Name: 라이브 셀 Photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 배우세요 생세포 포토어피니티 라벨링을 이용한 소분자 결합 단백질 식별 방법입니다. HEK 293 T 세포에서 기본 세포 환경을 유지하며 약물 작용 기전을 규명하는 신뢰할 수 있는 기술입니다.

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광친화성 라벨링 프로토콜의 설계에 대한 조언을 해주신 Ben Nacev 박사님, 이트라코나졸 광친화성 프로브를 합성해 주신 Wei Shi 박사님, 친화성 풀다운 실험에 대한 조언을 해주신 Yongjun Dang 박사님, 그리고 도움이 되는 의견과 지원을 해주신 J.O.L. 연구소의 다른 구성원들에게 감사드립니다. 이 작업은 약리학/독성학 분야의 PhRMA 재단 펠로우십(S.A.H.로)의 일부 지원을 받았습니다. 국립 암 연구소 보조금 R01CA184103; 승무원 의료 연구소(Flight Attendant Medical Research Institute); 전립선암 재단(J.O.L.); 존스 홉킨스 임상 및 중개 연구 연구소(Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research)는 NCATS(National Center for Advancing Translational Sciences)의 UL1 TR 001079 보조금으로 부분적으로 자금을 지원합니다.

참고 :이 프로토콜은 살아있는 세포에 사용 맥키와 톤턴 (10)에서 적응했다. 배양 된 세포의 1. 준비 <ol><li> (아래 참조) 원하는 샘플 수에 대한 멸균 6 cm 세포 배양 접시를 준비합니다. 주 : 셀들 중 하나 접시가 처리 조건에 따라 사용되지만, 더 많은 단백질이 2 또는 3 요리 상태별로 준비하고, UV 조사 후 결합 될 수있다 요구되는 경우. <ol><li> 세포의 최소 3 요리를 준비; DMSO 만 (D) 프로브 처리 만 (P)과 프로브 + 경쟁 (C)와 음성 대조군. </li><li> 선택적으로, 아니 UV 컨트롤로 4 번째 접시, 프로브로 치료하지만 자외선에 노출되지 할 준비를합니다. 주 : 여러 경쟁 분자는 관심 소분자 다른 유사체로서 시험 할 경우, 필요에 따라 추가로 경쟁 판을 준비한다. </li></ol></li><li> 4 ml의 배양 배지에서 배양 접시에 HEK293T 세포를 추가합니다. 350 만 C를 사용하여접시 당 ELL 학생. 주 : 셀은 실험 시작시 약 100 % 컨 플루 언트되도록 세포의 수가 최대 단백질 수율을 달성하기 위해, 각 세포 유형에 대해 결정되어야한다. HUVEC를 들어, 접시 당 0,300,000 세포를 사용합니다. 좋은 근사 합류 15cm 접시에 세포의 1/10이다. HEK293T 세포에서 배양한다 둘 베코 변형 이글스 중간 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충. </li><li> 문화 인큐베이터로 세포를 반환 (37 ° C, 5 % CO 2) 하룻밤. </li></ol> 세포 및 광 가교 2. 치료 <ol><li> 다음 날, 미리 나누어 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 다음 약물 : <ol><li> 첫 번째 치료를 위해, 2 관 1 관 10 mM의 경쟁자 (즉, 수정되지 않은 모 화합물)의 4 μL에 DMSO의 4 μl를 추가합니다. </li><li> 두 번째 치료를 위해, 1 관 DMSO의 16 μl를 50 &amp; 16 μl를 추가# 181; 2 관에 M의 photoaffinity 프로브. 주 : 최적 농도는 다른 프로브 (설명을 참조)에 대해 상이 할 수 있지만, 200 ~ 500 nm의 사이에서 좋은 출발점 (여기에서는 200 nm의 사용)이다. 경쟁자의 농도는 프로브 최소 20 배 (여기에 우리가 10 μM 사용)의 초과한다. DMSO의 최종 농도는 모든 판에서 동일해야하며, 0.5 % (20 μL 볼륨)를 초과하지 않아야합니다. </li></ol></li><li> 세포 배양 후드로 셀 플레이트를 가지고 다음과 같이 단계 2.1.1에서 프리 분주 약물을 추가 배양액 대기음 1ml를 상기 배지에서 미리 분주 약물을 재현 탁하고, 가볍게 플레이트 강하로 다시 추가 슬기로운. DMSO를 (D) 플레이트와 프로브 (P) 판에 DMSO를 추가하고, 경쟁 (C) 판에 참가자를 추가합니다. 30 분 동안 배양 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다. </li><li> 흐리게 문화 후드에서 조명과 함께, 조사 단계 2.1.2에서 미리 분주 프로브를 추가 (P)과 경쟁 (C) 판과 추가상기와 DMSO (D) 판 DMSO. 1 시간 동안 배양 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다. </li><li> 배양하는 동안, 다음 항목을 준비; 판을 모두 들어갈 수있는 얼음 트레이; 빙냉 용해 완충액 (PBS [pH를 8.5] + 1X 프로테아제 억제제 칵테일 [완전 EDTA없는 물로 이루어진 50X 원액으로부터 희석] 200 μL / 플레이트); 마이크로 원심 튜브를 얼음에, 다른 처리 조건들 각각에 대해 D, P, 또는 C로 표시. </li><li> 1 시간 배양이 끝나기 전에 15 분, 추운 방에 UV 램프 (365 나노 미터)를 설정하고 전구를 따뜻하게 전원을 켭니다. </li><li> 프로브와 1 시간 배양 한 후, 얼음에 요리를 놓습니다. 여분의 프로브를 제거하고 부드럽게 5 ml의 얼음처럼 차가운 PBS (PH 7.4)로 세포를 씻으십시오. 4 ml의 빙냉 PBS로 세포를 다시하면-커버. </li><li> 램프의 발열을 최소화하기 위해 얼음 팩의 상단에 UV 램프에서 3cm를 중심으로 세포의 요리를 놓습니다. 3 분 동안 조사. 얼음 트레이에 접시를 제거하고 모든 샘플에 대해 반복합니다. </li><li> 에이따고 조사는 세포에서 PBS를 대기음하고 각 플레이트에 단백질 분해 효소 억제제와 얼음처럼 차가운 PBS (PH 8.5)의 200 μl를 추가합니다. 얼음에 미리 라벨링 마이크로 원심 튜브 고무 스크레이퍼 및 전송을 사용하여 플레이트로부터 세포를 분리. </li><li> (샘플 250 μL에 10 % SDS 10 μL)에 0.4 %의 최종 농도로 SDS를 추가한다. 주의 : SDS 분말은 위험합니다. 코와 입을 통해 마스크를 착용하여 SDS 분말을 흡입하지 마십시오. </li><li> 10 펄스를 Lyse (출력 1, 듀​​티 사이클 30 %)를위한 현탁액을 초음파 처리하고 10 펄스의 두 번째 라운드 전에 1 분 동안 얼음에 부화하여 세포. </li><li> 필요한 경우 현탁액 2 μL를 제거하고 전체 세포 용해를 확인하기 위해 광학 현미경 검사. </li><li> 세포 용해를 완료하고 모든 단백질 변성을 5 분 동안 95 ℃로 설정 한 핫 플레이트에 샘플을 끓인다. </li><li> 이러한 번째로, 분광 세제 대응의 단백질 분석을 이용하여 각 샘플의 단백질 농도를 측정750 nm에서 흡광도를 측정하도록 설정된 분광 광도계 제조업체의 지시에 따라 전자 DC 단백질 분석 19. </li><li> 필요 PBS pH를 8.5 + 0.4 % SDS를 첨가하여 2.5 ㎎ / ㎖로 단백질 농도를 정상화 (또는 농도 인 경우보다 낮은 2.5 ㎎을 / ㎖, 가장 낮은 단백질 농도 시료 정상화) (예를 들어, 샘플 5 있다면 250 μL의 ㎎ / ㎖는) 2.5 mg / ml의 최종 농도를 얻기 위해 PBS pH를 8.5 + 0.4 % SDS 250 μL를 추가한다. </li></ol> 레이블이 단백질의 시각화를 클릭 화학에 의한 형광 태그 3. 첨부 파일 <ol><li> 새의 microcentrifuge 튜브에 세포 용 해물 및 전송의 40 μl를 제거합니다. 비오틴 - 아 지드 (4 단계)과의 반응에 대한 나머지 해물을 유지합니다. </li><li> 순서대로 다음과 같은 시약을 추가 : 0.2 μL의 불소 - 아 지드 (DMSO의 1 mM의 원액), 0.58 μL의 TCEP (100 mM의 주식을 물에 수산화 나트륨을 첨가 4 당량, 신선한 준비), 및 3.38 μl를 TBTA (1.4 7 밀리미터 재고 : DMSO에 t- 부탄올의 1 비율). 소용돌이는 혼합한다. </li><li> 반응을 시작합니다 1.14 μl를 -5H 2 O (물에 50 mM)을 CuSO 4를 추가합니다. 간단히 와동과 어둠 속에서 30 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 반응을 종결 배 SDS 샘플 버퍼의 50 μl를 추가합니다. 이 시점에서 하룻밤 필요한 경우 -20 ° C에서 최상의 결과를, 또는 상점에 대한 SDS-PAGE 겔 (20)에 직접 샘플을 실행합니다. </li><li> 샘플을 동결하면 겔 상에 로딩하기 전에 95 ℃에서 5 분 동안 가열한다. 주 : 목적 단백질의 분자량은 일반적으로이 단계에서 공지되어 있지 않기 때문에, 그것은 다른 아크릴 아마이드 농도가이 겔을 실행하는 것이 바람직하다 (즉, 8 % 및 15 %), 또는 넓은 분자량 범위 구배 겔 (즉, 4-15%)는 전체 분자량 범위를 확인합니다. </li><li> 염료 프론트 겔의 끝에 도달하면, 초과 unreacte 모두를 위해 추가로 5 분 동안 겔을 계속 실행할(D) 불소 지드 완전히 겔을 종료했다. </li><li> DDH 2 O와 컨테이너에 젤을 제거하고 멀리 모든 초과 불소 - 아 지드를 씻어, 부드러운 교반과 함께 10 분 동안 품어. </li><li> 유리 기판 상에 겔을 위치시키고 제조자의 지시에 따른 형광 태풍 겔 스캐너를 사용하여 겔을 검사한다. </li></ol> 레이블이 단백질의 선호도 정화를 클릭 화학에 의한 비오틴 태그 4. 첨부 파일 <ol><li> 단계 3.1에서 나머지 해물 중에서 후 정규화 2.5 ㎎ / ㎖ 얻어진 샘플 볼륨은 500, 550, 600 μL를 있으면 모든 샘플은 (예를 들어 동일한 양이되도록 단백질 정규화 이후 최대 크기를 사용하여, (500)을 사용하여 각각의 μL). </li><li> PBS (PH 7.4) 50 μL에 고용량 스트렙 아가 로스 비드, 예비 세척 된 배를 추가하여 용 해물을 미리 투명한. 회전 4 ° C에서 1 시간을 품어. </li><li> 3 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리하여 구슬을 펠렛. t을 제거그는 얼음에 새로운 microcentrifuge 관에 뜨는와 구슬을 버린다. </li><li> &quot;입력&quot;이라는 새로운 튜브에 DMSO 샘플의 1 ~ 2 %를 제거합니다. -20 ° C에서 2 배 SDS 샘플 버퍼와 저장소의 동등한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 해물의 500 μL 당, 다음과 같은 시약을 추가 : 1.38 μL 비오틴 - 아 지드 (DMSO에서 10 밀리미터 주), 5.5 μL TCEP, 32.5 μL의 TBTA합니다. 소용돌이는 혼합한다. </li><li> 11 μl를 간단히 해물과 소용돌이의 500 μL 당 -5H 2 O CuSO 4를 추가합니다. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션. </li><li> -20 ° C로 냉각 아세톤 4 샘플 볼륨을 추가합니다. 샘플 및 -80 ° C에서 밤새 품어 소용돌이 완전히 단백질을 침전과 미 반응 비오틴 - 아 지드를 제거합니다. </li><li> 원심 분리기는 4 ° C에서 15 분 동안 17,000 XG에 샘플을 침전 된 단백질을 펠렛합니다. </li><li> 완전히 뜨는을 대기음, 150 μl의 PBS (산도 7.4) + 1 % SDS에서 초음파에 의해 단백질을 resolubilize. </li><li&gt; 0.2 %로 SDS의 농도를 희석하기 위해 PBS (산도 7.4) 600 μl를 추가합니다. </li><li> 30 μl를 미리 씻어 고용량 스트렙 타비 아가로 오스 비즈에 샘플을 추가하고 회전 4 ° C에서 1 시간을 품어. </li><li> 3 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리하여 구슬을 펠렛. 언 바운드 단백질 및 폐기를 포함 뜨는을 대기음. </li><li> 구슬로 세척 완충액 (400 mM의 염화나트륨, 50 mM 트리스, 0.2 % SDS, pH를 7.4) 1 ㎖를 추가하고 회전 실온에서 5 분 품어. </li><li> 반복 4.12 및 4.13 3 번 단계를 반복합니다. </li><li> 구슬에서 완전히 세척 버퍼를 대기음, 그리고 배 SDS 샘플 버퍼의 30 μl를 추가합니다. </li><li> 비즈에서 단백질을 분리하기 위해 95 ° C 열 블록에 5 분 동안 품어. </li><li> 실온에서 13,000 × g으로 1 분간에 비드를 원심 분리기. 주 :이 시점에서, 샘플을 SDS-PAGE를 실행할 준비가 될 때까지 -20 ℃에서 저장 될 수있다. 시료를 냉동하는 경우, 사용하기 전에 95 ℃에서 5 분 동안 가열한다. </li><li> 면밀히비드 오프 단백질을 포함하는 시료 완충액을 피펫 및 SDS-PAGE (20) 상에로드 (아래 중요한 고려 사항 참조). 비드 리 보일 필요 이상 동안 저장 될 수있다. 주 : 실버 염색에 의한 단백질의 검출을 위해, 더 나은 결과가 1 mm 두께의 겔을 사용하여 얻어진다. 밴드는 질량 분석 (MS) 분석을위한 실버 스테인드 겔에서 절단 할 경우, 멸균 솔루션에서 신선한 모든 시약을 준비하고 겔에 샘플들 사이에서 잘 빈 둡니다. 그 배경 단백질 감산 될 수 있도록, 프로브로부터 절단 차선마다 대역 병렬 슬라이스는 DMSO 차선에서 촬영한다. 웨스턴 블롯에 의해 단백질의 확인을위한 ID, 상기 SDS-PAGE 젤을 실행하는 경우에도 단계 4.4로부터의 입력 샘플을 로딩하는 것이 중요하다. </li><li> 표적 단백질 (들)을 감지하는 실버 염색 (21) 또는 웨스턴 블롯 (22) 중 하나의 표준 프로토콜을 따르십시오. </li></ol>

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약물의 세포 표현형가 알려진 기능에 따라 잠재적 인 대상을 좁힐하는 데 사용되는 하향식, 또는 상향식 (bottom-up), 대상 : 작은 분자의 목표를 확인하는 다른 방법은 크게 두 가지 범주로 분류 할 수 있습니다 화학 물질 또는 유전 적 수단 (3)에 의해 직접적으로 식별됩니다. 하향식 또는 표현형 연구 약물의 영향을 특정 세포 프로세스를 식별 할 수있다 (예를 들면, 전사 / 번역 / DNA 합성, 세포주기 블록 통로 활성화 / 금지 등 시그널링) 소분자의 궁극적 인 표현형을 기초 수도있는 그 과정에 관여하는 단백질에 대한 잠재적 대상 목록을 좁히는 데 도움이됩니다. 그러나, 하향식 접근법의 주요 단점은 이미 이러한 프로세스에 대해 알려진에 의존하므로, 그 기능 특징되지 않았거나 이전에 관여하는 것으로 설명되지 않은 표적에 대해 가압된다는 점이다주어진 프로세스이다. 상향식 접근 방식은 공정한 방식으로 직접 대상을 식별...

생리 활성 소분자 근본적 셀과 상호 작용하는 하나 이상의 &quot;대상&quot;분자, 가장 일반적으로 단백질의 기능을 변경함으로써 작동한다. 약물 발견에 때 활성 화합물 표현형 선별을 통해 발견되고, 그 화합물의 분자량이 타겟 (들)의 식별은 작용 화합물의 잠재적 부작용의 메커니즘을 이해뿐만 아니라 대한 잠재적으로 발견되지 중요 새로운 생물학 질병 모델을 기본 및 치료제 (1)의 새로운 기계적인 클래스의 개발을위한 방법을 포장. 목표 식별이 치료에 사용하고자하는 약물이 필요하지 않지만, 최근에는 신약 후보 검증 대상이 알려진 경우보다 투자 수익률을 수득 때문에 임상 시험에 성공하고, 가능성이 있음을 점점 인식되고있다 2. 따라서, 작은 식별하는 방법에 대한 관심이 증가되고있다분자 표적 단백질. 고전 목표 식별 실험은 일반적으로 관심의 작은 분자는 수지상에 고정화 비 결합 단백질을 씻어, 나머지 단백질 용출 3를 식별 한 후, 전체 세포 용 해물과 배양 친 화성 정제에 의존한다. 이 기술은 여러 개의 작은 분자들 (4)의 타겟을 식별하기 위해 사용되었지만, 여러 가지 이유로, 범용 대상 ID 방법으로 적합하지 않다. 먼저, 표적 단백질은 작은 분자에 결합하는 능력을 유지하기 위해 세포 용해시의 기본 형태를 유지해야한다. 이것은 종종 그들의 네이티브 환경에서 제거 된 후 구조적인 변화를 거쳐, 또는 단순히 집계 및 용액으로부터 침전 막 단백질, 특히 문제가 될 수 있습니다. 유지하면서 두 번째로, 작은 분자는 화학적으로는 수지에 고정화 될 수있는 방식으로 수정해야표적 단백질에 결합 할 수있는 능력. 이 수지에 고정되면 깊은 결합 포켓 따라서 작은 분자에 액세스 할 수 없게 될 수 있습니다. 셋째, 결합 친화력은 상호 작용이 어려운 낮은 친화력 상호 작용을 확인하기가 세정 단계 동안 유지되도록 충분히 높아야한다. 등의 pH, 이온 농도, 또는 다른 내인성 분자의 존재 넷째, 환경 조건은 셀 내의 공간적으로 다양하고 때로는 약물 표적 상호 작용을 전제되어있다. 따라서, 허용 시행 착오 상당량 필요로 할 수있는 셀의 외부 결합 유지하도록 적절한 조건을 찾아 내기. Photoaffinity 라벨링 소분자와 셀의 기본 문맥 내에서 타겟의 공유 결합을 허용함으로써 이러한 문제를 회피. 오히려 부피가 큰 수지 소분자 고정화보다 분자 대신 두 개의 작은 화학적 작용 g을 설치하도록 수정roups : 빛의 특정 파장의 조사 대상의 단백질에 공유 결합 가교를 할 수있는 광활성 부위 및 표적 단백질을 검출하고이어서 분리 할 수​​있는 리포터 기. 생균 프로브가 공유 결합하여 표적 단백질에 가교 및 프로브 단백질 복합체는 절연 그대로 상기 photoaffinity 프로브로 처리된다. 표적에 결합하는 프로브의 특이성은 모 화합물의 과량의 표적 단백질로 프로브의 결합 거리 경쟁하는 데 사용되는 병렬로 경쟁 실험을 수행함으로써 입증된다. photoaffinity 프로브의 설계 및 합성은 하나의 작은 분자에서 다른 매우 다양하고,이 프로토콜에 포함되지 않습니다; 그러나, 주제에 대한 몇 가지 훌륭한 토론 5-9을 발표했다. 주요 고려 presumab 따라서, 프로브는 모 화합물의 생물학적 활성을 유지한다는 것이다LY는 동일한 타겟 (들)에 대한 결합. 구조 활성 관계 (SAR) 시험은 분자의 일부가 생체 활성의 상실없이 변형 될 수 있는지 결정하기 위해 수행되어야한다. 다른 화학 그룹이 다양한 각각의 장단점이 10 diazirine 페논, 아릴 아 지드를 포함 광활성 가교제,로서 사용되어왔다. 마찬가지로, 프로브 - 결합 단백질을 분리하는 데 사용 된 여러 리포터 태그가있다. 리포터 그룹은 일반적으로 사용되는 바이오틴 또는 형광 태그와 같은 자신의 기능 일 수 있고, 이하와 생체 활성 (11)을 손상하는 것이 어려울 수 있다는 장점을 가지고있는 광 가교 공정과, 이후 상기 작용을 필요 전구체 일 수있다. 이 프로토콜에서, 우리는 diazirine의 광 가교기를 함유하는 photoaffinity 프로브, 및 구리 (I)을 통해 리포터 그룹의 부착 말단 알킨 -catalyz을 사용한에드 아 지드 - 알킨 샤프 - Hüisgen의 사이클로 (또는 클릭) 반응 12-15. 은 SAR 연구, 설계 및 합성을 조사하고, 이러한 연구의 결과는 다른 곳에서 16-18 발표되었다.

<table><tbody><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td><td>Life Technologies</td><td>20490</td><td>상쾌한 하루를 사용하십시오. 4eq NaOH로 물에 100mM 스톡을 준비합니다.</td></tr><tr><td>트리스 [(1- 벤질 -1H-1,2,3- 트리아 졸 -4- 일) 메틸] 아민 (TBTA)</td> <td>AnaSpec</td><td>63360-50&nbsp;</td><td>t-부탄올과 DMSO의 4:1 비율로 1.7mM 재고를 준비하고 -20&nbsp에 보관합니다. &deg;C입니다.</td></tr><tr><td>구리 황산염 (CuSO4&#8226; 5H2O)</td><td>랩켐, Inc.</td><td>LC13440-1</td><td>물에 50mM 재고를 준비하고 실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>Biotin-azide</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>AZ104-100 DMSO</td><td>에서 10 mM 재고를 준비하고, -20&nbsp; &deg;C입니다.</td></tr><tr><td>알렉사 플루어 647-아지드&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A10277</td><td>DMSO에 1 mM 재고를 준비하고, -20&nbsp에 저장; &deg;C입니다.</td></tr><tr><td>365nm UV lamp</td><td>Spectroline</td><td>FC100</td><td>자외선 차단 안경은 작동 중 착용해야 합니다.</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 정제, EDTA-free</td><td>Roche Life Science</td><td>11873580001</td><td>물에 50x 용액을 준비하고 -20&nbsp; &deg;C입니다.</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>Sonifier 250</td><td>출력 1, 듀티 30%로 설정합니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>형광 젤 스캐너</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>FLA 9500</td><td>적색 레이저를 사용하여 Alexa-fluor 647을 감지합니다.</td></tr><tr><td>세제 호환 Dc 단백질 분석 키트</td><td>Bio-Rad</td><td>5000112</td><td></td></tr><tr><td>고용량 Streptavidin Agarose 비즈&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>20359</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles 배지, 저포도</td>당 <td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885092</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청, 인증</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 용액</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>SDS Sample Buffer (2x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC2676</td><td></td></tr></tbody></table>

라이브 셀 photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

작은 분자의 분자 표적을 식별하는 것은 도전적이지만 그들의 작용 메커니즘을 이해하는 데 필요한 단계입니다. 다양한 소분자의 결합 단백질을 성공적으로 규명하기 위해 여러 표적 식별 방법이 개발되어 사용되었지만, 이러한 기술에는 특정 유형의 소분자-표적 상호 작용을 검출하는 데 적합하지 않은 단점이 있습니다. 특히, 세포 용해에 따라 구조가 교란될 수 있는 막 단백질의 상호 작용과 같이 네이티브 세포 조건에 의존하는 비공유 상호 작용은 친화성 기반 표적 식별 방법에 적합하지 않은 경우가 많습니다. 여기에서는 광불안정기를 포함하는 프로브를 사용하여 살아있는 세포의 환경 내에서 소분자 결합 단백질에 공유 가교를 하여 세포 용해 후 상호 작용을 유지할 필요 없이 표적 단백질을 검출 및 분리할 수 있는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 기초 생물학과 약물 발견의 맥락에서 알려지지 않은 메커니즘을 가진 생물학적으로 흥미로운 작은 분자를 연구하는 데 유용한 도구입니다.

여기에 표시된 결과는 이전에 16 게시 된 사용하는의 항진균제 이트라코나졸의 사진 친 화성 프로브를 얻었다. 이러한 결과는 성공적 35 kDa의 막 단백질 전압 가변 음이온 채널 1 (VDAC1)와 같은 주요 이트라코나졸 결합 단백질을 확인하기 위해 살아있는 세포 photoaffinity 라벨링 기술의 사용을 입증한다. 상기 프로토콜은 참가자 분자로서 photolabeling 및 변성 이트라코나졸 용 프로브를 사용하여 이트라코나졸 HEK293T 세포에서 수행 하였다. 설명 된 바와 같이 샘플을 제조 하였다 후, 이들은 분자량 단백질을 분리하기 위하여 SDS-PAGE를 실시 하였다. 왼쪽 분자량 마커 단위는 킬로 달톤 (kDa의)에있다. 첫 차선은 DMSO 제어 시료 (D)이며, 두 번째는 레인 프로브 샘플 (P)이고, 상기 제 차선 대전 샘...

여기에서는 광친화성 라벨링을 사용하여 소분자 결합 단백질을 식별하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 장점은 살아있는 세포 환경 내에서 표적 단백질의 결합 및 공유 라벨링이 발생하여 세포 용해 시 네이티브 단백질 구조 및 결합 조건을 파괴할 위험을 제거한다는 것입니다.

라이브 셀 Photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

본 절차의 전반적인 목표는 살아있는 세포 내에서 표적에 결합할 수 있는 광친화성 프로브(photoaffinity probe)를 사용하여 소분자의 결합 단백질을 식별함으로써, 이후 표적을 분리하고 확인하는 것입니다. 이 방법은 약물 또는 기타 소분자의 분자적 작용 기전을 규명하는 데 활용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 표적 단백질의 결합과 공유 결합 표지가 천연 세포 환경 내에서 이루어진다는 점이며, 이를 통해 세포 용해 시 천연 단백질 구조 및 결합 조건이 파괴될 위험을 제거할 수 있습니다.원하는 샘플 수만큼 멸균된 6cm 세포 배양 접시를 준비하여 이 절차를 시작합니다. 일반적으로 처리 조건당 하나의 세포 배양 접시가 사용됩니다. 본 시연에서는 DMSO만 처리한 음성 대조군(D로 표시), 프로브만 처리한 군(P로 표시), 그리고 프로브와 경쟁자를 함께 처리한 군(C로 표시)까지 총 3개의 세포 배양 접시를 준비합니다. 각 배양 접시에 4mL의 배양액에 부유시킨 3.5 million개의 HEK 293 T 세포를 추가합니다.세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 세포 처리 전에 필요한 약물을 1.5 milliliter 마이크로원심분리 튜브에 미리 분주합니다. 경쟁제 전처리를 위해, 두 개의 튜브 각각에 4 µL의 DMSO를 넣고, 하나의 튜브에 10 millimolar 경쟁제 4 µL를 넣습니다.프로브 처리를 위해, 튜브 하나에 DMSO 16 µL를 넣고, 나머지 두 개의 튜브에 각각 15 µM 광친화성 프로브 16 µL를 넣습니다. 미리 분주된 약물을 첨가하기 위해 세포 배양 접시를 세포 배양 후드로 옮깁니다. 경쟁 처리 접시에서 배양액 1 mL를 흡입하여 미리 분주된 경쟁제가 들어 있는 마이크로원심분리 튜브로 옮긴 후, 배양액 내에서 약물을 재현탁합니다.배지와 약물 혼합물을 접시에 천천히 한 방울씩 다시 첨가합니다. 동일한 방식으로, 음성 대조군 접시와 프로브 접시 모두에 DMSO를 첨가합니다. 접시들을 인큐베이터에 넣고 30분 동안 배양합니다.30분 후, 배양 후드로 디쉬를 다시 옮기고 조명을 낮춥니다. 음성 대조군 디쉬에는 미리 분주해 둔 DMSO를 첨가하고, 프로브 디쉬와 경쟁 디쉬에는 프로브를 첨가합니다. 디쉬를 인큐베이터로 옮겨 1시간 동안 배양합니다.1시간 후, 디쉬를 얼음에 넣습니다. 각 디쉬의 세포를 5 mL의 차가운 PBS로 부드럽게 세척하여 과잉 프로브를 제거합니다. 세포가 잠기도록 4 mL의 차가운 PBS를 다시 채웁니다.램프로 인한 가열을 최소화하기 위해 아이스 팩 위에 놓인 UV 램프 3cm 아래 중앙에 세포 배양 접시를 위치시키고 3분 동안 조사합니다. 접시를 꺼내어 얼음 위에 놓습니다. 이러한 방식으로 모든 샘플을 조사합니다.모든 샘플의 조사를 마친 후, 세포에서 PBS를 흡입하여 제거하고 각 디쉬에 프로테아제 억제제가 포함된 얼음처럼 차가운 PBS 200 microliters를 첨가합니다. 고무 스크레이퍼를 사용하여 디쉬에서 세포를 떼어내고, 얼음 위에 놓인 미리 라벨링된 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 각 샘플에 SDS를 첨가하여 최종 농도가 0.4%가 되게 합니다. 현탁액을 10회 펄스로 초음파 처리하고, 얼음 위에서 1분간 배양한 후, 다시 10회 펄스로 초음파 처리하여 세포를 용해합니다.세포 용해를 완료하고 모든 단백질을 변성시키기 위해 95 °C로 설정된 히트 블록에서 샘플을 5분 동안 가열합니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 각 샘플의 단백질 농도를 측정한 후, 필요에 따라 PBS pH 8.5 및 0.4% SDS를 추가하여 단백질 농도를 2.5 mg/mL로 표준화합니다. 이 절차를 시작하려면 이전 단계에서 준비한 각 세포 용해물 40 µL를 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.다음 시약을 순서대로 0.2 µL의 flour-azide, 0.58 µL의 TCEP, 3.38 µL의 TBTA 순으로 첨가하십시오. Vortex로 혼합합니다. 반응을 시작하기 위해 1.14 µL의 copper sulfate pentahydrate를 첨가하십시오.잠시 동안 볼텍싱한 후, 암실의 상온에서 30분간 배양합니다. 반응을 정지시키기 위해 2X SDS 샘플 버퍼 50 µL를 첨가합니다. 샘플을 SDS-PAGE 겔에서 전기영동하고, 염색약 전선(dye front)이 겔 끝에 도달하면, 반응하지 않고 남은 과량의 flour-azide가 겔 밖으로 완전히 배출되도록 5분 더 전기영동을 진행합니다.남은 모든 flour-azide를 씻어낸 후, 겔을 유리판 위에 놓고 제조사의 지침에 따라 형광 겔 스캐너를 사용하여 겔을 스캔합니다. 비오틴 태그 부착을 위해서는 단백질 정규화 후 최대량의 세포 용해물을 사용하여 모든 샘플의 부피가 동일하게 합니다. 미리 세척된 50 µL의 고용량 streptavidin agarose beads가 들어 있는 새 튜브에 각 샘플을 넣어 용해물을 프리클리어링(preclear)합니다.4 °C에서 1시간 동안 회전시키며 배양합니다. 원심분리를 통해 비드를 침전시킵니다. 상층액을 얼음 위에 둔 새로운 마이크로원심분리 튜브로 옮기고 비드는 폐기합니다.용해물 500 µL당 biotin-azide 1.38 µL, TCEP 5.5 µL, TBTA 32.5 µL의 시약을 첨가합니다. 볼텍싱하여 혼합합니다. 용해물 500 µL당 copper sulfate pentahydrate 11 µL를 첨가하고 짧게 볼텍싱합니다.실온에서 30분 동안 배양합니다. 20 °C로 냉각된 아세톤을 시료 부피의 4배량 추가하고, 시료를 볼텍싱한 후 80 °C에서 하룻밤 동안 배양하여 단백질을 완전히 침전시키고 반응하지 않은 biotin-azide를 제거합니다. 다음 날, 4 °C에서 17,000 x g로 15분 동안 원심분리하여 침전된 단백질을 펠렛으로 만듭니다.상층액을 완전히 흡입하여 제거하고, 각 샘플에 150 µL의 PBS pH 7.4 및 1% SDS를 첨가한 후 초음파 분쇄(sonication)를 통해 단백질을 재용해합니다. 각 샘플에 600 µL의 PBS를 추가하여 SDS 농도를 0.2%로 희석한 다음, 이를 미리 세척된 30 µL의 고용량 streptavidin agarose beads가 들어 있는 새 튜브에 넣습니다. 4 °C에서 회전시키며 1시간 동안 배양합니다.1시간 후, 1000 x g에서 3분 동안 원심분리하여 비드를 침전시킵니다. 결합되지 않은 단백질이 포함된 상층액을 흡입하여 제거합니다. 비드에 1 mL의 세척 버퍼를 가하고, 실온에서 회전시키며 5분 동안 배양합니다.원심분리 후 상층액을 제거하고, 세척 버퍼로 다시 세척합니다. 마지막 세척 후 비드에서 세척 버퍼를 완전히 흡입하여 제거하고, 2X SDS 샘플 버퍼 30 µL를 첨가합니다. 95 °C 가열 블록에서 5분 동안 배양하여 비드로부터 단백질을 용출시킵니다.비드를 실온에서 13000 x g로 1분 동안 원심 분리합니다. SDS-PAGE를 위해 비드에서 단백질이 포함된 샘플 버퍼를 조심스럽게 피펫으로 옮깁니다. 형광 태그로 라벨링한 후의 단백질 시각화 결과는 이 형광 스캔 젤에 나타나 있습니다.약 35 kilodaltons에서 나타나는 주요 특이 결합 단백질 밴드는 프로브 레인(probe lane)에서만 관찰되며, 과량의 모화합물에 의해 경쟁적으로 제거됩니다. 동일한 35 kilodalton 밴드가 비오틴 풀다운(biotin pulldown) 후 은 염색(silver staining)을 통해 시각화되었으며, 이후 질량 분석법을 통해 막 단백질인 VDAC1로 확인되었습니다. 해당 단백질의 정체는 VDAC1 특이 항체를 사용하여 추가로 검증되었습니다.신호가 프로브 레인에서는 나타나며, 경쟁 레인에서는 감소합니다. 입력 분획(input fraction)을 포함함으로써 항체가 정상적으로 작동하며 용해물 내에서 목적 단백질이 검출될 수 있음을 확인합니다. 풀다운 샘플의 분자량이 약간 증가한 것은 공유 결합된 프로브 때문입니다.프로토콜의 특정 단계를 올바르게 수행하지 않았을 때의 결과를 보여줍니다. 과잉의 flour-azide가 완전히 제거되지 않으면 형광 스캔 젤의 바닥 부분에 커다란 검은색 번짐이 나타나며, 용해물의 프리클리어링(preclearing)이나 비드 세척이 불충분하면 은 염색 젤에서 매우 높은 배경 염색이 나타납니다. 풀다운(pulldown) 실험은 시작부터 끝까지 완료하는 데 2~3일이 소요됩니다.질량 분석법이나 웨스턴 블로팅을 통해 표적 단백질을 분리하고 확인한 후에는, 해당 표적이 약물로 유도된 표현형과 어떤 관련이 있는지 평가하기 위해 추가적인 표적 특이적 검증 실험을 수행해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

SNAP - 태그와 클립 태그 단백질 라벨링 시스템은 라이브 세포에 대한 관심의 단백질, 형광 염료를 포함하여 분자의 특정 공유 결합 첨부 파일을 활성화합니다. 일단 복제된과 표현, 태그 단백질 다시 복제하지 않고도 수많은 스트림 애플 리케이션을위한 기판의 다양한 사용할 수 있습니다.

COS - 7 형광 라벨링는 라이브 셀 이미징에 대한 SNAP - 태그 퓨전 단백질 표현

단일 분자 추적과 함께 Photoactivated 현지화 현미경 (PALM)은 허용 라이브 대장균 세포에서 단백질-DNA 상호 작용의 직접 관찰 및 정량화.

Photoactivated 단일 분자 추적을 사용하여 라이브 박테리아 세포에있는 단백질-DNA 상호 작용을 시각화

이 프로토콜은 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포 표면의 단일 수용체를 시각화 및 추적하여 수용체 측면 이동성, 수용체 복합체의 크기를 분석하고 일시적인 수용체-수용체 상호 작용을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 막 단백질로 확장될 수 있습니다.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

단백질-단백질 상호 작용은 BiFC(bimolecular fluorescence complementation)와 PALM(photoactivated localization microscopy)을 결합하여 나노미터 공간 해상도로 세포에서 시각화됩니다. 여기에서는 개별 Ras-Raf 복합체의 나노 스케일 클러스터링 및 확산을 시각화하기 위해 U2OS 세포에서 Ras-Raf 상호 작용을 이미징하기 위해 BiFC-PALM을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

이분자 형광 보완과 광 활성화 현지화 현미경 (BiFC-PALM)

이 원고는 기능화된 평면 지지 지질 이중층과 접촉하는 T 세포의 면역학적 시냅스 내에서 발생하는 T 세포 항원 수용체(TCR)와 항원 펩타이드 적재 MHC 분자 사이의 결합 역학을 측정하기 위해 (단일 분자) Förster Resonance Energy Transfer(FRET) 기반 분석을 수행하는 방법을 설명합니다.

TCR-pMHC 바인딩 측정<em&gt; 현장에서</em&gt; FRET 기반의 현미경 분석을 사용하여

제브라피시 배아에 존재하는 저농도 내인성 수용체를 검출하기 위한 새로운 기술이 설명됩니다. 우리는 이를 AFLIP이라고 명명했는데, 이는 면역침전과 연결된 리간드에 의한 수용체의 친화성 표지로 구성되어 있기 때문입니다.

Zebrafish의 배아에서 내인성 수용체의 친화력 레이블 검출

손쉬운 형광 분석 결과 포유류 세포에 표현 된 단백질에 비정규-아미노산 (ncAAs)를 통합 하는 아미노-acyl-tRNA-합성/tRNA 쌍의 효율성을 평가 하 여. G-단백질 결합 수용 체 (GPCRs) 공부 ncAAs의 응용 프로그램, 바인딩 사이트 및 bioorthogonal GPCR 라이브 셀 라벨의 사진-가교 매핑을 포함 하 여 설명 합니다.

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

우리는 분할-BioID, 근접 라벨 기술 BioID에 따라 단백질 조각-보완성 분석 결과 대 한 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 두 주어진된 단백질의 상호 작용 활성화, 그것은 그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 맞는 단백질 복합물의 proteomics 분석을 수 있습니다. 간단 하 고 비용 효율적인 메서드와 표준 실험실 장비에만 필요 합니다.

그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 상황에 맞는 단백질 복합물의 분할-BioID-Proteomic 분석

여기, 우리 살아있는 세포의 세포에 단일 막 단백질의 다 색 지역화에 대 한 프로토콜을 제시. Fluorophores 연결할 자체 라벨 단백질 사용 됩니다. 단백질, 세포 기관이 동일한의 다른 막 구획에 있는 ~ 18의 정밀도로 지역화할 수 nm.

살아있는 포유류 세포의 세포에서 단일 막 단백질의 다 색 지역화 현미경

많은 본질적으로 무질서한 단백질은 수많은 세포 과정에 중요한 행동인 매우 역동적인 생체 분자 응축물의 형성에 관여하는 것으로 나타났습니다. 여기에서, 우리는 살아있는 세포에 있는 생체 분자 응축물에서 단백질이 서로 상호 작용하는 동역학을 정량화하기 위한 단 하나 분자 화상 진찰 근거한 방법을 제시합니다.

생체 분자 응축물 내 단백질 상호 작용 역학의 단일 분자 측정

이 프로토콜은 원형질막 단백질의 나노스케일 공간 조직을 해명하기 위한 단일 항체 표지(SAL)를 설명합니다. 단일 분자 수준에서 누적된 항체-에피토프 상호작용을 활용하여 막 SAL(mSAL)은 국소 에피토프 분포를 지도화하는 동시에 천연 세포 환경에서 항체 결합 행동을 포착합니다.

단일 항체 표지를 이용한 막 단백질의 단분자 위치 현미경

배우세요 생세포 포토어피니티 라벨링을 이용한 소분자 결합 단백질 식별 방법입니다. HEK 293 T 세포에서 기본 세포 환경을 유지하며 약물 작용 기전을 규명하는 신뢰할 수 있는 기술입니다.

라이브 셀 Photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별

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