Name: LC-MS Isotopically 두 안정을 사용 하 여 Sphingomyelin에 대 한 양적 및 질적 방법 Sphingomyelin 종 분류 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 학습하세요 LC-MS 동위원소 표지법을 이용한 스핑고미엘린 종의 정량 및 정성 분석 방법을. HeLa 세포 등 생물학적 샘플에서 지질 생물학 연구에 활용할 수 있는 정밀한 분석 기술을 습득하세요.

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이 작품에서 교육 과학기술부, 문화, 스포츠, 과학 및 기술의 일본 (KAKENHI) 경호 (#15 K 01691)를, Y.F. (#15 K 08625), 부장 (#26461532), 및의 사역에서 다루기 힘든 질병 프로젝트의 연구에 대 한 부여 연구 보조금에 의해 지원 되었다 건강, 노동 및 복지 (부장 #201510032A) 우리는이 원고 초안을 편집 하기 위해 Edanz 그룹 (www.edanzediting.com/ac) 감사 합니다.

사용 하기 전에 모든 관련 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 참조 하십시오. 피부에서 파생 된 SM에 의해 샘플 오염을 최소화 하기 위해 장갑을 착용 한다. 현재 프로토콜 2 m m L10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보충이 글의 최소 필수 매체에 성장 하는 HeLa 세포에 적용 했다-글루타민 1000 U/L 페니실린, 100 mg/L 스.
1입니다. 지질 샘플의 준비
참고: 모든 유리 시험관 테 플 론 늘어선 나사 모자를 포함 하 여 세제 없이 수 중요 하다.
<ol><li>Bligh 및 염색 방법7 을 사용 하 여 셀 homogenate에서 총 지질 분수의 추출<ol>
<li>문화를 제거 (또는 조건)-10cm 조직 문화 접시와 차가운 PBS의 6 mL로 두 번 린스에서 미디어.</li>
		<li>P1000 피펫으로 여 10 cm 조직 문화 접시에 얼음 처럼 차가운 PBS의 1 mL를 추가 합니다. 셀 스 크레이 퍼와 세포를 수확 하 고 2.0 mL 시 플라스틱 튜브에 수집 합니다.</li>
		<li>원심 분리 (1000 × g, 5 분, 4 ° C), 후에 상쾌한 P1000 피펫은 제거 합니다.</li>
		<li>메탄올의 1 mL를 추가 합니다. 소용돌이 관 짧게 고 목욕 형 sonicator에 5 분 동안 200 W sonicate. 참고: 셀 펠 릿 효율적으로 무 균 되도록 목욕 형 sonicator의 수 위를 조정 합니다.</li>
		<li>테 플 론 늘어선 나사 모자 테스트 튜브 (13 m m x 100 m m)로 피 펫 메탄올에 셀 homogenate 전송.</li>
		<li>메탄올, 클로 프롬, 두 배 증류수, 0.8 mL 및 50 µ L 10 µ / L 내부 표준 d18:1 /(D31)-16의의 1 mL의 1 mL를 추가: 0 각 시험관에 SM.</li>
		<li>실 온에서 5 분 동안 적극적으로 소용돌이 테스트 튜브. 참고:이 시점에서 단일 위상 (클로 프롬/메탄올/물 1/2/0.8 (v/v/v) =) 형성 된다.</li>
		<li>1 mL의 클로 프롬 및 두 배 증류수의 1.0 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>실 온에서 5 분 동안 2500 rpm에서 적극적으로 소용돌이 튜브. 참고:이 시점에서,는 수성 (위) 및 유기 (낮은) 위상 구분 됩니다.</li>
		<li>원심 분리 (2150 × g, 5 분, 25 ° C), 후 수집 하 고 일회용 유리 튜브 (초기 낮은 단계)로 낮은 단계를 전송. 참고: 낮은 단계 파스퇴르 피 펫 및 안전 피 펫 필터를 사용 하 여 수집 합니다. 낮은 위상에는 피 펫의 끝을 삽입 하 고 위 위상 및 피 펫, 팁 내부의 계면 보풀을 제공 하는 'E' 밸브 옆 작은 전구를 집어넣은 다음에 피펫으로 낮은 단계를 사이 펀.</li>
		<li>튜브 위 단계와 계면 보풀 충분히 섞어 실 온에서 5 분 동안 2500 rpm에서 적극적으로 테스트 튜브, 그리고 소용돌이에 클로 프롬의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>원심 분리 (2150 × g, 5 분, 25 ° C), 후 수집 하 고 수정 된 낮은 단계 단계 1.1.10에서에서 설명 된 대로 초기 낮은 단계와 일회용 유리 튜브로 전송.</li>
		<li>질소 스트림 아래 유리 튜브를 놓고 완전히 수집된 낮은 단계에서 유기 용 매를 제거 합니다.</li>
		<li>샘플 reconstitute 메탄올 또는 에탄올의 500 µ L, 0.02 µ m 필터, 여과-20 ° c.에 유리 튜브에 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>보정 곡선을 건설 하 고 메서드를 유효성 검사를 위한 샘플 준비<ol>
<li>0.1, 0.5, 1, 5, 10, 또는 표준 화합물의 50 µ / L의 50 µ L를 추가 (d18:1 /(D9)-18:1 SM) 테 플 론 늘어선 나사 모자 테스트 튜브로.</li>
		<li>각 시험관에 세포 homogenate를 추가 하 고 1 mL에 메탄올을 추가. 참고: 셀 homogenate 매트릭스로의 양은 각 실험에 따라 다릅니다. 샘플 10 cm 배양 접시에 셀에서 파생 된 SM 종 정기적으로 분석 하 고, 각 테스트 튜브에 세포 homogenate의 양을 10 cm 배양 접시에 셀의 가까이 이어야 한다.</li>
		<li>1.1.6-1.1.14 단계에에서 설명 된 대로 총 지질 분수를 추출 합니다.</li>
		<li>단계 1.2.1-1.2.3에서 descried로 메서드를 유효성 검사에 대 한 품질 검사 (QC) 샘플을 준비 합니다. 표준 화합물의 다른 농도와 3 QC 샘플 준비 (d18:1 /(D9)-18:1 SM): 3 표준 곡선 (QC 로우, QC L), 하나 센터 근처의 더 낮은 경계 배 내에서 (중간 품질 관리, 품질 관리-M)의 상한 근처 하나는 표준 곡선 (QC-높은, QC-H).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. SM LC-ESI-MS/MS 분석
<ol><li>모바일 위상의 준비<ol>
<li>혼합 용 제 (이기/메탄올/ddH2O 수성 단계와 소 프로 파 놀 유기 단계에 대 한 2/2/1 (v/v/v) =)에 유리 테 플 론 늘어선 나사 모자 병 및 목욕 형 sonicator에서 5 분 sonicate.</li>
		<li>포 름 산 (최종 농도 26.4 mmol/L)와 NH4오 추가 (14.9 mmol/L) 각 모바일 단계에.</li>
	</ol></li>
	<li>LC-ESI-MS3 SM의 질적 분석<ol>
<li>고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 시스템을 활성화 하 고 모바일 단계를 포함 하는 유리 병에 넣어 입구 튜브 HPLC 라인을 제거. HPLC 시스템에 C18 HPLC 열 (1.5 m m 아이디 × 100 m m 길이, 입자 크기 3.0 µ m)를 연결, 열 오븐에서 50 ° C에 온도 유지 하 고 상태는 autosampl에서 샘플 선반에 샘플을 넣어 100 µ L/분에 수성 모바일 단계와 열 어.</li>
		<li>3 배 4 중 극 및 4 극 자 선형 이온 함정 질량 분석 시스템 MS3 분석 이온의 SM 종의 첫 번째 및 두 번째 전조 뿐만 아니라 표 1 과 표 2 에 나열 된 매개 변수를 설정 합니다.<ol>
<li>데이터 수집을 위한 소프트웨어 아이콘 더블 클릭, 더블 클릭 ' 하드웨어 구성 ', ' LC + QTRAP4500 + 밸브 ' 선택한 ' 활성화 프로필 '을 클릭 합니다.</li>
			<li>' 새 하위 프로젝트 ' 및 '확인'을 클릭 하 여 새 하위 폴더를 만듭니다.</li>
			<li>'파일' 탭을 클릭 하 고 선택한 '새', ' 수집 방법 ' 및 '확인'을 선택. 10000 Da/s, 극성 '부정적'으로 그리고 '기간' 전체 시간으로 분석 된 (분)으로 속도 스캔, ' MS/MS/MS (MS3)'으로 ' 질량 사양 ' 아이콘 및 스캔 선택 유형 'MS' 탭을 클릭 합니다. 검색 범위는 '시작 (Da)'와 '정지 (다)'의 m/z 를 설정 합니다. SM 종 관심의 대상의 1, 2 선구자 이온의 m/z 를 설정 합니다. 참고: 여러 SM 종 분석, 강조는 '-MS3' 아이콘을 마우스 오른쪽 단추로 클릭, '이 실험 복사' 선택 하 고 다음 다른 SM 종 1, 2 선구자 이온의 m/z 를 넣어.</li>
			<li>' 고급 MS' 탭을 선택 하 고 각 매개 변수를 다음과 같이 설정: '프로 파일', 단계 크기 0.12 (다), 해상도 q 1과 q 3로 스캔 모드 '단위'와 '조명', 각각 50 (ms), 1.5 ms로 대량 범위 사이 일시 중지도 0, 설정 시간으로 강도 임계값 선택 ' 동적 시간을 채우기 ', 8 V, 3 분기 진입 장벽 및 25 ms로 여기 시간.</li>
			<li>'MS' 탭에서 ' 편집 매개 변수 ' 버튼을 클릭 하 고 선택 ' 소스/가스 ' 탭 커튼 가스, 충돌 가스, ionspray 전압, 온도, 이온 소스 gas1 및 gas2 표 1에 나열 된 매개 변수를 설정. 그런 다음 선택 '복합' 탭 declustering 잠재력, 입구 잠재력, 충돌 에너지, 여기 에너지, 및 충돌 에너지는 표 2에 나열 된 전파의 매개 변수 설정.</li>
			<li>' 통합 Valco 밸브 '를 강조 하 고 ' 단계 0에 대 한 위치 이름을 ' a, 선택한 설정 'B' 총에 대 한 위치와 5.0 분 시간. 또한 'A' 총에 대 한 위치 설정 70.0 분 시간.</li>
			<li>'Shimadzu LC 시스템'을 강조 표시 합니다. '펌프' 탭을 선택 하 고 이진 흐름, 0.28 mL/min와 최대 압력 한계 20.0 MPa로 전체 흐름으로 양수 모드를 설정 합니다. 'Autosampler' 탭을 선택 하 고 200 µ L로 헹 구는 볼륨 설정, 35 µ L/s 속도 rinsing, 샘플링 속도 5.0 µ L/s로 52 m m, 스트로크를 바늘, 25.0 분으로 시간을 제거, '전후 포부' 5 s, 그리고 린스 모드 딥 시간을 씻어.<ol>
<li>또한, 쿨러 장치를 활성화, 쿨러 온도 4 ° C로 설정 고 제어 유리병 바늘 선 52 m m. '오븐' 탭을 선택 하는 대로 오븐을 사용 각각 오븐 온도 최고 온도 50 ° C에서 85 ° C로 설정.</li>
				<li>'컨트롤러' 탭을 선택 하 고 확인란을 '에 힘'. ' 시간 프로그램 ' 탭을 선택 하 고 용 매 기울기를 다음과 같이 설정: 용 매 A / 5 분 동안 100/0 비율로 B 80/20을 선형 변경 프로그램 35/65 4 분 이상 50 분 이상 및 25/75 이상 1 분 후 25/75 10 분 동안 다음 선형 100/0에서 그들을 잡고 4 분 이상. 다음 메서드를 사용 하면 저장 합니다.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>배치 파일 만들기<ol>
<li>' 건설 인수 일괄 ' 아이콘 더블 클릭, 클릭 ' 추가 설정 ', ' 추가 샘플 ', 새로운 샘플 수를 설정 하 고 '확인'을 클릭 합니다.</li>
			<li>' 기가 ' 버튼을 클릭 하 고 사용할 방법을 선택 합니다. 여러 메서드 한 배치 파일에 사용 되는 경우 ' 여러 방법을 사용 '의 상자를 확인 하 고 각 샘플에 대 한 수집 방법을 선택 합니다. ' 샘플 이름 ' 이름 바꾸기 ' 유리병 위치 '에 대 한 적절 한 번호를 설정 하 고 주입 볼륨의 금액을 넣어. 다음 배치 파일을 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>LC-ESI-MS3 분석에 의해 MS3 제품의 SM 종의 이온 스펙트럼을 얻기<ol>
<li>배치 파일에서 '제출' 탭을 선택 하 고, 분석 샘플의 줄을 강조 표시 '제출' 버튼을 클릭 합니다.</li>
			<li>클릭은 ' 보기 Quene' 아이콘 '평형' 아이콘을 선택 인수 메서드를 사용할 수 1 분으로 시간을 설정 하 고 '확인'을 클릭 합니다.</li>
			<li>해당 아이콘을 클릭 하 여 ' 튜닝에 대 한 예비 악기 '를 비활성화 합니다. 다음 ' 시작 샘플 ' 아이콘을 클릭 하 여 일괄 처리 시퀀스를 실행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>질량 이온 스펙트럼 제품의 비 (m/z)를 충전 하 고는 sphingoid의 정확한 질량을 비교 하 여 각 MS3 SM의 제품 이온 스펙트럼 할당 LCB와 N-acyl moiety 관심의. LCB와 N은 sphingoid에서 탄소 이중 수 채권 확인-해당 제품 이온에 따라 acyl moiety.<ol>
<li>적절 한 하위 프로젝트 폴더 선택 되어 있는지 확인, 다음 ' 데이터 파일 열기 ' 아이콘을 두 번 클릭 하 고 샘플 분석을 선택 합니다. SM 종 각 대상에 대 한 크로마에 피크를 끌어서 다음 두 번 클릭 합니다. 드래그 영역 내에서 얻은 MS3 제품 이온 스펙트럼 표시 됩니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>LC-ESI-MS/MS에 의해 SM의 정량 분석<ol>
<li>2.1 및 2.2.1 단계에서 설명한 대로 모바일 단계 및 HPLC 열을 설정 합니다.</li>
		<li>3 배 4 중 극 4 중 극 선형 이온 함정 질량 분석 시스템 모니터링 (MRM) 분석 표 1 과 표 2에 나열 된 여러 반응의 매개 변수를 설정 합니다.<ol>
<li>2.2.2.1 및 2.2.2.2 단계에서 설명한 대로 절차를 수행 합니다.</li>
			<li>'파일' 탭을 클릭 하 고 선택한 '새', ' 수집 방법 ' 및 '확인'을 선택. 'MRM', '긍정적'으로 극성으로 ' 대량 사양 ' 아이콘 및 스캔 선택 유형 'MS' 탭을 클릭 합니다. 전체 시간 분석을 '기간'을 설정 합니다. [M + H]+ 의 m/z 와 184 ' 1 분기 질량 (Da)'와 ' 3 분기 질량 (다)'의 대상 이자, SM 종으로 각각 설정. 10 ms 및 SM 종 대상의 이름으로 ' ID' '시간'을 설정 합니다.</li>
			<li>' 고급 MS' 탭을 선택 하 고 각 매개 변수를 다음과 같이 설정: 해상도 1 분기의 모두 3 분기 단위로' ', 강도 임계값 0으로 시간 (ms), 0으로 설정 하 고 5 ms로 대량 범위 사이의 일시 중지.</li>
			<li>'MS' 탭에서 ' 편집 매개 변수 ' 버튼을 클릭 하 고 커튼 가스, 충돌 가스, ionspray 전압, 온도, 이온 소스 gas1 및 gas2 표 1에 나열 된 매개 변수를 넣어 ' 소스/가스 ' 탭을 선택 합니다. 잠재력, 입구 잠재력, 충돌 에너지, 그리고 충돌 세포 출구 잠재적인 표 2에 나열 된 declustering의 매개 변수를 넣어 '컴파운드' 탭을 선택 합니다.</li>
			<li>2.2.2.6 단계에서 설명한 대로 밸브를 설정 합니다.</li>
			<li>2.2.2.7 단계에서 설명한 대로 액정 상태를 설정 합니다. 다음 메서드를 사용 하면 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>2.2.3 단계에서 설명한 대로 배치 파일을 만듭니다.</li>
		<li>LC-ESI-MS/MS 분석 단계 2.2.4에에서 설명 된 대로 각 SM의 MRM 데이터를 가져옵니다.</li>
		<li>데이터 통합 소프트웨어를 사용 하 여 MRM 데이터를 처리 하 고 SM 종 각의 추출된 이온 크로마 피크 영역 데이터를 가져옵니다.<ol>
<li>정량 분석에서 데이터 통합에 대 한 소프트웨어 아이콘 더블 클릭, '편집' 탭을 클릭 하 고 사용자 통합 기본값을 선택 합니다. 1.0 점으로 가우스 부드러운 너비를 설정 하 고 '확인'을 클릭 합니다. '편집' 탭을 클릭 하 고 ' 새 결과 테이블 '을 선택 합니다. 샘플 통합, 화살표 단추를 누르고 '다음'을 선택 합니다. ' 만들 새로운 방법 '을 선택, 메서드의 이름을 설정 하 고 '다음'을 클릭 합니다. '다음'을 클릭 하 고 d18:1 /(D31)-16의 확인란: 0 그대로 SM '다음'을 클릭 하 고 '마침'을 클릭 합니다.</li>
			<li>'피크 검토 표시'를 클릭 하 고 크로마 봉우리는 적절 하 게 인식 하는 확인 하십시오. 주목 해야 한다 그 d18:1 /(D31)-16의 보존 기간: 0 SM에 의해 일반적으로 작습니다 ~ 34-1 SM 중에 비해 0.3 분 (d18:1 / 16:0 SM에 일반적으로 구성 됩니다).</li>
		</ol>
</li>
		<li>D18:1 /(D31)-16에 SM 종 각의 피크의 비율에 따라 각 SM 종 계량: 0 SM 내부 표준.<ol>
<li>'파일' 탭을 클릭, '내보내기', ' 결과 테이블 ', 'MultiQuant', '모든 열 수출' 열으로 포맷을 확인, '그 명시적으로 숨겨진 제외 하 고 모든 행을 내보내려면', 그리고 '확인'을 클릭 행.</li>
			<li>Excel 소프트웨어에서 내보낸된 파일을 엽니다. IS의 영역 SM 종 대상의 영역을 정상화 (d18:1 /(D31)-16:0 SM). 다음 대상 SM 종 주입 된 샘플에서의 양을 계산 하 주입된 샘플에 IS의 이론적인 금액을 곱하십시오.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>표준 곡선을 건설<ol>
<li>D18:1 /(D9)-18의 MRM 데이터: 1 SM 및 d18:1 /(D31)-16:0 단계 2.3.1-2.3.4에 설명 된 대로 LC-ESI-MS/MS 분석 하 여 표준 곡선을 만들기 위한 샘플에 SM.</li>
		<li>D18:1 /(D9)-18의 피크 면적의 데이터: 1 SM 및 d18:1 /(D31)-16:0 SM 2.3.5 단계에서 설명한 대로.</li>
		<li>D18:1 /(D9)-18의 양을 계산: 1에서 설명한 단계 2.3.6으로 주입 된 샘플에서 SM.</li>
		<li>/(D9)-18 명목 금액 및 d18:1의 계산 된 금액으로 x 축과 y 축을 설정 하 여 추세선을 구성: 1 SM 추세선 수식의 얻을.</li>
	</ol></li>
	<li>양적 방법 Excel 소프트웨어를 사용 하 여 유효성 검사<ol>
<li>방법의 유효성 검사에 대 한 d18:1 /(D9)-18의 양을 계량: 1 SM 및 d18:1 /(D31)-16: 0는 QC에 SM 샘플링 각 QC를 분석 하 여 1 일에 세 번 이상 샘플 및 단계 2.3.1-2.3.4에 설명 된 대로 최소 3 일을 반복.</li>
		<li>피크 지역 데이터를 가져오고 d18:1 /(D9)-18의 양을 계산: 1에서 설명한 단계 2.3.5 2.3.6으로 삽입 된 샘플에 SM.</li>
		<li>얻은 보정 곡선에 따라 d18:1 /(D9)-18의 양을 계산: 1 삽입 된 샘플에서 SM.</li>
		<li>정밀 평가<ol>
<li>평균 및 표준 편차 d18:1 /(D9)-18의 금액의 계산: 1 SM 2.5.3-하루의 데이터 집합에 단계에서 얻은 및 Excel 소프트웨어를 사용 하 여 간 일.</li>
			<li>2.5.4.1 단계에서 얻은 평균 표준 편차로 나눈 값 이며, %로 표시.</li>
		</ol>
</li>
		<li>정확도의 평가<ol>
<li>다음과 같이 각 데이터의 정확도 계산. [(계산된 양 단계 2.5.3에서에서 얻은입니다.) / (명목 금액)-1] × 100(%)</li>
			<li>하루 간 날의 dataset에 정확도의 절대 값의 평균을 계산 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Pham, H. T., Ly, T., Trevitt, A. J., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+complex+lipid+isomers+by+radical-directed+dissociation+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Differentiation of complex lipid isomers by radical-directed dissociation mass spectrometry.</a> Anal Chem. 84 (17), 7525-7532 (2012).</li>
</ol>

저자 들은 전혀 상충 선언 합니다.

현재 질적 방법에서 우리가 MS3 는 SPC와 N의 제품 이온을 얻은-acyl moiety. 제대로 SPC와 N을 할당 하는 것이 중요-acyl moiety. 이 위해, 그것은 다른 phosphorylcholine 포함 된 분자 또한 MS3 제품 이온으로 검출 될 수 있습니다 주목 해야한다. Diacyl-phosphatidylcholine (PC)와 plasmalogen-PC는 포유류 세포에 풍부 하 게 존재 이며 그들의 hydrophobicity SM 비슷합니다. 따라서, diacyl-PC와 동위 원소 (보통 13C) plasmalogen-PC 감지할 수 있습니다 이론적으로 동시에 SM으로. 우리의 실험에서 plasmalogen PC의 MS3 제품 이온 동시에 SM 분석에서 관찰 되었다. 그것은 제대로 SPC의 스펙트럼 강도 인지 SM N보다 큰 에스엠의 MS3 제품 이온을 선택 하...

Sphingomyelin (SM)은 포유류 세포에 있는 일반적인 sphingolipid. SM은 합성 침1 와 다른 sphingolipids에 대 한 선구자로 서 현재와 같은 면역에 중요 한 역할을가지고 있는 sphingosine 1 인산 염 및 세 라마 이드, 밀매 셀 피부 장벽 항상성, 각각2, 3. 따라서, SM 대사의 정확한 분석 elucidating sphingolipids의 생리 및 병 적인 역할에 대 한 중요 하다.
SM는 세 라마 이드와는 sphingosine와 N의 추가 구성 되는 세 라마 이드의 1 hydroxy 그룹에 연결 되는 phosphorylcholine의 구성-acyl moiety. Sphingosine N에 탄소와 이중 결합의 숫자에 다양 한-acyl moiety 세 라마 이드 (SM)의 수 종에서 결과. LC-ESI-MS/MS의 최근 발전은 SM4,5의 양적 및 질적 분석을 활성화 하 고. 질적 분석, 탄소 수와 sphingoid LCB의 SM의 이중 결합 LCB의 제품 이온 스펙트럼을 할당 하 여 확인 되었습니다. 그러나, N의 구조 정보-acyl moiety는 직접 얻지 못하면는 해당 제품 이온 보고 하지 않은, 때문에 그리고 그러므로 N-acyl moieties 선구자 이온 사이 차동 분석 추론 했다 고 제품 이온 모두 긍정적이 고 부정적인 이온 모드4,5에 LCB에 해당. 이 보고서에서는 LCB와 N의 제품 이온을 검출 하는 방법 소개-acyl moiety 트리플 4 중 극 4 중 극 선형 이온 함정 질량 분석, 정확한 구조를 용이 하 게 하를 사용 하 여 MS3 모드에서 동시에 각 SM 종6의 추측
생물 학적 샘플 매트릭스로 인 한 이온 억제 (또는 강화) 효과 방해 LC-ESI-MS 분석, 정확한 정량화 하 고 따라서, 그것은 동일한 매트릭스에 대 한 관심의 모든 analytes에 대 한 교정 곡선을 생성 하는 것이 좋습니다. 생물 학적 샘플. 그러나,이 전략은 불가능 하기 때문에 그것은 거의 모든 SM 종 종합 분석에 특히 생물학 견본에서 준비 가능 하지. 따라서, 보정 곡선을 건설 하 고 대표적인 SM 종 생물 학적 샘플에서 아군을 사용 하 여 양적 범위를 결정 하는. 우리는 보정 곡선; 구성 두 isotopically 표시 된 SM 종 사용 하나는 내부 표준 및 표준 화합물에 대 한 다른 사용 되었다. 우리는 생물 학적 샘플에 아군 하 고 성공적으로 교정 곡선과 양적 범위6표준 화합물으로 SM 종 isotopically 표시의 작은 금액을 감지.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>100mm 조직 배양 접시</td><td>IWAKI</td><td>3020-100</td><td></td></tr><tr><td>셀 스크레이퍼</td><td>IWAKI</td><td>9000-220</td><td></td></tr><tr><td>실리콘화 2.0mL 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td></td></tr><tr><td>시험관</td><td>IWAKI</td><td>TST SCR 16-100</td><td></td></tr><tr><td>테프론 라이닝 나사 캡</td><td>IWAKI</td><td>9998CAP415-15</td><td></td></tr><tr><td>일회용 유리관</td><td>IWAKI</td><td>9832-1310</td><td></td></tr><tr><td>CAPCELL PAK C18 ACR 3 &마이크로; m 1.5 mm I.D. x 100 mm</td><td>시세이도</td><td>92223</td><td>가드 카트리지를 카트리지 홀더에 삽입하고 C18 열</td></tr><tr><td>CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm 가드 카트리지</td><td>시세이도</td><td>12197</td><td></td></tr><tr><td>카트리지 홀더</td><td>시세이도</td><td>12415</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>Wako</td><td>018-19853</td><td></td></tr><tr><td>2-프로판올(이소프로필 알코올)</td><td>Wako</td><td>161-09163</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Wako</td><td>134-14523</td><td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>Wako</td><td>066-00466</td><td></td></tr><tr><td>28 % 암모니아 물</td><td>Wako</td><td>016-03146</td><td></td></tr><tr><td>초음파 발생기 (목욕 유형)</td> <td>SHARP</td><td>UT-206H</td><td></td></tr><tr><td>유리 시험관 용 소용돌이 믹서</td><td>TAITEC</td><td>Mix-EVR</td><td></td></tr><tr><td>1.4 mL 유리 바이알</td><td>Tomsic</td><td>500-1982</td><td>샘플은 나사 캡으로 밀봉 된 1.4 mL 유리 바이알에 보관하고 -20 °C에서 8mm 격막을 보관합니다. C</td></tr><tr><td>8 mm 격막</td><td>Tomsic</td><td>200-3322</td><td>시료 분석 시 나사 캡을 슬릿 격막이 있는 나사 캡으로 교체</td></tr><tr><td>1.4mm 유리 바이알용 나사 캡</td><td>Tomsic</td><td>500-2762</td><td></td></tr><tr><td>슬릿 격막이 있는 나사 캡</td><td>Shimadzu</td><td>GLC GLCTV-803</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 0.22 &micro; m 필터</td><td>Millipore</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>삼중 사중극자 및 사중극자 선형 이온 트랩 질량 분석기</td><td>SCIEX</td><td>QTRAP4500</td><td></td></tr><tr><td>제품 이온 스펙트럼의 데이터 수집 및 분석을 위한 소프트웨어</td><td>SCIEX</td><td>Analyst</td><td></td></tr><tr><td>정량 분석의 데이터 통합을 위한 소프트웨어</td><td>SCIEX</td><td>MultiQuant</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 시스템</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>유리 병</td><td>Sansyo</td><td>85-0002</td><td></td></tr><tr><td>d18:1/24:0 스핑고미엘린</td><td>Avanti 극지 지질</td><td>860592P</td><td></td></tr><tr><td>스핑고실포스포릴콜린</td><td>머크</td><td>567735</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 세럼</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>26140079</tr><tr><td>L-글루타민</td><td>써모피셔&nbsp;</td><td></td><td></td>25030081</tr><tr><td>페니실린과 스트렙토마이신</td><td>시그마</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Eagle' s 최소 필수 매체</td><td>시그마</td><td>M4655</td><td></td></tr></tbody></table>

lc-ms isotopically 두 안정을 사용 하 여 sphingomyelin에 대 한 양적 및 질적 방법 sphingomyelin 종 분류

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

우리는 방법 sphingomyelin (SM) 질적 분석의 양적 액체 착 색 인쇄기-분무 이온화 탠덤 질량 분석 (LC-ESI-MS/MS)에 의해 제시. SM은 일반적인 sphingolipid는 phosphorylcholine와는 세 라마 이드의 친수성 및 소수 성 구성 요소로 각각 구성. SM 종 수 sphingoid 긴 체인 베이스 (LCB) 다양 한 때문에 포유류 세포에 존재 하는 N-acyl moiety는 세 라마 이드에. 이 보고서에서는 탄소와는 LCB와 N이중 결합의 수를 추정 하는 방법을 보여 줍니다-acyl moiety MS/MS/MS (MS3) 실험에서 그들의 해당 제품 이온에 따라. 또한, 우리는 현재 정량 분석 방법 에스엠에 대 한 종을 사용 하 여 두 개의 안정적인 isotopically 레이블 SM, SM 정량에 사용 되는 범위를 결정을 용이 하 게 하. 현재 메서드는 SM 종 생물 학적 샘플 및 화장품 등 산업 제품의 다양 한 특성화에 유용할 것 이다.

화학적 합성 d18:1 / 24:0 SM (그림 1A)와 d18:1 / 24:0 SM HeLa 세포 (그림 1B)에서 추출한 지질 샘플에서 LC-ESI-MS3 채용 [M + HCOO]- , [M-채널3]에 의해 분석 되었다- 첫 번째 및 두 번째 선구자 이온으로 각각. Demethylated-sphingosylphosphorylcholine (SPC) (m/z 449)의 스펙트럼 강도 SM N의 그것 보다 더 큰-acyl moiety (m/z 378). 또한, [M-콜린-채널3 (sphingosine 1 인산 염)]에 해당 하는 스펙트럼에- ...

여기, 우리가 현재 계량 하 여 여러 반응 모니터링을 사용 하 여 각 sphingomyelin 종 자격 프로토콜 및 MS/MS/MS 모드, 각각.

LC-MS Isotopically 두 안정을 사용 하 여 Sphingomyelin에 대 한 양적 및 질적 방법 Sphingomyelin 종 분류

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

이 절차의 전반적인 목표는 생물학적 샘플에서 각 Sphingomyelin 종의 양과 구조를 정확하게 분석하는 것입니다. 이 방법은 지질 생물학 및 지질과 관련된 지질 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 크로마토그래피 질량 분석 시스템으로 생물학적 샘플에서 다양한 Sphingomyelin 종을 특성화할 수 있다는 것입니다. 먼저 HeLa 세포가 들어 있는 10cm 조직 배양 접시에서 배양 배지를 제거하고 6ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 두 번 헹굽니다.그런 다음 10cm 조직 배양 접시에 얼음처럼 차가운 PBS 1ml를 넣고 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수확합니다. 접시 표면에서 세포를 제거한 후 세포를 2밀리리터의 실리콘 플라스틱 튜브로 옮깁니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 각 세포 펠렛에 1밀리리터의 메탄올을 첨가합니다.그런 다음 튜브를 잠시 소용돌이칩니다. 다음으로, 샘플을 수조형 초음파 발생기에 넣고 200와트에서 5분 동안 초음파 처리합니다. 완료되면 전체 셀 균질액을 테프론이 라이닝된 나사 캡이 장착된 시험관으로 옮깁니다.이제 메탄올 1밀리리터, 클로로포름 1밀리리터, 이중 증류수 0.8밀리리터를 내부 표준물질 10마이크로몰 50마이크로리터에 각 시험관에 추가합니다. 튜브에 캡을 씌우고 실온에서 5분 동안 2, 500rpm에서 격렬하게 소용돌이칩니다. 그런 다음 각 튜브에 클로로포름 1ml와 이중 증류수 1ml를 추가합니다.다시 말하지만, 실온에서 5분 동안 2, 500rpm에서 튜브를 격렬하게 소용돌이칩니다. 다음으로, 수성 상과 유기 상을 완전히 분리하기 위해 샘플을 원심 분리합니다. 하상을 일회용 유리관으로 옮깁니다.시험관에 클로로포름 2ml를 추가합니다. 그런 다음 상부 위상 및 위상간 보풀과 충분히 혼합하기 위해 실온에서 5분 동안 2, 500rpm에서 튜브를 격렬하게 와류로 휘둘러칩니다. 두 번째 원심분리 후, 초기 하상과 함께 변형된 하부상을 일회용 유리관으로 옮깁니다.이제 유리관을 질소 스트림 아래에 약 60분 동안 놓고 수집된 하부상에서 유기 용매를 완전히 제거합니다. 마지막으로, 500마이크로리터의 메탄올 또는 에탄올로 샘플을 재구성합니다. 생성된 혼합물을 0.02 미크론 필터로 유리 바이알에 여과합니다.그런 다음 샘플을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 표준 화합물을 연속 희석하고 각 농도의 50마이크로리터를 별도의 시험관에 첨가합니다. 다음으로, 첫 번째 샘플에 대한 표준 곡선의 하한 경계의 3배 이내의 양, 두 번째 샘플에 대한 곡선 중심 근처의 양, 세 번째 샘플에 대한 표준 곡선의 상한 경계에 가까운 양을 추가하여 3개의 품질 관리 샘플을 준비합니다.그런 다음 1ml의 메탄올에 포함된 세포 균질액을 각 시험관에 넣고 방금 표시된 방법을 사용하여 각 샘플에서 총 지질 분획을 추출합니다. 시작하려면 모바일 단계를 준비합니다. 아세토니트릴, 메탄올 및 이중 증류수를 수성상에 대해 2:2:1 비율로 혼합합니다.테프론이 늘어선 나사 뚜껑이 있는 유리병의 유기상에 이소프로판올을 사용하십시오. 그런 다음 목욕형 초음파 처리기에서 5분 동안 두 이동상을 모두 초음파 처리합니다. 그런 다음 포름산을 최종 농도 26.4 밀리몰로 첨가하고 14.9 밀리몰의 수산화암모늄을 각 이동상에 첨가합니다.정성 분석을 위해 고성능 액체 크로마토그래피 시스템을 활성화하십시오. 이동상이 포함된 유리병에 주입 튜브를 넣고 HPLC 라인을 퍼지합니다. 그런 다음 C18 HPLC 컬럼을 HPLC 시스템에 연결합니다.컬럼 오븐의 온도를 섭씨 50도로 유지하고 분당 100마이크로리터의 수성 이동상으로 컬럼을 컨디셔닝합니다. 실행하는 동안 샘플을 자동 샘플러의 샘플 랙에 넣습니다. 3단계 질량 분석 분석을 위한 triple, quadruple 및 quadruple linear ion trap 질량 분석기 시스템의 파라미터를 함께 제공되는 텍스트 프로토콜의 표 1 및 표 2에 나열된 대로 설정합니다.또한, 관심있는 SM 종의 제1 및 제2 전구체 이온에 대한 파라미터를 동반된 텍스트 프로토콜에 보다 상세히 기술된 바와 같이 설정한다. 배치 파일을 만들고 배치 파일을 제출하여 액체 크로마토 그래피, 전기 분무, 이온화, 탠덤 질량 분석기 분석을 통해 각 Sphingomyelin 종의 MS 3 개 생성물 이온 스펙트럼 데이터를 얻습니다. 액체 크로마토그래피, 전기 분무, 이온화, 탠덤 질량 분석 분석을 통해 관심 있는 Sphingomyelin 종의 3상 MS 생성물 이온 스펙트럼을 얻을 수 있습니다.그런 다음 Sphingoid 장쇄 염기와 관심 있는 n-아실 부분의 정확한 질량에서 생성물 이온 스펙트럼의 질량 대 전하 비율을 비교하여 각 MS Sphingomyelin의 3개의 생성물 이온 스펙트럼을 할당합니다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 액체 크로마토그래피, 전기 분무 이온화, 탠덤 질량 분석 분석을 사용하여 Sphingomyelin을 정량적으로 분석합니다. 그런 다음 데이터 통합을 위한 소프트웨어를 사용하여 다중 반응 모니터링 데이터를 처리하여 각 Sphingomyelin 종의 추출된 이온 크로마토그램에 대한 피크 면적 데이터를 얻습니다.각 Sphingomyelin 종을 정량화하고 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 표준 곡선을 구성합니다. HeLa 세포에서 추출한 지질 샘플에서 화학적으로 합성된 Sphingomyelin과 Sphingomyelin의 스펙트럼이 여기에 나와 있습니다. 주목할 점은 탈메틸화된 스핑고실포스포릴콜린의 스펙트럼 강도가 두 샘플 모두에서 SM n-아실 부분의 스펙트럼 강도보다 크다는 것입니다.또한 흥미로운 것은 스핑고신-1-포스페이트에 해당하는 스펙트럼이 스핑고미엘린의 스핑고이드 장쇄 염기의 탄소 및 이중 결합의 수를 추측하는 데 유용하다는 것입니다. 현재의 정량적 방법에서는 이 방법을 검증하기 위해 검량선을 구성하기 위한 샘플을 정밀하게 준비하는 것이 중요합니다. 낮은 농도에 맞는 곡선은 1 또는 1 x 제곱과 같은 가중치 계수를 사용하여 1 또는 1 x 초과의 가중치 계수를 사용하여 명확하게 개선되었습니다.이 기술은 생물학 및 산업 분야의 연구자들이 생물학적 샘플 및 화장품과 같은 산업 제품에서 다양한 Sphingomyelin 종을 특성화할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 생물학적 샘플에서 각 Sphingomyelin 종의 양과 구조를 정확하게 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 흡수재로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 유리 마모를 사용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.또한 손에서 유래한 지질의 오염을 방지하기 위해 장갑을 착용하는 것이 중요합니다.

quantitative-qualitative-method-for-sphingomyelin-lc-ms-using-two

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리가 맥스와 Annexin V - 복합 자석 구슬과 대상 지질 및 Annexin V - 구속력 phosphatidylserine의 합성 지질 vesicles를 사용하여 자사의 목표 지질과 단백질의 상호 작용을 테스트하려면. 대상 지질에 바인딩 단백질은 공동 정화 및 비즈에서 용출 후 분석하고 있습니다.

자기 활성 셀 정렬 (LIMACS)를 사용하여 지질 소포 - 중재 동질 크로마 토그래피 : 단백질 지질 상호 작용을 분석하는 소설 방법

이 프로토콜은 세포에서 유리 및 에스테르화된 생체 활성 지방산의 추출 및 분석을 보여줍니다. 지방산은 안정 동위원소 희석, 키랄 액체 크로마토그래피, 전자 포획, 대기 화학 이온화, 다중 반응 모니터링 질량 분석법(SID-LC-ECAPCI-MRM/MS)을 사용하여 정확하게 정량화됩니다.

타겟 안정 동위 원소 희석 액체 크로마 토그래피 - 질량 분광법 분석을위한 세포 지질 추출

우리는 라이신 methylation의 변화를 계량하는 데 든 질량 분광법과 reductive methylation 화학을 사용하는 방법을 제시한다.

라이신 Demethylase 활동의 양적 측정을위한 MassSQUIRM의 응용

면역 기관과 세포의 glycosphingolipid 항원의 표현 프로필에 대한 통찰력을 얻을 수있는 구체적이고 민감한 방법을 설명합니다. 방법은 화학적으로 합성 표준에 비해 구조 분석을위한 glycosphingolipid 분자의 단계 - 현명한 조각을 허용 이온 트랩 질량 분광법을 활용합니다.

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여기에서 우리는 고립 된 인간의 혈소판 내가 로테를 억제제 복잡한에 대한 응답으로 신진 대사 적응을 연구하는 생체 접근으로 모델을 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 이 방법은 액체 크로마토 그래피 질량 분석에 의해 추적 동위 상대적 정량을 채용하고 연구 다양한 디자인을 적용 할 수있다.

미토콘드리아 대사 유학을위한 플랫폼으로 인간 혈소판의 LC-MS 분석

많은 예측된 (포스포) 리파제는 기질 특이성 및 생리학적 기능과 관련하여 제대로 특성화되지 않았습니다. 여기에서 우리는 효소 활성을 최적화하고, 천연 기질을 검색하고, 이러한 효소에 대한 생리학적 기능을 제안하는 프로토콜을 제공합니다.

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지질 방울은 C 형 간염 바이러스 (HCV) 등 여러 가지 병원균의 복제에 중요한 소기관이다. 우리는 관련 단백질의 양적 질량 분석에 대한 지질 방울을 분리하는 방법을 설명; 그것은 바이러스 감염, 환경 스트레스, 또는 약물 치료와 같은 조건의 다양한에서 사용할 수 있습니다.

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우리는 Saccharomyces cerevisiae에있는 중요한 세포 지질을 확인하고 정량화하기 위하여 탠덤 질량 분광법과 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 프로토콜을 제시합니다. 효모 세포 내의 주요 지질 클래스의 정량적 평가를 위한 설명된 방법은 다재다능하고, 견고하며, 민감하다.

탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석

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스핑 고지 질은 인간 질병에서 잘 확립 된 역할을 가진 생리 활성 대사 산물입니다. 질량 분석법으로 조직의 변화를 특성화하면 질병 병인학에서 역할을 밝히거나 치료 표적을 식별할 수 있습니다. 그러나 생물 저장소에서 냉동 보존에 사용되는 OCT 화합물은 질량 분석을 방해합니다. OCT에 내장된 인간 조직의 스핑고지질을 LC-ESI-MS/MS로 분석하는 방법을 간략하게 설명합니다.

질량분석 분석을 위한 최적의 절단 온도 화합물에 내장된 인체 조직의 준비

여기에는 머무름 시간, 이동성 및 단편화를 사용하여 안정 동위원소 라벨링을 통해 지질 구조를 스크리닝하는 방법이 제시되어 있습니다.

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학습하세요 LC-MS 동위원소 표지법을 이용한 스핑고미엘린 종의 정량 및 정성 분석 방법을. HeLa 세포 등 생물학적 샘플에서 지질 생물학 연구에 활용할 수 있는 정밀한 분석 기술을 습득하세요.

LC-MS Isotopically 두 안정을 사용 하 여 Sphingomyelin에 대 한 양적 및 질적 방법 Sphingomyelin 종 분류

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