개발 Zebrafish의 표피에서 세포 압출의 라이브 영상

상피 조직을 유지하려면 장벽 기능을 방해하지 않고 손상되거나 죽어가는 세포를 지속적으로 제거해야 합니다. 이를 달성하기 위해 상피는 죽어가는 세포를 둘러싼 세포에서 액틴과 미오신 고리를 형성하고 수축하여 죽어가는 세포를 방출하는 동시에 그 출구로 인해 발생했을 수 있는 틈을 닫음으로써 죽어가는 세포를 밀어냅니다. 이 비디오 기사에서는 실시간으로 유충 얼룩말 물고기의 표피에서 세포사멸 세포 압출을 유도하고 이미지화하는 방법.

여기에서 볼 수 있듯이, 이는 F 액틴 프로브(F actin probe)라고 표시된 적색 형광 단백질을 표피에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 형질전환 제브라피시 배아에 주입하여 상피 조직에서 작용하는 필라멘트를 시각화함으로써 달성됩니다. 4일차, GFP와 RFP를 모두 발현하는 개인화 후 유충은 G four 18로 처리하여 표피에서 세포사멸을 유도합니다. 압출 중에 발생하는 액틴 역학 및 상피 세포 모양 변화는 회전 디스크 컨포칼 현미경의 타임 랩스 이미징으로 시각화됩니다.

면역력 및 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 살아있는 상피 조직에서 압출 과정에서 발생하는 급격한 변화와 액틴 역학을 관찰할 수 있다는 것입니다. 이 비디오에서는 발달 중인 제브라 피쉬의 표피에서 세포사멸 세포의 압출을 실시간으로 이미징하는 절차를 보여줍니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 세포가 장벽 기능을 유지하면서 자가사멸 세포를 제거하기 위해 액톤 세포 골격을 조정적으로 재배열하는 방법과 압출 내 과정을 방해하는 것이 어떻게 특정 질병 상태로 이어질 수 있는지 이해합니다.

자, 시작하겠습니다: 발달 중인 제브라피시의 표피에서 세포 압출 중 작용 역학을 시각화하려면 먼저 이전에 전사된 RNA를 얼음 위에서 해동합니다. 장릉지에 융합된 적색 형광 단백질을 암호화하는 Mr.mRNA를 유트로핀의 상동성 영역에서 전사해, 결합 단백질에 작용합니다. 마이크로리터당 약 30나노그램의 최종 RNA 농도를 위해 1:1 비율로 RNA에 페놀 레드를 추가하고 다시 채워서 당겨진 모세관 바늘에 1마이크로리터의 용액을 로드합니다.

E 3 buffer에서 약 75개의 1 cell stage C-K-G-F-P 배아를 수집합니다. 수집된 배아를 5/3/4 파스타 피펫으로 미세사출 금형에 피펫으로 넣고 FST Dumont를 사용하여 배아를 홈통의 배로 부드럽게 움직입니다. 다섯째, 겸자는 표준 실험실 해부 실체 현미경 하에서 RNA를 다단계 배아에 주입할 필요가 없도록 빠르게 작동합니다.

압력 제어 마이크로 주입기를 사용하여 RNA를 페놀의 화석으로 배아의 멍에에 주입합니다. 주사 후 배아에서 빨간색이 보여야 합니다. 각 실험에 대해 최소 50개의 배아를 주입해야 합니다.

배아를 분류하여 수정되지 않았거나 손상된 난자를 제거하고 나머지 모든 배아를 섭씨 28도에서 부화시킵니다. 24시간 후, 형광 해부 현미경을 사용하여 표피에서 GFP 형광 수치가 높고 RFP 표지된 작용성 형광을 가진 제브라피시 배아를 선택합니다. 아미노 배당체에 대한 세포사멸 노출을 유도하기 위한 약물 처리를 진행할 준비가 될 때까지 선택된 배아를 섭씨 28도에서 배양합니다.

항생제 G four 18 또는 약물은 발달 중인 제브라피시 유충의 표피에서 세포사멸 세포의 압출을 유발합니다. 중요한 것은 이 치료법이 수정 후 4일 이상 된 유충에만 작용하여 세포 압출을 유도한다는 것입니다. GFP와 RFP를 모두 발현하는 수정 후 4일 제브라피쉬 유충을 최대 25개까지 35 x 10mm E 3 배지를 포함하는 35 x 10mm 배양 접시에 수집합니다.

배지를 3 밀리리터의 E 3 밀리리터로 조심스럽게 교체하고, G 4 18의 밀리리터 당 1 밀리그램을 함유하고, 섭씨 28도의 어둠 속에서 4 시간 동안 약물에서 유충을 배양한다. 그런 다음 미디어를 제거하고 0.02%trica를 포함하는 예열 E 3개의 미디어로 교체하고 이미징을 위해 유충을 장착하기 위해 유충 장착을 진행합니다. 최대 3마리의 유충을 1.5ml 펜더 튜브로 옮기고 E 3마리 배지 대부분을 제거합니다.

절단 된 피펫 팁 피펫을 사용하여 120 마이크로 리터의 1 % 저용융 피펫을 튜브 혼합물에 넣습니다. 그런 다음 유충과 aro 혼합물을 matech 배양 접시 바닥의 커버 유리에 부드럽게 피펫으로 만듭니다. 인서트 핀 또는 텅스텐 바늘이 부착된 FST 핀 홀더를 사용하여 유충이 커버 유리에 대해 직선이고 평평하도록 빠르게 방향을 잡습니다.

aose가 굳어지도록 합니다. 그런 다음 접시에 0.02%trica를 함유한 E 3 배지를 부드럽게 채웁니다. 우리는 발달 중인 제브라피시 유충의 표피에서 세포사멸 세포가 분리되는 전체 과정이 약 20분이 걸린다는 것을 발견했습니다.

여기에서는 회전 디스크 컨포칼 현미경과 및/또는 IQ 소프트웨어를 사용하여 제브라피시 표피의 단일 층을 통해 시리즈 Z 평면을 수집하는 타임 랩스 이미징 실험을 설정하는 방법을 보여줍니다. 먼저 및 또는 IQ 소프트웨어 내에서 아르곤 및 헬륨 네온 레이저 현미경 카메라와 에피 형광등의 전원을 켭니다. 이미징할 파장을 포함하는 시계열 프로토콜을 생성합니다.

이미지 캡처 간격의 빈도와 캡처를 반복해야 하는 횟수: 표본이 들어 있는 mattec 접시를 현미경 스테이지에 부드럽게 놓은 다음 투과광이 있는 20배 대물렌즈를 사용하여 유충에 초점을 맞춥니다. 40회 침수 대물렌즈를 올바른 위치로 이동합니다. 이 목표를 사용하여 필드당 약 20-25개의 세포를 촬영할 수 있으며, 이를 통해 압출 중 세포 거동을 추적하는 동시에 세포 내 작용 역학을 해결할 수 있습니다.

40 times objective 위에 물 한 방울을 조심스럽게 놓고 mattec 접시를 그 위에 빠르게 놓습니다. 명시야 조명을 사용하여 표본을 식별한 다음 488나노미터 에피 형광을 사용하여 GFP 양성 표피에 특이적으로 초점을 맞춥니다. 컨포칼 스캔 모드로 전환합니다.

그에 따라 각 채널의 레이저 강도와 노출 시간을 조정합니다. 신호를 최적으로 감지하고 광독성을 방지하기 위해 레이저 출력과 노출 시간의 균형을 맞추도록 주의하십시오. 돌출 세포를 식별하려면 에피 형광을 사용하여 GFP 표지 표피를 시각화하고 중간에 있는 작은 원형 세포를 둘러싼 세포 모음으로 구성된 고전적인 로제트 패턴의 세포 그룹을 식별합니다.

또한, 세포 압출의 특징인 중앙의 작은 둥근 세포 주위에 고리로 보이는 액틴(actin)이라고 표시된 RFP가 축적되어야 합니다. 압출 셀이 식별되면 Z 시리즈와 스텝 크기에 대한 상한 및 하한을 빠르게 설정합니다. 그런 다음 4개의 D 컨포칼 데이터 세트를 획득하여 데이터를 보고 죽어가는 세포 주변에서 발생하는 액틴 고리 및 상피 행동의 수축을 시각화합니다.

시간이 지남에 따라 Z 시리즈의 3D 투영을 만들고 데이터를 동영상 파일로 저장합니다. 이 단계는 다양한 소프트웨어 패키지를 사용하여 수행할 수 있습니다. 이 그림은 수정 후 4일 CK GFP 제브라피쉬 유충의 표피에서 RFP UTR CH의 발현을 보여줍니다.

여기 여전히 라이브 연기 역학을 따르는 타임랩스 영화의 프레임 Z 프로젝션. 상피 세포 압출 과정에서 화살표는 이웃 세포에 의해 형성된 액틴 고리를 나타내며, 2 분 동안 수축하고 닫힙니다. 이 절차에 따라 화학적 억제제 또는 유전적 돌연변이의 사용과 같은 이 기술과 함께 다른 방법을 사용하여 압출 변경이 특정 질병 상태로 이어질 수 있는 방법을 더 잘 이해할 수 있습니다.

세포사멸 세포를 제거하지 못한 것에서 비롯되어, 발달 중인 제브라피시의 표피에서 압출 과정을 시각화하기 위해 타임랩스 이미징 실험을 설정하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 광 표백이나 독성을 방지하기 위해 표본에 노출되는 빛의 양을 제한하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 그게 다야.

지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.