형광 은 염색: 폴리아크릴아미드 겔에서 총 단백질을 시각화하는 기술

폴리아크릴아미드 겔에서 단백질의 형광 은 염색은 형광 프로브를 사용하여 단백질을 검출하고 정량화합니다.

단백질이 함유된 폴리아크릴아미드 겔로 시작하여 전기영동을 통해 밴드로 분리합니다. 에탄올과 아세트산의 고정 혼합물에 담그면 단백질을 변성시켜 밴드가 확산되는 것을 방지할 수 있습니다.

젤을 세척하여 잔류 아세트산과 에탄올을 제거합니다. 젤을 질산은 얼룩에 담그십시오. 은 이온은 단백질의 음전하를 띤 그룹에 강하게 결합합니다.

어둠 속에서 배양하십시오. 젤을 초순수로 헹구어 결합되지 않은 은 이온 복합체를 제거합니다.

다성분 형광 프로브인 TPE-4TA가 포함된 현상 용액에 겔을 담그십시오. 이 음이온 프로브는 단백질에 결합된 은 이온을 표적으로 삼아 프로브의 형광 특성을 활성화하는 불용성 응집체를 형성하여 형광을 부여합니다.

형광 활성화는 응집에 따라 다르기 때문에 결합되지 않은 프로브는 어떠한 신호도 방출하지 않으므로 배경 방출을 줄인 전체 단백질 염색이 가능합니다.

둠 속에서 젤을 부드럽게 교반하면서 배양하여 완전한 형광 발생을 보장합니다. 겔을 탈색 완충액에 옮겨 결합되지 않은 프로브를 제거합니다. 마지막으로 겔을 이미지화하여 밴드 신호 강도를 얻습니다. 표준 단백질 곡선에 대한 형광 신호 강도를 플로팅하여 샘플의 단백질 총량을 계산합니다.

전기영동 후, 에탄올과 아세트산을 함유한 100밀리리터 용액에 오비탈 쉐이커에 겔을 담그고, 50RPM으로 흔들면서 실온에서 30분씩 2회 배양한다. 그런 다음 깨끗한 용기에 담긴 초순수로 젤을 세 번 세척하고 각 세척은 10분 동안 지속됩니다.

먼저 질산은 0.01g을 초순수 10ml에 녹여 농도 0.1%의 원액을 준비합니다. 이 원액 100마이크로리터를 초순수 100밀리리터에 첨가하여 질산은 작용 용액을 만듭니다. 퓨ム 후드에서 밀봉된 유리 챔버에 있는 질산은 작업 용액 100밀리리터에 젤을 담그십시오.

호일을 사용하여 함침 시 젤을 빛으로부터 보호하고 오비탈 셰이커에서 50RPM으로 흔들면서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 깨끗한 용기에 담긴 초순수로 젤을 두 번 세척하고, 각 세척은 약 100밀리리터의 물을 사용하여 60초 동안 지속됩니다.

배경 염색을 최소화하기 위해 은 함침 단계 후 초순수를 사용하여 젤을 세척하는 것이 중요합니다.

먼저 TPE-50TA 염료 3mg에 초순수 4밀리리터를 첨가합니다. 용액을 3분 동안 초음파 처리하고 각 초음파 처리 세션 사이에 5마이크로리터의 1몰 수산화나트륨 용액을 추가하여 염료를 용해시키는 데 도움을 줍니다(일반적으로 최대 3회). 그런 다음 365나노미터 UV 램프 아래에서 용액의 형광을 확인하여 염료가 완전히 용해되었는지 확인합니다. 약하거나 방출되지 않는 용액만 완전한 용해를 나타냅니다.

형광 현상 용액을 제조하려면 TPE-4TA 원액 10ml를 초순수 90ml에 첨가합니다. pH 측정기를 사용하여 용액의 pH를 확인하십시오. pH가 범위를 벗어난 경우 희석된 수산화나트륨 용액 또는 아세트산을 사용하여 용액을 7에서 9 사이의 pH로 조정합니다.

다음으로, 겔을 100밀리리터의 형광 현상 용액이 담긴 깨끗하고 밀봉 가능한 용기에 옮기고 겔이 완전히 잠겼는지 확인합니다. 용기를 밀봉하고 빛으로부터 보호하기 위해 덮으십시오. 오비탈 셰이커에서 50RPM의 실온에서 밤새 용기를 흔듭니다.

젤을 깨끗한 용기에 옮기고 100% 에탄올 100밀리리터에 30분 동안 얼룩을 제거합니다. 그런 다음 젤을 초순수로 5분 동안 헹굽니다. 겔은 벤치탑 트랜스 조명기에서 시각화하거나 365나노미터 채널 또는 302나노미터 채널의 겔 문서화 기계에서 이미지화할 수 있습니다.