Name: 다량 체-PAGE : 생물학적 샘플에서 캡처하는 방법 및 해결 단백질 단지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 배우세요 다량 체-PAGE를 이용하여 조직 용해액에서 천연 단백질 단지를 포착하고 분리하는 방법을. 이 기술은 불안정한 단백질 결합을 안정화하여 생화학 및 단백질체 연구에 활용할 수 있습니다.

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국립 보건원 / NIDA의 DA034783 지원. 우리는 다량 체-PAGE와 기술 지원 브라이언 A 킬링거합니다.

1. 조직 준비 <ol><li> 200 x BN-PAGE 샘플 버퍼 (200 mM Bis (2- 하이드 록시 에틸) 아미노 - 트리스 (하이드 록시 메틸) 메탄 (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40 % w / v 글리세롤, 0.004 % Ponceau S, pH 7.2 ). 비고 :이 저장 용액은 미리 제조하여 4 ℃에서 보관할 수있다. </li><li> 1x 상업용 프로 테아 제 억제제 칵테일을 포함하는 750 μL dH 2 O에서 4x 샘플 버퍼 250 μL를 희석하십시오. 소용돌이 치고 얼음 위에서 식히십시오. </li><li> 30 ML 획기적인 깨끗한 dounce homogenizer와 1 ML 1X 얼음 차가운 BN - 페이지 샘플 버퍼에 대상 조직 20 MG을 균질. 참고 :이 시범 실험을 위해 대상 조직은 전체 쥐 뇌 조직입니다. 균질화 후 샘플을 2 % digitonin과 같은 중성 세제로 처리하여 막 단백질의 가용화 및 전기 영동을 허용 할 수 있습니다. </li><li> 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 homogenate를 전송하고, 불용성 세포 내용을 펠렛에 30 분 14,000 XG에서 원심 분리기. 애프터R 원심 분리는 얼음에 깨끗한 튜브에 뜨는을 가만히 따르다. </li><li> bicinchoninic 산 (BCA) 또는 유사한 단백질 정량 분석법을 이용하여 상등액의 단백질 농도를 측정하기 위해 제조 지시에 따라. </li><li> 균질 시료 (S)에 세제를 포함 할 경우, 0.25 % 쿠마시에 균질 액을 가지고 충분한 수용액에 5 % 쿠마시 블루 G-250의 양을 추가한다. </li></ol> 2. BN-PAGE <ol><li> 25 mL의 20 배 청색 기본 희석 (BN)이로 버퍼 스톡 (1.0 M 비스 - 트리스, 1.0 M 트리 신, pH를 6.8) 전기 영동 475 mL의 DH 1X 실행 완충액 500 mL로 0.002 % 쿠마시 블루를 함유하는 2 O. <ol><li> 샘플 세제를 포함하는 경우, 그 대신 0.02 %를 함유하는 쿠마 1X 실행 완충액 250 mL의 어느 것도 포함하지 않는 다른 250 mL로 만든다. </li></ol></li><li> 4 ℃로 냉각 완충액 (들). </li><li> 청소 및 제조업체의 지침에 따라 카세트를 붓는 폴리 아크릴 아마이드 젤을 조립. </li><li&gt; 표준 제조법 7 항 BN 폴리 아크릴 아미드 겔 (3 % T 적층 층, 6 % T 해결 층)을 붓고 잘 빗 놓는다. </li><li> 겔을 중합 후에 DH 2 O와 카세트 헹구고 제조사의 지시에 따라 전기 영동 장치를 조립한다. </li><li> 잘 빗를 제거하고 1 배 BN-PAGE 실행 버퍼로 우물을 입력합니다. 샘플이 로딩 될 때까지 버퍼에 전체 내부 챔버를 채우기 피한다. <ol><li> 샘플 세제를 포함하는 경우, 0.02 % 코마시 블루를 함유하는 완충액으로 각 웰을 채운다. 참고 : 4 ° C에서 단계 2.7-2.9를 수행합니다. </li></ol></li><li> 겔 로딩 정보를 사용하여, 목적하는 웰에 20 μg의 단백질을 함유하는 균질 부피 피펫. 미사용 웰로 1X BN-PAGE 샘플 버퍼의 등가 부피 피펫. 참고 :에 추가 균질의 적절한 볼륨을 계산하기 위해 BCA 분석에서 결정된 단백질 농도를 사용하여우물. </li><li> 샘플이 로딩 된 후, 1X BN-PAGE 주행 완충액 내부 챔버를 채운다. 젤이 완전히 버퍼에 빠져들되어 있는지 확인합니다. 다음에, 제조자에 의해 지시 된 레벨로 1X 주행 완충액 외부 챔버를 채운다. <ol><li> 샘플 세제를 포함하는 경우, 0.02 % 코마시 블루를 함유하는 1X 버퍼, 염료 무 1X 런닝 버퍼와 외부 챔버와 내부 챔버를 채운다. </li></ol></li><li> 전원 공급 장치에 전극을 연결하고, 상기 염료 밴드 층으로 해결 ~ 2cm까지 진행됨에 150 V의 겔의 단백질 electrophorese. 중지하고 전원 공급 장치를 분리합니다. </li></ol> 3. 교차 연결 참고 : 4 ° C에서 단계를 3.1-3.6를 수행합니다. <ol><li> 전기 영동 장치를 분해 및 겔 카세트의 유리창을 분리한다. 제거하고 스태킹 층을 버린다. </li><li> 조심 다만 염료 전면의 하단 아래에 겔을 잘라. 갖다이 컷은 같은 부드럽고 똑바로 가능하도록 배려하고 젤의 사용하지 않는 부분을 폐기합니다. 이는 균질 샘플의 모든 단백질을 포함 폭 ~ 2cm, 폴리 아크릴 아마이드 젤의 수평 스트립을 떠날 것이다. </li><li> 겔 스트립의 가장자리에 따라 사용되지 않은 부분을 잘라. </li><li> 조심스럽게 작은 용기에 10 ㎖의 인산염 완충 식염수 (PBS)로 스트립을 배치하고 부드럽게 평형 30 분간 장동 섞는다. </li><li> 평형화 후 폐기하고 다른 10 ㎖ PBS로 대체. 피펫 500 μL의 25 mM의 DSP는 PBS로 디메틸 술폭 시드에 용해하고, 30 분 동안 상기와 같이 (단계 34) 계속 혼합한다. </li><li> 는 DSP 솔루션을 붓고. DSP 미 반응을 종결 2 % 소듐 도데 실 설페이트 (SDS)를 포함 0.375 M 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 히드로 클로라이드 (트리스 - 염산)의 pH 8.8, 10 ㎖의 추가. 15 분 동안 장동를 계속합니다. </li></ol> 4. SDS-PAGE <ol><li> 겔 스트립 급랭되지만, SDS-PA를 제조표준 방법에 따라 9 GE 겔 용액. 중합 시약을 추가하지 마십시오. </li><li> 급냉 후, 실온 ΒΝ 겔 스트립 돌아가서 새로운 카세트로 겔 스트립 캐스팅. <ol><li> 이렇게하려면 신중 젤을 선택하고 깨끗한 젤 카세트 스페이서 플레이트에 배치합니다. </li><li> 오리엔트 염료 앞의 바닥 즉, BN-PAGE 동안에 가장 멀리 이동 측이 새로운 카세트의 상단에 가까운되어야 새로운 카세트 상부 (가장 가깝도록 스트립; 겔 스트립이 종래로부터 대칭되어야 정위). 그림 3을 참조하십시오. </li><li> 상단 모서리에도 상기 커버 플레이트의 상부 에지가되는 위치에 놓여 지도록 배치 스트립 (즉, 그것은 새 겔의 정상에있을 것이다). 염료 전면 유리판의 수평 에지에 평행 확인. </li><li> t에 공간을두고 이격 벽 중 하나에 대해 절개 띠의 한쪽을 눌러젤 그 반대편 부어하고 단백질 표준 또는 사다리를로드한다. </li><li> 겔 스트립의 하단은 어떤 고르지 않거나 고르지 영역을 포함하는 경우, 신중하게 버려야. 존재하는 경우, 그들은 겔 중에 트랩 기포 주입한다. </li><li> 겔 스트립이 정확하게 위치되면, 스페이서 플레이트 위에 커버 플레이트를하다. 어떤 갇힌 공기 방울을 밀어 부드러운 압력을 적용합니다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 젤 주입 장치를 조립하기 위해 계속합니다. </li></ol></li><li> 분해능 겔 버퍼 중합 시약을 추가하고 혈청 피펫을 사용하여 제조 된 겔 카세트로 붓는다. 스택 층을위한 공간을 떠나, 절제된 BN-PAGE 젤 스트립 아래 ~ 2cm로 겔 카세트를 채 웁니다. </li><li> 부어 겔의 정상에 100 μL 부탄올을 추가하고 해결 층의 중합을 30 분을 허용한다. 부탄올을 붓고. </li><li> 스태킹 겔 용액에 중합 시약을 추가합니다. serolog 사용피펫의 iCal 겔 카세트 나머지 빈 공간을 채우도록 적층 층을 붓는다. <ol><li> 이 겔 스트립 아래의 공간을 채우고, 기포가 트랩되지 않도록 적층 층 붓고 같이 겔 카세트 틸트. </li><li> 스태킹 겔 버퍼 겔 스트립 아래의 빈 공간을 채우는 같이 서서히 레벨에 기초 겔 카세트를 반환한다. </li><li> 거의 오버 플로우 할 때까지 옆에 스태킹 겔 버퍼로 적출 된 젤 스트립에 빈 공간을 채우기 위해 계속합니다. </li></ol></li><li> 적층 층을 30 분 동안 중합하도록 허용. 주 : 겔 중합 동안 10 배 SDS-PAGE에서 러닝 완충액 (250 개 mM의 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 (트리스), 1.9 M 글리신, 1 % SDS)을 확인. 이것은 또한 미리 만들어 실온에서 저장 될 수있다. </li><li> 1X 작업 버퍼를 만들기 위해 450 mL의 DH 2 O에 50 mL의 10 배 SDS-PAGE 실행 버퍼 주식을 희석. </li><li> 적층 층을 중합 한 후, 겔로부터 주입 카세트 삭제장치는 DH (2) O로 세정하고, 제조자의 지시에 따라 전기 영동 장치를 조립한다. </li><li> 그 제조자에 의해 지정된 레벨로 외부 챔버를 채우 1X SDS-PAGE에서 러닝 완충액으로 완전히 내부 챔버를 채운다. </li><li> 다음 분자량 래더 또는 적절한 단백질 표준 적출 겔 스트립 공간로드. </li><li> 전원 공급 장치에 전극을 부착하고, 쿠마시 염색이 겔을 실행하면 (120)에서 V. 샘플 electrophorese 중지하고 전원을 분리. </li><li> (10) 결합 항체 및 단백질 electroblotting 검출의 표준 방법을 사용하여 겔 분석. </li></ol>

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</ol>

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단백질 - 단백질 상호 작용은 생물이 수행하는 모든 작업에 중요하다. 이 때문에, 그들은 강렬한 조사 및 연구의 주제이다. 다량 체-PAGE는 캡처 분리 및 단백질 복합체의 다양한 분석을위한 신규 한 방법이다. 우리는 이전에 질병 관련 단백질의 α-synuclein의 11 oligimerization 연구에의 적용 가능성을 증명하고있다. 그림 2에서 설명하지만, 그것은 많은 단백질 복합체로 확장합니다. 단백질 복합체를 연구하는 다른 방법에 비해, 다량 체-PAGE 때문에 단순성과 간결성 유리하다. 조직 샘플에서 시간은 완전히 SDS 겔은 약 8 시간이다 분리한다. 검출 일반적인 웨스턴 블롯에 의해 수행 될 수 있기 때문에, 프로토콜은 풀다운 실험과 관련된 것보다 훨씬 더 낮은 검출 한계와 변성 조직 파쇄물에서 수행 될 수있다. 또한, 대부분의 시설이 완비 된 분자 생물학 라보ratories는 작은 선행 투자와 기술을 수행 할 수 있습니다. 나중에 설명으로...

<html> 정상 세포 기능은 단백질 - 단백질 상호 작용 1, 2에 따라 달라집니다. 그 결과, 인간의 질병은 종종 다양한 단백질 복합체 (3)의 조립 및 행동 교란에 의해 표시된다. 이러한 상호 작용의 특성을 할 수있는 능력 때문에 중요하다. 이러한 상호 작용을 검출하는 수단은 현재 자주 상호 작용 파트너 풀다운 하였다 목적 단백질의 정제를 필요로한다. 통상적 인 정제를 차동 원심 분리, 침전, 및 / 또는 크로마토 그래피 (4)에 의해 달성된다. 이 방법은 시간이 많이 소요되어 각 대상 단백질을 변경해야합니다, 종종 낮은 수율을 초래한다. 현대 정제 방법은 포획 분자 (5)에 결합 된 비드 로케이션 컬럼에 면역 또는 추출하여 단백질을 표적으로하는 펩티드 태그의 융합을 포함이것은 많은 단백질 신성이지만 &quot;&gt; 6. 그것은 잠재적으로 보통 결합 파트너에 대한 친 화성이 다른 구조의 결과, 타겟의 순서 변경을 필요로한다. 일부 단백질 - 단백질 상호 작용에 민감한 성질은이 방법이 적용되지 않을 수 있음을 의미 많은 시나리오. 또한, 단백질 - 단백질 상호 작용을 매핑하는 데 사용 풀다운 분석으로 인해 자유와 미끼 단백질의 비 네이티브 수준의 제한된 도로, 정확한 세포 사진을 캡처 할 수 있습니다. 이상적으로, 단백질 복합체가 정화 또는 풀다운 할 필요없이, 그 나라의 상태를 검출 할 수있다. 블루 천연 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동법 (BN-PAGE)의 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동법 (SDS-PAGE)에 덜 변성 대안으로 개발 및 생체 시료 7의 일부 단백질 복합체의 분리를 허용 하였다. 그러나, BN-PAGE 단백질은 LAR에 기초하여 구분하기다른 분자 크기, 전하, 입체 구조, 및 결합을 포함한 변수의 GE 번호. 이러한 요소의 상호 작용은 종종 단백질의 공동 분리, 집계 형성, 가난한 단백질 밴드 해상도를 초래한다. 두 차원 네이티브 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동은 이러한 문제 8의 모든 일부를 해결 있지만. 기본 분리와 관련된 합병증을 피하기 위해, 일부 저자는 조직 해물 4 단백질 복합체를 캡처하는 등의 디티 오비스 (숙신 이미 딜 프로 피오 네이트)와 같은 아민 반응성 가교 시약 (DSP)를 사용합니다. 이 처리 해물을 다음 변성 및 단백질 복합체의 원래 크기와 메이크업을 유지하면서, SDS-PAGE에 의해 분리 될 수있다. 가교 시약이 조직 용해 액에 다른 한 분자의 근접성, 그리고 단백질을 기반으로 반응하기 때문에, 많은 자유도를 가지고 확률 적, 비특이적 배경 크로스를 상호 작용할 수 있습니다-linking 특히 농축 샘플에서 높을 수있다. 이 어려운-해석 결과로 이어질 수 있습니다. 여기서는 하이브리드 BN-PAGE / SDS-PAGE 법의 사용을 입증 분리 복잡한 혼합물에 단백질 어셈블리를 감지하는 멀티 머 - 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (다량 체-PAGE)을 불린다. 우선, 세포 용 해물을 통해 BN-PAGE 폴리 아크릴 아미드 겔에 현탁시킨다. 용 해물을 함유하는 겔은 가교 시약 DSP와 반응시킨다. 의사 고정화 약간 겔상에서 분리 된 단백질은 배경 가교제의 반응성이 감소 의미 훨씬 비특이적 반응 할 가능성이있다. 가교 후, 겔 밴드를 절제하고 SDS-PAGE로 분리 하였다. 생성 된 겔은 전형적 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동법과 연관된 임의의 수단에 의해 분석 될 수있다. 이 방법은 추가로 정제 또는 당기 다우 없이도 변성 조직 파쇄물에서 천연 단백질 복합체의 분리 및 검출을 허용엔.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&epsilon; - 아미노카프로산</td><td>시그마</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아미드</td><td>아크로스 유기물</td><td>164855000</td><td>독성.</td></tr><tr><td>아크릴아미드/비사크릴아미드 37.5:1(40%T 원액)</td><td>BioRad</td><td>161-0148</td><td>독성.</td></tr><tr><td>과황산 암모늄</td><td>시그마</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr>염소 <td>산타 크루즈 생명 공학</td>의<td>안티 토끼 IgG-HRP</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid assay kit</td><td>Thermofisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris</td><td>Sigma</td><td>B9754</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-1</td><td></td></tr><tr><td>화학발광 기판 키트</td>, <td>ThermoFisher</td><td>24078</td><td></td></tr>, <tr><td>Coomassie blue, G-250</td>, <td>Sigma-Aldrich,</td><td>B0770</td><td></td></tr>, <tr><td>Digitonin,</td><td>Sigma</td>, <td>D141</td>, <td>독성.</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>디티오비스(숙시니미딜프로피오네이트)</td><td>Thermo Scientific</td><td>22585</td><td></td></tr><tr><td>건조 무지방 우유</td><td>LabScientific</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>정지 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Thermofisher</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td>적정용. 신랄한.</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>A412-4</td><td>PVDF 멤브레인 활성화용. 유독.</td></tr><tr>토끼 <td>산타 크루즈 생명 공학</td><td>sc-7011-R</td><td></td>N, N, N', N', N'-테트라메틸에틸렌디아민 시그마 T9281<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>N,N'-메틸렌비스아크릴아미드</td><td>아크로스 유기</td>물 <td>16479</td><td>독성의 단</td></tr>클론 항 &알파;-시누클레인 IgG.<tr><td>NP40</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-872</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbate 20 (tween-20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>폴리비닐리덴 플루오라이드 전달막</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P3504</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Fisher Scientific</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 monobasic</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Thermo Scientific</td><td>88265</td><td></td></tr><tr><td>SDS 용액 (10% w/v)</td><td>BioRad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>도데실황산나트륨</td><td>Sigma</td><td>L37771</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기</td>성 <td>Fisher Scientific</td><td>BP329-1</td><td></td></tr><tr><td>트리신</td><td>시그마</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>트리스-HCl(0.5M 버퍼, pH 6.8)</td><td>BioRad</td><td>161-0799</td><td></td></tr><tr><td>트리스-HCl(1.5M 버퍼, pH 8.8)</td><td>BioRad</td><td>161-0798</td><td></td></tr><tr><td>이름</td><td>회사</td><td> 카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE Imagequant LAS 4000</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9558-10</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 마이크로플레이트 리더</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel Former + Stand</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로퓨지 22R 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2mL dounce 균질화기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex 믹서</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>초음파 조직 균질화기</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120220</td><td></td></tr></tbody></table>

다량 체-page : 생물학적 샘플에서 캡처하는 방법 및 해결 단백질 단지

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

정화 및 단일 단백질과 펩티드를 연구하는 많은 잘 개발 된 방법이 있습니다. 그러나, 대부분의 세포 기능들은 그들의 비공유 쉽게 정제 기술에 의해 교란 바인딩 때문에 조사하기 어려운 작용 단백질 복합체의 네트워크에 의해 수행된다. 이 작업은 안정화 이차원 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 사용하여 개질 된 조직으로부터 천연 단백질 복합체를 분리하는 방법을 설명한다. 조직 파쇄 액은 단백질 겔로 짧은 거리를 마이그레이션 될 때까지 전류를인가하고, 비 변성 청색 기본 폴리 아크릴 아미드 겔 상에 로딩된다. 이주 된 단백질을 함유하는 겔 조각은 절제하고 공유 단백질 복합체를 안정화 아민 반응성 가교 시약 디티 오비스 (숙신 이미 딜 프로 피오 네이트)와 함께 배양된다. 가교 결합 된 복합체를 포함하는 겔 스트립이어서 소듐 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔에 캐스팅되고, t그는 단지가 완전히 분리된다. 이 방법은 저렴하고 쉽게 배울 수 의미, 기술과 대부분의 분자 생물 학자들에게 친숙한 소재에 의존한다. 이 적절 매우 큰 단지를 분리하는 능력에 제한되고, 보편적으로 성공하지 않은 반면, 방법은 잘 연구 단지의 다양한 캡처 할 수 있었고, 관심이 많은 시스템에 가능성이 적용됩니다.

이 데모 실험에서 다량 체-PAGE는 전체 쥐의 뇌 해물을 시행 하였다. 얻어진 단백질 분리 diflouride 폴리 비닐 (PVDF) 멤브레인에 블 롯팅 한 후, 복합체를 형성하는 것으로 알려진 단백질에 대한 항체로 프로빙 하였다. 도 1은 두 가지 방법에 의해 프로토콜의 유효성을 나타낸다. 먼저, 가교 결합 단백질 가교 시약 형성된 관찰 고 분자량 종을 의미 환원제의 첨가에 의해 절단하고, 프로토콜 (도 1a)의 다른 구성 요소에 의한 아니라는 것을 입증 . 둘째, 가교 결합은 가교 결합은 단백질 복합체에 특이 겔에 가까우므로 임의의 반응성이 최소화된다는 것이다 의미 세제 (도 1b)의 첨가에 민감하다는 것을 보여준다. 그림 2는 방법은 RESP를 캡처 실패 보여줍니다그렇지 iratory 복합체 II 있지만, 수용성 및 막 결합 복합체 모두를 캡...

안정화 신규 이차원 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 결합 된 아민 반응성 단백질 가교제를 사용하여 변성 조직 파쇄물로부터 천연 단백질 복합체를 분리하는 방법 (PAGE) 시스템이 제공된다.

다량 체-PAGE : 생물학적 샘플에서 캡처하는 방법 및 해결 단백질 단지

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 연구자가 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 이용하여 조직 용해물에서 추출한 천연 단백질 복합체를 포집, 분리 및 분석할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 거의 천연 상태에 가까운 조건에서 불안정할 수 있는 단백질 결합을 안정화하여 식별 및 후속 분석이 가능하게 하므로 단백질을 연구하는 연구자들에게 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 일반적인 생물학적 방법을 사용하므로 널리 적용 가능하며, 개별 연구자의 목적에 맞게 조정할 수 있다는 점입니다.이 절차를 시작하기 위해, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 blue native polyacrylamide gel electrophoresis를 준비하십시오. 전극을 전원 공급 장치에 연결하고, 염색약 밴드가 분리층(resolving layer)으로 약 2cm 정도 진행될 때까지 150V에서 단백질을 전기영동하십시오. 이 시점에서 전기영동을 중단하고 전원 공급 장치의 연결을 해제하십시오.전기영동 장치를 분해한 후, 겔 카세트의 유리판을 분리하십시오. 스태킹 층(stacking layer)을 제거하여 폐기하십시오. 염색약 전선(dye front)의 하단 가장지리 바로 아래에서 겔을 조심스럽게 절단하되, 최대한 매끄럽고 직선으로 자르도록 주의하십시오.그런 다음, 사용하지 않은 겔 조각은 폐기하십시오. 겔 스트립 가장자리를 따라 사용하지 않은 부분은 잘라내십시오. 스트립을 작은 용기에 담긴 10 milliliters의 phosphate buffered saline에 조심스럽게 넣고, 평형을 맞추기 위해 30분 동안 가볍게 섞어줍니다.평형 도달 후, PBS를 버리고 다시 10 milliliters로 교체합니다. dimethyl sulfoxide에 용해된 25 millimolar DSP 500 microliters를 PBS에 피펫으로 넣고 이전과 동일하게 30분 동안 계속 혼합합니다. 30분 후, DSP 용액을 따라냅니다.반응하지 않은 DSP를 켄칭(quench)하기 위해 2% sodium dodecyl sulfate가 함유된 0.375 M HSCL 10 mL(pH 8.8)를 첨가합니다. 이 상태로 15분 동안 유지합니다. 겔 스트립이 켄칭되는 동안 표준 방법에 따라 SDS-PAGE 겔 용액을 준비합니다.중합 시약을 추가하지 마십시오. 퀜칭 후, blue native gel 스트립을 상온으로 되돌리고 새로운 젤 카세트에 스트립을 캐스팅하십시오. 이를 위해 젤을 조심스럽게 집어 깨끗한 젤 카세트 스페이서 플레이트 위에 배치하십시오.스트립의 방향을 이전과 반대로 뒤집어 염료 전선의 하단이 새 카세트의 상단에 가깝게 위치하도록 맞춥니다. 커버 플레이트의 상단 가장자리가 놓일 위치에 스트립의 상단 가장자리가 일치하도록 배치합니다. 염료 전선이 유리 플레이트의 가로 가장자리와 평행한지 확인하십시오.절단된 스트립의 한쪽 면을 스페이서 벽면 중 하나에 밀착시키되, 반대편에는 겔을 붓고 단백질 표준물질 또는 래더를 로딩할 수 있는 공간을 남겨둡니다. 겔 스트립의 하단 가장자리에 톱니 모양의 거칠거나 고르지 않은 부분이 있다면 조심스럽게 잘라냅니다. 겔 스트립이 정확하게 배치되면, 스페이서 플레이트 위에 커버 플레이트를 덮습니다.갇혀 있는 기포를 밀어내기 위해 가볍게 압력을 가합니다. 제조사의 지침에 따라 젤 주입 장치의 조립을 계속합니다. 상판을 배치할 때 젤 스트립이 가끔 밀릴 수 있습니다.스트립이 상단 플레이트 가장자리 밖으로 약간 나오게 두면 스패튤라로 조절하여 위치 어긋남을 수정할 수 있어 편리합니다. 중합 반응 시약을 분리 젤 버퍼에 첨가하고, 세롤로지컬 피펫을 사용하여 준비된 젤 카세트에 붓습니다. 적층층(stacking layer)을 위한 공간을 남겨두기 위해, 절단된 blue native PAGE 젤 스트립의 약 2cm 아래까지 젤 카세트를 채웁니다.그 다음, 부어놓은 겔 위에 부탄올 100 µL를 첨가하고, 부탄올을 따라내기 전 분리층(resolving layer)이 중합될 수 있도록 30분 동안 둡니다. 이어서, 스태킹 겔(stacking gel) 용액에 중합 시약을 첨가합니다. 세롤로지컬 피펫을 사용하여 겔 카세트의 나머지 빈 공간을 모두 채우도록 스태킹층(stacking layer)을 붓습니다.스태킹 층을 부을 때 젤 카세트를 기울여 젤 스트립 아래의 공간을 채우고 기포가 생기지 않도록 합니다. 스태킹 젤 버퍼가 젤 스트립 아래의 빈 공간을 채우면, 젤 카세트를 서서히 수평 상태로 되돌립니다. 절개된 젤 스트립 옆의 빈 공간이 거의 넘칠 때까지 스태킹 젤 버퍼를 계속해서 채웁니다.그 다음, 스태킹 층(stacking layer)이 30분 동안 중합되도록 둡니다. 스태킹 층의 중합이 완료되면, 주입 장치에서 젤 카세트를 제거하고 증류수로 헹군 후, 제조사의 지침에 따라 전기영동 장치를 조립합니다. 내부 챔버를 1x SDS-PAGE running buffer로 완전히 채웁니다.그 다음, 제조사가 지시한 수준까지 외부 챔버를 채웁니다. 절제된 겔 스트립 옆의 공간에 분자량 마커 또는 적절한 단백질 표준물을 로딩합니다. 전극을 전원 공급 장치에 연결하고 120V에서 샘플을 전기영동합니다.Coomassie 염료가 겔 밖으로 빠져나오면 전기영동을 중단하고 전원 공급 장치의 연결을 해제하십시오. 표준 전기 블로팅 및 항체 기반 단백질 검출 방법을 사용하여 겔을 분석하십시오. multimer-PAGE의 검증 과정이 여기에서 면역 블로팅을 통해 제시됩니다.포획된 키네신 복합체는 diphyo-3-itol에 의해 절단되며, 이는 고분자량 응집체가 더 작은 치환체들의 가교 결합으로 형성되었음을 보여줍니다. 여기에서는 SDS 또는 Triton의 농도를 높여 처리한 뇌 용해물에서 단량체 alpha-synuclein의 검출은 증가한 반면, 가용성 올리고머 사량체의 검출은 감소한 결과가 묘사되어 있습니다. 여기에서는 쥐 뇌 용해물 내의 가용성 복합체를 포획하기 위해 사용된 multimer-PAGE의 대표적인 결과가 제시되어 있습니다.단백질은 면역블롯을 통해 검출되었습니다. 각 단백질의 예상 단량체 분자량은 레인 하단에 표시되어 있습니다. 마찬가지로, 막 결합 복합체의 캡처 결과가 여기에 제시되어 있습니다.SDHA 호흡 복합체 II 블롯에서 나타난 것과 같이, Multimer-PAGE는 때때로 복합체를 제대로 포착하지 못하는 경우가 있습니다. 이에 대한 가능한 설명은 텍스트 프로토콜에서 확인할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하고 적절하게 수행한다면 약 8시간 만에 완료할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 천연 단백질 복합체의 인-겔(in-gel) 가교 결합을 수행하고, 이어서 겔 재주조 및 2차 SDS-PAGE를 통한 분리 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 아크릴아마이드를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로 겔을 주조하는 동안 반드시 개인 보호 장구를 착용해야 한다는 점을 잊지 마십시오. 이 절차에 따라 분리되어 안정화된 복합체는 겔에서 용출하거나 절단하여 추출할 수 있으며, 연구자의 필요에 따라 면역 검출 또는 질량 분석법을 포함한 다양한 방법으로 분석할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

세포 투과 crosslinker DSP [dithiobis - (succinimidyl 프로피 온산)] 일시적 안정화와 불안 정한 상호...

불안 정한 다중 단백질 단지의 분리에 의해 생체내에 제어 세포 간 연결 및 단백질 자기 동질 크로마 토그래피

이 비디오에서는, 우리는 푸른 원시의 polyacrylamide 겔 전기 영동 (BN - PAGE)에 의해 multiprotein의 단지 (MPCs)의 특성을 설명합니다. 첫 번째 차원에서 dialyzed 세포 lysates은 개별 MPCs을 식별할 BN - PAGE로 구분됩니다. 두 번째 차원 SDS - PAGE에 관심 MPCs은 더욱 immunoblotting하여 성분을 분석하기 위해 세분화됩니다.

셀룰러 Lysates에서 Multiprotein의 단지의 분석을 위해 블루 기본 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (BN - PAGE)

이 비디오는 조직 균질체에서 천연 단백질 복합체를 분리하기 위한 multimeric PAGE에 대해 설명합니다. 이 기술은 blue native-PAGE 및 SDS-PAGE 기술의 하이브리드입니다. 분리된 복합체는 세포 기능에서의 역할을 특성화하고 연구할 수 있습니다.

네이티브 단백질 복합체 분리를 위한 Multimer-PAGE: 조직 용해물에서 원형(intact) 멀티머 단백질을 분리하기 위한 블루 네이티브-PAGE와 SDS-PAGE로 구성된 하이브리드 분리 기법

여기에서는, 극저온 온도에서 고체 밀링에 의해 포유류 세포를 파괴 얻어진 세포 분말로부터 세포 추출물을 제조하고, 항체의 결합 마이크론 스케일 상자성 비드에 친 화성 포획하여 관심 단백질 복합체를 분리하는 프로토콜을 기술한다.

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

단백질 복합물의 건축은 그들의 기능을 위해 필수적입니다. 다양 한 대량 spectrometric 기법을 결합 하 여 그들의 어셈블리를 공부 하는 강력한 입증. 우리 화학 cross-linking 및 네이티브 질량 분석에 대 한 프로토콜을 제공 하 고 어떻게 이러한 상호 보완적인 기술을 다 소 단위 단백질 어셈블리의 구조를 명료 하 게 도움이 보여.

화학 Cross-linking 및 여러 소 단위 단백질 어셈블리의 건축을 그대로 단백질 복합물의 질량 분석

이 원고는 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 이 새로운 방법은 경쟁 바인딩 파트너와 함께 형성 된 복합물 뿐만 아니라 유엔 complexed 개별 단백질을 제외 하는 동안 특정 격리 및 어떤 두 상호 작용 단백질의 다운스트림 proteomic 특성화를 촉진 한다.

해 다중 단백질 신호 복합물 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 의해

단백질 대사 산물 및 단백질-단백질 상호 작용은 모든 세포 기능에 중요 한. 여기, 우리는 선택의 이러한 상호 작용 단백질으로의 병렬 분석을 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 식물 세포 배양에 대 한 최적화 되었습니다 및 질량 분석 기반 단백질 및 대사 산물 검출 친 화력 정화를 결합 했다.

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

마이크로톰을 이용한 다목적 저온 분석 BN-MS 프로토콜이 고분해능 복합체 프로파일링을 위해 제시된다.

BN-MS 분석에 의한 고분해능 컴플렉스 프로파일링

이 프로토콜은 질량 측광법과 새로운 미세유체역학 시스템을 결합하여 저친화성 단백질-단백질 상호 작용을 조사합니다. 이 접근법은 용액에서 고도로 농축된 복합체의 빠른 희석을 기반으로 하며, 이를 통해 저친화성 측정이 가능하고 질량 측광법의 적용 가능성이 넓어집니다.

Microfluidics와 질량 광도계를 결합하여 Micromolar 농도에서 단백질 복합체 형성 분석

배우세요 다량 체-PAGE를 이용하여 조직 용해액에서 천연 단백질 단지를 포착하고 분리하는 방법을. 이 기술은 불안정한 단백질 결합을 안정화하여 생화학 및 단백질체 연구에 활용할 수 있습니다.

다량 체-PAGE : 생물학적 샘플에서 캡처하는 방법 및 해결 단백질 단지

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