세포 접촉에서 단백질 상호 작용을 연구하기 위한 형광 변동 분광법(Fluorescence Fluctuation Spectroscopy)

인접한 세포 표면의 단백질에 의해 매개되는 세포-세포 상호 작용은 형광 변동 분광법 분석을 사용하여 살아있는 세포에서 연구할 수 있습니다.

먼저, 접착 수용체(막관통 단백질)를 발현하는 별도의 세포 배양을 채취합니다. 두 집단의 세포에 있는 수용체는 스펙트럼으로 분리된 형광 단백질로 표지됩니다. 이러한 형광 표지는 수용체의 세포질 영역에 존재하여 세포-세포 상호 작용에 대한 간섭을 방지합니다.

배지를 버리고 트립신을 첨가하여 세포 분리를 촉진합니다. 두 세포 집단을 혼합하고 배양하여 인접 세포의 수용체가 동형 트랜스 상호작용을 형성할 수 있도록 합니다.

세포를 공초점 현미경 아래에 놓습니다. 적절한 파장의 레이저 광원을 사용하여 샘플을 비추어 두 형광 라벨에서 방출을 유발합니다. 서로 다른 색상의 형광 신호가 접촉하는 두 개의 인접한 세포를 찾습니다.

두 형광 표지의 스펙트럼 채널을 사용하여 접촉하는 세포막 영역에 수직인 라인 스캔을 획득합니다. 레이저는 소량의 샘플, 즉 검출 부피에 초점을 맞춥니다. 형광 표지 수용체가 검출 부피 안팎으로 확산됨에 따라 형광 강도가 변동합니다.

인접한 세포의 수용체가 상호 작용하지 않으면 개별적으로 이동하여 낮은 상호 상관 관계로 형광 강도의 독립적인 변동을 초래합니다.

접촉하는 인접 세포가 수용체를 통해 상호 작용하면 상호 작용하는 단백질이 함께 확산되어 형광 강도에 상관 관계가 있는 변동을 일으킵니다.

한 웰의 세포 용액을 해당 웰로 옮깁니다. 위아래로 몇 차례 피펫팅하여 부드럽게 혼합한 후 35밀리리터의 유리바닥 접시에 혼합된 세포를 파종하고 파종된 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 하루 동안 배양합니다.

레이저 스캐닝 공초점 현미경 소프트웨어에서 광학 경로를 설정합니다. 스펙트럼 누화를 방지하려면 두 개의 개별 트랙을 선택하여 mEGFP 또는 mEYFP 및 mCherry 또는 mCardinal을 순차적으로 여기 및 감지하고 "Switch Tracks Every Line"을 선택합니다. 감지를 위해 두 채널 모두에 적절한 필터를 사용합니다.

혼합 세포가 들어 있는 접시를 샘플 홀더에 놓습니다. 온도 평형을 유지하고 초점 드리프트를 줄이기 위해 10분 동안 기다린 후 "찾기" 메뉴의 투과등을 사용하여 셀에 초점을 맞춥니다. 서로 접촉하는 한 쌍의 '빨간색' 및 '녹색' 셀을 검색합니다.

그런 다음 "자르기" 버튼을 사용하여 세포-세포 접촉에 수직인 스캔 경로를 선택합니다. "확대/축소"를 클릭하여 50-200나노미터의 픽셀 크기를 달성하고 "스캔 모드"에서 "선"을 선택합니다. "프레임 크기"를 128 x 1픽셀로 설정합니다. "스캔 속도"를 최대 허용 값으로 설정한 다음 주기를 100,000에서 500,000으로 설정합니다.

다음 적절한 레이저 출력을 선택하십시오. 검출기를 "Photon Counting" 모드로 설정합니다. "실험 시작"을 눌러 획득을 시작합니다.