LC-MS Isotopically 두 안정을 사용 하 여 Sphingomyelin에 대 한 양적 및 질적 방법 Sphingomyelin 종 분류

이 절차의 전반적인 목표는 생물학적 샘플에서 각 Sphingomyelin 종의 양과 구조를 정확하게 분석하는 것입니다. 이 방법은 지질 생물학 및 지질과 관련된 지질 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 크로마토그래피 질량 분석 시스템으로 생물학적 샘플에서 다양한 Sphingomyelin 종을 특성화할 수 있다는 것입니다. 먼저 HeLa 세포가 들어 있는 10cm 조직 배양 접시에서 배양 배지를 제거하고 6ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 두 번 헹굽니다.

그런 다음 10cm 조직 배양 접시에 얼음처럼 차가운 PBS 1ml를 넣고 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수확합니다. 접시 표면에서 세포를 제거한 후 세포를 2밀리리터의 실리콘 플라스틱 튜브로 옮깁니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 각 세포 펠렛에 1밀리리터의 메탄올을 첨가합니다.

그런 다음 튜브를 잠시 소용돌이칩니다. 다음으로, 샘플을 수조형 초음파 발생기에 넣고 200와트에서 5분 동안 초음파 처리합니다. 완료되면 전체 셀 균질액을 테프론이 라이닝된 나사 캡이 장착된 시험관으로 옮깁니다.

이제 메탄올 1밀리리터, 클로로포름 1밀리리터, 이중 증류수 0.8밀리리터를 내부 표준물질 10마이크로몰 50마이크로리터에 각 시험관에 추가합니다. 튜브에 캡을 씌우고 실온에서 5분 동안 2, 500rpm에서 격렬하게 소용돌이칩니다. 그런 다음 각 튜브에 클로로포름 1ml와 이중 증류수 1ml를 추가합니다.

다시 말하지만, 실온에서 5분 동안 2, 500rpm에서 튜브를 격렬하게 소용돌이칩니다. 다음으로, 수성 상과 유기 상을 완전히 분리하기 위해 샘플을 원심 분리합니다. 하상을 일회용 유리관으로 옮깁니다.

시험관에 클로로포름 2ml를 추가합니다. 그런 다음 상부 위상 및 위상간 보풀과 충분히 혼합하기 위해 실온에서 5분 동안 2, 500rpm에서 튜브를 격렬하게 와류로 휘둘러칩니다. 두 번째 원심분리 후, 초기 하상과 함께 변형된 하부상을 일회용 유리관으로 옮깁니다.

이제 유리관을 질소 스트림 아래에 약 60분 동안 놓고 수집된 하부상에서 유기 용매를 완전히 제거합니다. 마지막으로, 500마이크로리터의 메탄올 또는 에탄올로 샘플을 재구성합니다. 생성된 혼합물을 0.02 미크론 필터로 유리 바이알에 여과합니다.

그런 다음 샘플을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 표준 화합물을 연속 희석하고 각 농도의 50마이크로리터를 별도의 시험관에 첨가합니다. 다음으로, 첫 번째 샘플에 대한 표준 곡선의 하한 경계의 3배 이내의 양, 두 번째 샘플에 대한 곡선 중심 근처의 양, 세 번째 샘플에 대한 표준 곡선의 상한 경계에 가까운 양을 추가하여 3개의 품질 관리 샘플을 준비합니다.

그런 다음 1ml의 메탄올에 포함된 세포 균질액을 각 시험관에 넣고 방금 표시된 방법을 사용하여 각 샘플에서 총 지질 분획을 추출합니다. 시작하려면 모바일 단계를 준비합니다. 아세토니트릴, 메탄올 및 이중 증류수를 수성상에 대해 2:2:1 비율로 혼합합니다.

테프론이 늘어선 나사 뚜껑이 있는 유리병의 유기상에 이소프로판올을 사용하십시오. 그런 다음 목욕형 초음파 처리기에서 5분 동안 두 이동상을 모두 초음파 처리합니다. 그런 다음 포름산을 최종 농도 26.4 밀리몰로 첨가하고 14.9 밀리몰의 수산화암모늄을 각 이동상에 첨가합니다.

정성 분석을 위해 고성능 액체 크로마토그래피 시스템을 활성화하십시오. 이동상이 포함된 유리병에 주입 튜브를 넣고 HPLC 라인을 퍼지합니다. 그런 다음 C18 HPLC 컬럼을 HPLC 시스템에 연결합니다.

컬럼 오븐의 온도를 섭씨 50도로 유지하고 분당 100마이크로리터의 수성 이동상으로 컬럼을 컨디셔닝합니다. 실행하는 동안 샘플을 자동 샘플러의 샘플 랙에 넣습니다. 3단계 질량 분석 분석을 위한 triple, quadruple 및 quadruple linear ion trap 질량 분석기 시스템의 파라미터를 함께 제공되는 텍스트 프로토콜의 표 1 및 표 2에 나열된 대로 설정합니다.

또한, 관심있는 SM 종의 제1 및 제2 전구체 이온에 대한 파라미터를 동반된 텍스트 프로토콜에 보다 상세히 기술된 바와 같이 설정한다. 배치 파일을 만들고 배치 파일을 제출하여 액체 크로마토 그래피, 전기 분무, 이온화, 탠덤 질량 분석기 분석을 통해 각 Sphingomyelin 종의 MS 3 개 생성물 이온 스펙트럼 데이터를 얻습니다. 액체 크로마토그래피, 전기 분무, 이온화, 탠덤 질량 분석 분석을 통해 관심 있는 Sphingomyelin 종의 3상 MS 생성물 이온 스펙트럼을 얻을 수 있습니다.

그런 다음 Sphingoid 장쇄 염기와 관심 있는 n-아실 부분의 정확한 질량에서 생성물 이온 스펙트럼의 질량 대 전하 비율을 비교하여 각 MS Sphingomyelin의 3개의 생성물 이온 스펙트럼을 할당합니다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 액체 크로마토그래피, 전기 분무 이온화, 탠덤 질량 분석 분석을 사용하여 Sphingomyelin을 정량적으로 분석합니다. 그런 다음 데이터 통합을 위한 소프트웨어를 사용하여 다중 반응 모니터링 데이터를 처리하여 각 Sphingomyelin 종의 추출된 이온 크로마토그램에 대한 피크 면적 데이터를 얻습니다.

각 Sphingomyelin 종을 정량화하고 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 표준 곡선을 구성합니다. HeLa 세포에서 추출한 지질 샘플에서 화학적으로 합성된 Sphingomyelin과 Sphingomyelin의 스펙트럼이 여기에 나와 있습니다. 주목할 점은 탈메틸화된 스핑고실포스포릴콜린의 스펙트럼 강도가 두 샘플 모두에서 SM n-아실 부분의 스펙트럼 강도보다 크

또한 흥미로운 것은 스핑고신-1-포스페이트에 해당하는 스펙트럼이 스핑고미엘린의 스핑고이드 장쇄 염기의 탄소 및 이중 결합의 수를 추측하는 데 유용하다는 것입니다. 현재의 정량적 방법에서는 이 방법을 검증하기 위해 검량선을 구성하기 위한 샘플을 정밀하게 준비하는 것이 중요합니다. 낮은 농도에 맞는 곡선은 1 또는 1 x 제곱과 같은 가중치 계수를 사용하여 1 또는 1 x 초과의 가중치 계수를 사용하여 명확하게 개선되었습니다.

이 기술은 생물학 및 산업 분야의 연구자들이 생물학적 샘플 및 화장품과 같은 산업 제품에서 다양한 Sphingomyelin 종을 특성화할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 생물학적 샘플에서 각 Sphingomyelin 종의 양과 구조를 정확하게 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 흡수재로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 유리 마모를 사용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

또한 손에서 유래한 지질의 오염을 방지하기 위해 장갑을 착용하는 것이 중요합니다.