CRISPR 매개 염기 편집 도구: 표적 염기 치환을 유도하는 게놈 편집 기술

CRISPR 매개 게놈 편집의 경우 염기 편집기 효소를 암호화하는 통합 BE 유전자가 있는 반수체 세포주인 HAP1-BE3 배양으로 시작합니다. 이 배양액에 인간 유방암 유전자인 BRCA1과 같은 특정 표적을 위해 설계된 CRISPR-Cas9 플라스미드를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 추가합니다.

렌티바이러스 입자는 숙주 세포막과 융합하여 플라스미드를 방출하고, 이는 결국 숙주 세포 게놈에 통합되어 CRISPR-Cas9-BE 유전자 세그먼트를 형성합니다. 이 유전자는 BRCA1 표적 gRNA, Cas9 엔도뉴클레아제 및 BE-시티딘 데아미나제를 생성합니다.

BRCA1 표적 gRNA는 Cas9와 융합하여 복합체를 BRCA1 유전자 유전자좌로 유도하는 RNA입니다. 이 유전자 근처에는 원시스페이서 인접 모티프(PAM)가 있으며, 여기서 BE는 활성 촉매 영역에 도달하기 위해 안정적으로 도킹하고 상류로 이동할 수 있습니다. 여기서 BE는 시티딘 염기를 인식하여 우리딘으로 전환합니다.

이 염기 치환 돌연변이는 Cas9 뉴클레아제를 유발하여 변형되지 않은 DNA 가닥을 절단합니다. DNA 가닥 절단은 누락된 염기를 채우고 비 DNA 염기인 우라실을 티민으로 전환하는 복구 효소를 활성화합니다. 전반적으로 이러한 과정은 유전자 변이를 생성합니다.

이제 생리학적 조건에서 세포를 배양하고 계대 배양하여 유전자 변이를 증식시킵니다. 게놈 DNA를 추출하고 시퀀싱하여 CRISPR 매개 염기 편집 효율을 분석합니다.

형질감염 하루 전에 24웰 플레이트에 웰당 5 x 10⁵개의 HAP1-BE3 세포를 시드하고 형질감염을 위해 70% 내지 80% 합류에 도달하도록 배양합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 구매한 형질감염 시약을 사용하여 BRCA1 표적 가이드 RNA를 형질감염시킵니다. BRCA1 표적 가이드 RNA 1마이크로그램을 사용하여 BRCA1 표적 부위에서 CG에서 TA로의 전환을 유도합니다. 그런 다음 세포를 섭씨 37도에서 배양하고 3-4일마다 계대 배양합니다. 형질감염 후 3일, 10일 및 24일에 세포 펠릿을 수확하여 염기 편집 효율을 분석합니다. 게놈 DNA 정제 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추출합니다.