라이브 셀 Photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별

본 절차의 전반적인 목표는 살아있는 세포 내에서 표적에 결합할 수 있는 광친화성 프로브(photoaffinity probe)를 사용하여 소분자의 결합 단백질을 식별함으로써, 이후 표적을 분리하고 확인하는 것입니다. 이 방법은 약물 또는 기타 소분자의 분자적 작용 기전을 규명하는 데 활용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 표적 단백질의 결합과 공유 결합 표지가 천연 세포 환경 내에서 이루어진다는 점이며, 이를 통해 세포 용해 시 천연 단백질 구조 및 결합 조건이 파괴될 위험을 제거할 수 있습니다.

원하는 샘플 수만큼 멸균된 6cm 세포 배양 접시를 준비하여 이 절차를 시작합니다. 일반적으로 처리 조건당 하나의 세포 배양 접시가 사용됩니다. 본 시연에서는 DMSO만 처리한 음성 대조군(D로 표시), 프로브만 처리한 군(P로 표시), 그리고 프로브와 경쟁자를 함께 처리한 군(C로 표시)까지 총 3개의 세포 배양 접시를 준비합니다. 각 배양 접시에 4mL의 배양액에 부유시킨 3.5 million개의 HEK 293 T 세포를 추가합니다.

세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 세포 처리 전에 필요한 약물을 1.5 milliliter 마이크로원심분리 튜브에 미리 분주합니다. 경쟁제 전처리를 위해, 두 개의 튜브 각각에 4 µL의 DMSO를 넣고, 하나의 튜브에 10 millimolar 경쟁제 4 µL를 넣습니다.

프로브 처리를 위해, 튜브 하나에 DMSO 16 µL를 넣고, 나머지 두 개의 튜브에 각각 15 µM 광친화성 프로브 16 µL를 넣습니다. 미리 분주된 약물을 첨가하기 위해 세포 배양 접시를 세포 배양 후드로 옮깁니다. 경쟁 처리 접시에서 배양액 1 mL를 흡입하여 미리 분주된 경쟁제가 들어 있는 마이크로원심분리 튜브로 옮긴 후, 배양액 내에서 약물을 재현탁합니다.

배지와 약물 혼합물을 접시에 천천히 한 방울씩 다시 첨가합니다. 동일한 방식으로, 음성 대조군 접시와 프로브 접시 모두에 DMSO를 첨가합니다. 접시들을 인큐베이터에 넣고 30분 동안 배양합니다.

30분 후, 배양 후드로 디쉬를 다시 옮기고 조명을 낮춥니다. 음성 대조군 디쉬에는 미리 분주해 둔 DMSO를 첨가하고, 프로브 디쉬와 경쟁 디쉬에는 프로브를 첨가합니다. 디쉬를 인큐베이터로 옮겨 1시간 동안 배양합니다.

1시간 후, 디쉬를 얼음에 넣습니다. 각 디쉬의 세포를 5 mL의 차가운 PBS로 부드럽게 세척하여 과잉 프로브를 제거합니다. 세포가 잠기도록 4 mL의 차가운 PBS를 다시 채웁니다.

램프로 인한 가열을 최소화하기 위해 아이스 팩 위에 놓인 UV 램프 3cm 아래 중앙에 세포 배양 접시를 위치시키고 3분 동안 조사합니다. 접시를 꺼내어 얼음 위에 놓습니다. 이러한 방식으로 모든 샘플을 조사합니다.

모든 샘플의 조사를 마친 후, 세포에서 PBS를 흡입하여 제거하고 각 디쉬에 프로테아제 억제제가 포함된 얼음처럼 차가운 PBS 200 microliters를 첨가합니다. 고무 스크레이퍼를 사용하여 디쉬에서 세포를 떼어내고, 얼음 위에 놓인 미리 라벨링된 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 각 샘플에 SDS를 첨가하여 최종 농도가 0.4%가 되게 합니다. 현탁액을 10회 펄스로 초음파 처리하고, 얼음 위에서 1분간 배양한 후, 다시 10회 펄스로 초음파 처리하여 세포를 용해합니다.

세포 용해를 완료하고 모든 단백질을 변성시키기 위해 95 °C로 설정된 히트 블록에서 샘플을 5분 동안 가열합니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 각 샘플의 단백질 농도를 측정한 후, 필요에 따라 PBS pH 8.5 및 0.4% SDS를 추가하여 단백질 농도를 2.5 mg/mL로 표준화합니다. 이 절차를 시작하려면 이전 단계에서 준비한 각 세포 용해물 40 µL를 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

다음 시약을 순서대로 0.2 µL의 flour-azide, 0.58 µL의 TCEP, 3.38 µL의 TBTA 순으로 첨가하십시오. Vortex로 혼합합니다. 반응을 시작하기 위해 1.14 µL의 copper sulfate pentahydrate를 첨가하십시오.

잠시 동안 볼텍싱한 후, 암실의 상온에서 30분간 배양합니다. 반응을 정지시키기 위해 2X SDS 샘플 버퍼 50 µL를 첨가합니다. 샘플을 SDS-PAGE 겔에서 전기영동하고, 염색약 전선(dye front)이 겔 끝에 도달하면, 반응하지 않고 남은 과량의 flour-azide가 겔 밖으로 완전히 배출되도록 5분 더 전기영동을 진행합니다.

남은 모든 flour-azide를 씻어낸 후, 겔을 유리판 위에 놓고 제조사의 지침에 따라 형광 겔 스캐너를 사용하여 겔을 스캔합니다. 비오틴 태그 부착을 위해서는 단백질 정규화 후 최대량의 세포 용해물을 사용하여 모든 샘플의 부피가 동일하게 합니다. 미리 세척된 50 µL의 고용량 streptavidin agarose beads가 들어 있는 새 튜브에 각 샘플을 넣어 용해물을 프리클리어링(preclear)합니다.

4 °C에서 1시간 동안 회전시키며 배양합니다. 원심분리를 통해 비드를 침전시킵니다. 상층액을 얼음 위에 둔 새로운 마이크로원심분리 튜브로 옮기고 비드는 폐기합니다.

용해물 500 µL당 biotin-azide 1.38 µL, TCEP 5.5 µL, TBTA 32.5 µL의 시약을 첨가합니다. 볼텍싱하여 혼합합니다. 용해물 500 µL당 copper sulfate pentahydrate 11 µL를 첨가하고 짧게 볼텍싱합니다.

실온에서 30분 동안 배양합니다. 20 °C로 냉각된 아세톤을 시료 부피의 4배량 추가하고, 시료를 볼텍싱한 후 80 °C에서 하룻밤 동안 배양하여 단백질을 완전히 침전시키고 반응하지 않은 biotin-azide를 제거합니다. 다음 날, 4 °C에서 17,000 x g로 15분 동안 원심분리하여 침전된 단백질을 펠렛으로 만듭니다.

상층액을 완전히 흡입하여 제거하고, 각 샘플에 150 µL의 PBS pH 7.4 및 1% SDS를 첨가한 후 초음파 분쇄(sonication)를 통해 단백질을 재용해합니다. 각 샘플에 600 µL의 PBS를 추가하여 SDS 농도를 0.2%로 희석한 다음, 이를 미리 세척된 30 µL의 고용량 streptavidin agarose beads가 들어 있는 새 튜브에 넣습니다. 4 °C에서 회전시키며 1시간 동안 배양합니다.

1시간 후, 1000 x g에서 3분 동안 원심분리하여 비드를 침전시킵니다. 결합되지 않은 단백질이 포함된 상층액을 흡입하여 제거합니다. 비드에 1 mL의 세척 버퍼를 가하고, 실온에서 회전시키며 5분 동안 배양합니다.

원심분리 후 상층액을 제거하고, 세척 버퍼로 다시 세척합니다. 마지막 세척 후 비드에서 세척 버퍼를 완전히 흡입하여 제거하고, 2X SDS 샘플 버퍼 30 µL를 첨가합니다. 95 °C 가열 블록에서 5분 동안 배양하여 비드로부터 단백질을 용출시킵니다.

비드를 실온에서 13000 x g로 1분 동안 원심 분리합니다. SDS-PAGE를 위해 비드에서 단백질이 포함된 샘플 버퍼를 조심스럽게 피펫으로 옮깁니다. 형광 태그로 라벨링한 후의 단백질 시각화 결과는 이 형광 스캔 젤에 나타나 있습니다.

약 35 kilodaltons에서 나타나는 주요 특이 결합 단백질 밴드는 프로브 레인(probe lane)에서만 관찰되며, 과량의 모화합물에 의해 경쟁적으로 제거됩니다. 동일한 35 kilodalton 밴드가 비오틴 풀다운(biotin pulldown) 후 은 염색(silver staining)을 통해 시각화되었으며, 이후 질량 분석법을 통해 막 단백질인 VDAC1로 확인되었습니다. 해당 단백질의 정체는 VDAC1 특이 항체를 사용하여 추가로 검증되었습니다.

신호가 프로브 레인에서는 나타나며, 경쟁 레인에서는 감소합니다. 입력 분획(input fraction)을 포함함으로써 항체가 정상적으로 작동하며 용해물 내에서 목적 단백질이 검출될 수 있음을 확인합니다. 풀다운 샘플의 분자량이 약간 증가한 것은 공유 결합된 프로브 때문입니다.

프로토콜의 특정 단계를 올바르게 수행하지 않았을 때의 결과를 보여줍니다. 과잉의 flour-azide가 완전히 제거되지 않으면 형광 스캔 젤의 바닥 부분에 커다란 검은색 번짐이 나타나며, 용해물의 프리클리어링(preclearing)이나 비드 세척이 불충분하면 은 염색 젤에서 매우 높은 배경 염색이 나타납니다. 풀다운(pulldown) 실험은 시작부터 끝까지 완료하는 데 2~3일이 소요됩니다.

질량 분석법이나 웨스턴 블로팅을 통해 표적 단백질을 분리하고 확인한 후에는, 해당 표적이 약물로 유도된 표현형과 어떤 관련이 있는지 평가하기 위해 추가적인 표적 특이적 검증 실험을 수행해야 합니다.