단일 뉴클레오티드 변이체의 정량화를 위한 Chip-in-a-tube 기반 디지털 PCR

디지털 중합효소 연쇄 반응(dPCR)은 게놈의 특정 위치에서 단일 뉴클레오티드가 치환되어 두 개의 뉴클레오티드 변이 또는 대립유전자가 생성되는 돌연변이인 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV)를 정량화하는 데 유용합니다.

chip-in-a-tube dPCR 기술을 사용하여 정량화를 시작하려면 SNV(돌연변이 대립유전자 및 해당 야생형 대립유전자)가 포함된 DNA 샘플을 채취합니다. 내열성 DNA 중합효소, dNTP 및 프라이머를 포함하는 혼합물을 첨가합니다.

다음으로, 대립유전자를 구별하기 위해 다른 색상의 형광 리포터로 표지된 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브와 소멸제 분자를 추가합니다. 소광제가 기자에게 가까이 있으면 형광이 억제됩니다.

용액을 미세유체 칩의 반응 챔버에 나눕니다. 대립유전자를 포함하는 각 챔버는 독립적인 반응 용기 역할을 합니다.

칩이 있는 튜브를 열 순환기 안에 넣고 반응을 시작합니다. 고온에서 이중 가닥 DNA는 단일 가닥으로 변성됩니다. 온도를 낮추어 프라이머와 올리고뉴클레오티드 프로브를 상보적 영역으로 어닐링합니다.

적절한 확장 온도에서 DNA 중합효소는 프라이머를 확장하고 프로브를 절단합니다. 소광기와의 거리는 리포터의 형광 방출을 가능하게 합니다.

다른 색상의 형광 신호를 읽고 대립유전자를 포함하는 챔버를 검출하기 위한 위치 플롯을 만듭니다.

돌연변이 대립유전자(변이 대립유전자 분획)의 빈도를 결정하려면 돌연변이 대 야생형 대립유전자를 포함하는 챔버의 비율을 계산합니다.

이전에 설계된 프라이머, 프로브 및 게놈 DNA를 새로운 8-튜브 스트립에 추가하여 총 부피 15마이크로리터를 달성합니다. 위아래로 피펫을 사용하여 혼합합니다.

새로운 8-튜브 스트립에 내장된 칩에 로딩 플랫폼을 추가한 다음 튜브 스트립을 자동 로더에 놓습니다. 칩과 로딩 플랫폼 사이에 접촉이 있는지 확인하십시오. 그런 다음 로딩 슬라이더를 플랫폼에 놓고 스토퍼를 사용하여 슬라이더를 로더에서 고정합니다. 슬라이더 끝 근처에서 15마이크로리터의 PCR 혼합물을 피펫팅한 다음 로더 버튼을 눌러 로더를 1분 동안 가동합니다.

실행 후 로더에서 튜브 스트립을 제거하고 밀봉 강화제에 넣습니다. 슬라이드 뚜껑과 상단 뚜껑의 가장자리를 조심스럽게 밉니다. 밀봉 강화제를 약 2분 동안 실행합니다. 밀봉이 불완전하고 액체 웅덩이로 표시되면 1분 더 실행을 반복하십시오.

튜브에 230마이크로리터의 밀봉 유체를 추가합니다. 튜브 스트립을 열 순환기에 넣고 프로토콜에 설명된 대로 PCR을 실행합니다. 양성 파티션이 고르지 않게 분포되어 있으면 PCR의 온도나 지속 시간을 조정하십시오.

PCR 산물의 형광 강도를 검출 및 분석하려면 검출 지그에 튜브 스트립을 놓고 증류수 6밀리리터를 추가합니다. 피펫 팁을 사용하여 눈에 보이는 기포를 제거합니다.

지그를 감지기에 로드합니다. 검출 소프트웨어에서 "형광", "실험"을 선택한 다음 "샘플/NTC" 탭을 선택하고 "실행" 버튼을 클릭하여 실행을 시작합니다. 전체 실행 후 위치 플롯, 히스토그램 및 2D 산점도를 확인합니다.

PCR 산물을 수집하려면 튜브에서 밀봉액을 제거하십시오. 100마이크로리터의 TE 완충액을 첨가하고 30초 동안 격렬하게 소용돌이치게 합니다. 탁상용 원심분리기에서 튜브를 잠시 원심분리하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 진행하여 PCR 산물 수집을 완료합니다.