라이브 셀 Photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 세포에서 표적에 결합할 수 있는 광친화성 프로브를 사용하여 작은 분자의 결합 단백질을 식별하여 표적을 분리하고 식별할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 약물 또는 기타 작은 분자의 분자 작용 메커니즘을 밝히는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 타겟 단백질의 결합 및 공유 라벨링이 네이티브 세포 환경 내에서 발생하여 세포 용해 시 네이티브 단백질 구조 및 결합 조건을 방해할 위험을 제거한다는 것입니다.

원하는 수의 샘플에 대해 멸균 6cm 세포 배양 접시를 준비하여 이 절차를 시작합니다. 일반적으로 처리 조건당 한 접시의 세포가 사용됩니다. 이 시연을 위해 3개의 세포 접시가 준비되며, DMSO만(D로 표시), 프로브 처리만(P로 표시), 프로브 플러스 경쟁자(C.To 표시된 표기)를 사용한 음성 대조군은 4ml의 배양 배지에 350만 HEK 293 T 세포를 추가합니다.

세포를 밤새 배양합니다. 세포를 처리하기 전에 필요한 약물을 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 미리 분취합니다. 경쟁사 전처리의 경우, 2개의 튜브 각각에 4마이크로리터의 DMSO를 추가하고, 1개의 튜브에 10밀리몰 경쟁사 4마이크로리터를 추가합니다.

프로브 처리를 위해 하나의 튜브에 16마이크로리터의 DMSO를 추가하고 두 튜브 각각에 16마이크로리터의 15마이크로몰 광친화성 프로브를 추가합니다. 세포 배양 접시를 세포 배양 후드로 가져와 사전 분주된 약물을 추가합니다. 경쟁사 처리 접시에서 배양 배지 1ml를 흡인하고, 사전 분취된 경쟁 제품이 들어 있는 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고, 배지에 약물을 재현탁합니다.

배지와 약물 혼합물을 접시에 천천히 떨어뜨립니다. 같은 방식으로 DMSO를 음의 대조군 접시와 프로브 접시 모두에 추가합니다. 접시를 인큐베이터에 30분 동안 다시 넣습니다.

30분 후 접시를 문화 후드로 다시 가져와 조명을 어둡게 합니다. 사전 분주된 DMSO를 네거티브 대조군 접시에 추가하고 프로브를 프로브 및 경쟁 접시에 추가합니다. 접시를 1시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.

1시간 후 얼음 위에 접시를 놓습니다. 각 접시의 세포를 5ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 부드럽게 세척하여 여분의 프로브를 제거합니다. 4ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 다시 덮습니다.

자외선 램프 아래 3cm 깊이의 세포 접시를 얼음 팩 위에 올려 램프의 가열을 최소화하고 3 분 동안 조사합니다. 접시를 꺼내 얼음 위에 올려 놓습니다. 이런 식으로 모든 샘플을 조사합니다.

모든 샘플을 조사한 후 세포에서 PBS를 흡인하고 각 접시에 프로테아제 억제제가 포함된 얼음처럼 차가운 PBS 200마이크로리터를 추가합니다. 고무 스크레이퍼를 사용하여 접시에서 세포를 분리하고 얼음 위에 미리 표시된 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 각 샘플에 SDS를 최종 농도 0.4%로 추가하고, 현탁액을 10회 초음파 처리하고, 얼음에서 1분 동안 배양한 다음 또 다른 10회 펄스 동안 초음파 처리하여 세포를 용해합니다.

섭씨 95도로 설정된 열 블록에서 샘플을 5분 동안 끓여 세포 용해를 완료하고 모든 단백질을 변성시킵니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 각 샘플의 단백질 농도를 측정한 후 필요에 따라 PBS PH 8.5와 0.4%SDS를 추가하여 단백질 농도를 밀리리터당 2.5mg으로 정규화합니다. 이 절차를 시작하려면 이전 세그먼트에서 준비한 각 세포 용해물 40마이크로리터를 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

0.2 μliter of flour-azide, 0.58 microliters of TCEP, and 3.38 microliters of TBTA의 순서로 다음 시약을 추가합니다. 섞는 소용돌이. 1.14 마이크로 리터의 황산구리 5 수화물을 첨가하여 반응을 시작하십시오.

Vortex는 잠시 동안 실온에서 어둠 속에서 30 분 동안 배양합니다. 50마이크로리터의 2X SDS 샘플 버퍼를 추가하여 반응을 소멸시킵니다. SDS-PAGE 젤에 표본을 달리고, 염료 정면이 젤의 끝을 도달할 때, 과잉 unreacted flour-azide 전부가 젤에서 완전하게 밖으로 나갔다는 것을 지키기 위하여 5 분 동안 젤을 달리는 것을 계속하십시오.

여분의 밀가루 아지드를 모두 씻어낸 후 젤을 유리판에 놓고 제조업체의 지침에 따라 형광 젤 스캐너를 사용하여 젤을 스캔합니다. 비오틴 태그를 부착하려면 단백질 정규화 후 모든 샘플이 동일한 부피가 되도록 최대 양의 세포 용해물을 사용합니다. 50마이크로리터의 사전 세척된 고용량 스트렙타비딘 아가로스 비드가 들어 있는 새 튜브에 각 샘플을 추가하여 용해물을 미리 세척합니다.

섭씨 4도에서 1시간 동안 교대로 배양합니다. 원심분리로 비드를 펠렛화합니다. 얼음 위의 새 마이크로 원심분리기 튜브로 상층액을 제거하고 비드를 버립니다.

용해물 500마이크로리터당 비오틴-아지드 1.38마이크로리터, TCEP 5.5마이크로리터 및 TBTA 32.5마이크로리터 시약을 추가합니다. 섞는 소용돌이. 11 마이크로 리터의 용해물과 와류당 500 마이크로 리터의 황산구리 5 수화물을 간단히 추가합니다.

실온에서 30분 동안 배양합니다. 섭씨 20도로 냉각된 4가지 시료 부피의 아세톤을 첨가하고 시료를 와류로 처리한 다음 섭씨 80도에서 하룻밤 동안 배양하여 단백질을 완전히 침전시키고 미반응 비오틴-아지드를 제거합니다. 다음 날에, 침전된 단백질을 펠릿으로 만들기 위하여 15 분 동안 17, 000 x g에 표본을 4 섭씨 온도에 원심 분리하십시오.

상등액을 완전히 흡인하고 각 샘플에 150 마이크로 리터의 PBS PH 7.4 및 1 % SDS를 첨가하고 초음파 처리로 단백질을 재 용해시킵니다. 각 샘플에 PBS 600마이크로리터를 추가하여 SDS 농도를 0.2%로 희석한 다음 샘플을 30마이크로리터의 사전 세척된 고용량 스트렙타비딘 아가로스 비드가 들어 있는 새 튜브에 추가합니다. 섭씨 4도에서 1시간 동안 교대로 배양합니다.

1시간 후, 1000 x g에서 3분 동안 원심분리로 비드를 펠릿화합니다. 결합되지 않은 단백질을 포함하는 상등액을 흡인하고 버립니다. 비드에 세척 완충액 1ml를 추가하고 실온에서 5분 동안 교대로 배양합니다.

원심분리기를 사용하여 상층액을 버리고 세척액으로 다시 세척합니다. 최종 세척 후 비드에서 세척 버퍼를 완전히 흡입하고 30마이크로리터의 2X SDS 샘플 버퍼를 추가합니다. 섭씨 95도의 열 블록에서 5분 동안 배양하여 비드에서 단백질을 방출합니다.

비드를 13000 x g의 실온에서 1분 동안 원심분리합니다. SDS-PAGE를 위해 비드에서 단백질이 포함된 샘플 버퍼를 조심스럽게 피펫팅합니다. 형광성 꼬리표로 레테르를 붙이기 후에 단백질의 구상은, 이 형광성 주사한 젤에 의해 설명됩니다.

약 35킬로달톤의 주요 특이적 결합 단백질 띠는 프로브 레인에만 존재하며 과도한 모 화합물에 의해 경쟁합니다. 동일한 35 킬로달톤 띠는 비오틴 풀다운 후 은 염색으로 시각화되었으며, 이후 질량 분석법으로 막 단백질 VDAC1로 식별되었습니다. VDAC1에 대한 특정 항체를 사용하여 단백질의 정체를 추가로 검증했습니다.

신호는 프로브 레인에 존재하고 경쟁 레인에서 감소합니다. 입력 분획을 포함하면 항체가 작동하고 관심 단백질이 용해물에서 검출될 수 있습니다. 풀다운 샘플의 분자량이 약간 증가하는 것은 공동으로 부착된 프로브 때문입니다.

프로토콜의 특정 단계를 올바르게 수행하지 않을 경우의 결과가 설명되어 있습니다. 과도한 밀가루 아지드를 불완전하게 제거하면 형광 스캔 겔 바닥에 큰 검은색 얼룩이 생기고, 용해물의 사전 세척이 불충분하거나 비드가 세척되면 배경 염색이 매우 높은 은 염색 젤이 생성됩니다. 풀다운 실험은 처음부터 끝까지 완료하는 데 2-3일이 걸립니다.

표적 단백질을 분리하고 질량 분석법 또는 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 식별한 후, 약물 유도 표현형에 대한 표적의 관련성을 평가하기 위해 추가 표적 특이적 검증 실험을 수행해야 합니다.