역상 고성능 액체 크로마토그래피: 마우스 간에서 분리된 형광 표지 및 유도체화된 시알산의 정량을 위한 강력한 방법

N-아세틸뉴라민산 및 N-글리콜릴뉴라민산과 같은 시알산은 포유류 세포 표면의 올리고당 사슬의 원위 말단에서 발견되는 음전하를 띤 탄수화물 부분입니다.

상 고성능 액체 크로마토그래피 또는 RP-HPLC를 사용하여 마우스 간 조직에서 이러한 시알산의 상대적 양을 정량화하려면 먼저 분리된 시알산 혼합물을 유도체화제로 처리합니다. 유도체화제는 시알산의 작용기와 상호 작용하여 안정적인 형광성 시알산 유도체를 생성합니다.

형광 검출기에 연결된 RP-HPLC 컬럼을 조립합니다. 이 컬럼은 크로마토그래피 실행 중에 시알산 유도체와의 선택적 상호 작용을 용이하게 하기 위해 비극성, 소수성, 알킬 사슬 리간드에 결합된 다공성 실리카 기반 고정상으로 구성됩니다.

최적의 컬럼 컨디셔닝을 위해 극성이 낮은 유기 용매인 저농도의 아세토니트릴을 함유한 수성 극성 이동상을 사용하여 컬럼을 평형화합니다.

유도체화된 시알산 혼합물을 컬럼에 로드합니다.

소수성 N-아세틸기를 포함하는 N-아세틸뉴라민산은 친수성 N-글리콜릴 그룹을 가진 N-글리콜릴뉴라민산보다 고정상의 소수성 리간드에 더 강하게 흡착됩니다.

온라인 형광 검출기에 연결된 표준 HPLC 시스템을 사용하여 샘플을 분석합니다. 분석을 위해 길이 250mm, 직경 4.6mm의 역상 C-18 컬럼을 사용하십시오.

용매 A와 용매 B를 준비하고 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 HPLC 실행을 설정한 후 50마이크로리터의 샘플을 HPLC 시스템에 주입합니다.

373나노미터의 형광 검출기 여기 파장과 448나노미터의 방출 파장을 사용하여 용리액을 모니터링합니다.

마지막으로 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Neu5Gc의 상대적 양을 계산합니다.