미토콘드리아 칼슘 흡수 분석법: 분리된 미토콘드리아에서 칼슘 흡수를 측정하기 위한 플레이트 리더 기반 방법

미토콘드리아는 적절한 기능에 필수적인 세포질 칼슘을 흡수합니다.

미토콘드리아 기질로의 과도한 칼슘 유입(미토콘드리아 칼슘 과부하)은 내막 채널, 미토콘드리아 투과성 전이 기공 또는 MPTP의 개방을 유발합니다. 열린 모공은 미토콘드리아에서 칼슘 유출을 증가시켜 미토콘드리아 기능 장애를 유발합니다.

미토콘드리아 칼슘 흡수를 측정하려면 적절한 완충액에 현탁된 분리된 미토콘드리아가 포함된 멀티웰 플레이트로 시작합니다. ATP 생성 기질인 피루브산과 말산염으로 우물을 보충하십시오. 우물의 내용물을 섞고 배양합니다.

배양하는 동안 피루브산과 말산염은 ATP로 전환되어 미토콘드리아에 활력을 불어넣습니다. 미토콘드리아 막 불투과성, 칼슘에 민감한 형광 염료 분자를 포함하는 용액을 첨가합니다. 칼슘 함유 완충액을 활력이 공급된 미토콘드리아에 분배합니다.

염료 분자가 완충액의 유리 칼슘에 결합할 때 염료의 칼슘 형광을 모니터링합니다.

미토콘드리아 칼슘 유입을 시작하기 위해 칼슘 이온을 더 추가합니다. 점진적으로 증가하는 미토콘드리아 칼슘은 완충액의 칼슘 이온을 감소시켜 염료의 칼슘 형광을 감소시킵니다.

미토콘드리아가 최대 칼슘 운반 능력에 도달하면 칼슘 이온이 추가로 추가되면 MPTP 채널이 열리고 칼슘을 완충액으로 가져옵니다. 완충 칼슘은 염료 분자에 결합하여 염료 칼슘 형광을 증가시킵니다.

미토콘드리아 칼슘 흡수의 동역학을 모니터링하기 위해 칼슘 첨가의 다양한 시점에서 염료 형광을 플로팅합니다.

플레이트 리더를 사용하여 미토콘드리아 칼슘 흡수 측정을 시작하려면 총 1,000초 동안 매초 칼슘 그린-5N 형광의 키네틱 판독을 수행하도록 리더를 프로그래밍합니다.

다양한 시점에서 5마이크로리터의 염화칼슘 용액을 분배하도록 시약 인젝터를 프로그래밍합니다. 그런 다음 사용할 염화칼슘 용액으로 인젝터를 프라이밍합니다.

다음으로, 200마이크로그램의 분리된 미토콘드리아를 96웰 플레이트의 웰 1개에 추가하고 적절한 부피의 염화칼륨 완충액을 첨가하여 총 부피 197마이크로리터를 달성합니다. 그런 다음 1몰 피루브산 1마이크로리터, 500밀리몰 말산염 1마이크로리터, 1밀리몰 칼슘 그린-5N 스톡 1마이크로리터를 넣고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다.

미토콘드리아에 활력을 불어넣을 수 있도록 실온에서 2분 동안 빛으로부터 보호하여 배양합니다. 마지막으로 사전 프로그래밍된 동역학 프로토콜을 시작하고 칼슘 그린-5N 형광을 모니터링합니다.