 싶었던 미시 조직의 측면 중 하나는 세포막이 서로 접촉할 수 있는 접촉 상호 작용을 통해 통신하는 세포와 주변 매체로 분비되는 용해성 인자를 조금 더 멀리 있는 세포로 확산시키는 세포의 차이였습니다. 그리고 세포가 공동 배양에 들어가 서로에게 영향을 미치는 경우가 많은데, 이것이 접촉 상호작용인지 아니면 분비 인자