형광 상관 분광학에 의해 측정 된 차 림프구의 플라즈마 막 분자 확산

이 프로토콜의 전반적인 목표는 형광 상관 분광법을 사용하여 일차 면역 세포의 막에서 표지된 단백질의 확산 속도를 측정하는 것입니다. 이 방법은 면역학 및 세포 생물학 분야에서 보다 활발한 막 수용체 역학을 가진 자연 살해 세포를 식별하는 것과 같은 주요 질문을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 살아있는 세포와 함께 사용되므로 분자가 어떻게 움직이는지에 대한 자연 상태를 정확하게 반영한다는 것입니다.

이 기술의 의미는 분자 확산과 같은 다양한 자연 살해 세포 형질이 효율성을 더 잘 예측할 수 있는 기능과 연결된 경우 암의 면역 요법으로 확장됩니다. 이 방법은 면역 세포의 분자 이동에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 모든 분야의 다른 1차 세포 및 세포주에도 적용할 수 있습니다. Scan New Images 옵션을 선택한 상태에서 전문가 모드에서 소프트웨어를 엽니다.

컨포칼 레이저 스캐닝 현미경에서 40X 물 대물 렌즈를 선택합니다. Acquire 탭에서 Config 및 Scan 버튼을 눌러 Configuration Control과 Scan Control을 엽니다. ConfoCor 탭에서 Measure를 눌러 Measurement 창을 엽니다.

그런 다음 FCS 측정값을 저장할 폴더를 만듭니다. 파일 탭에서 새로 만들기를 클릭하여 새 이미지 데이터베이스를 시작합니다. 할로겐 램프를 켭니다.

레이저 버튼을 사용하여 형광단을 자극하기 위해 관련 레이저를 켭니다. 그런 다음 구성 제어 창에서 이미지 캡처에 대한 설정을 지정합니다. 여기에는 여기 레이저, 여기 및 방출 필터, 광 경로 및 사용 중인 감지기가 포함됩니다.

마찬가지로 Measurement 창으로 이동하여 System Configuration 탭에서 FCS 설정을 조정합니다. 녹색 채널의 경우 Ch 1, 빨간색 채널의 경우 Ch 2를 전환하여 FCS 녹음의 감지 채널을 활성화합니다. 레이저가 안정화되는 동안 최대 30분이 소요될 수 있습니다.

먼저, 50마이크로리터의 염료 한 방울을 폴리-L-라이신으로 코팅된 8웰 챔버 커버 글라스 슬라이드의 한 웰에 중앙에 놓습니다. 인접한 well은 보정이 슬라이드에 따라 달라지므로 세포 측정을 수행하는 데 사용됩니다. 40X 물 대물 렌즈에 증류수 한 방울을 떨어뜨리고 슬라이드를 배치합니다.

그런 다음 Vis를 눌러 가시광선을 선택하고 형광단 방울의 중앙 위치에 초점을 맞춥니다. 소프트웨어 Measurement 창에서 Acquisition 탭을 선택하고 Positions에서 현재 위치를 토글합니다. 그런 다음 같은 창의 시스템 구성 탭으로 돌아가서 녹색 레이저의 높은 또는 포화 전력을 설정합니다.

신호의 안정성을 테스트하려면 Start를 눌러 시간 추적 및 자동 상관 관계 곡선을 표시하는 새 창을 엽니다. 형광 신호가 높고 안정적이며 y축이 킬로헤르츠 범위의 변동을 나타내는지 확인합니다. 낮은 값은 초점이 부정확하거나 염료가 저하되었기 때문일 수 있습니다.

그런 다음 측정 창에서 O 조정 버튼을 선택합니다. 그런 다음 올바른 감지 채널을 선택하고 자동 조정 X를 누릅니다.결과 곡선의 상한이 누락되거나 중앙에 있지 않은 경우 거칠기 옵션을 표시하고 X 자동 조정을 다시 누릅니다. X 방향을 조정한 후 자동 조정 Y를 눌러 Y 방향에 대해 동일한 작업을 수행합니다.거칠기를 선택 해제하고 둘 다 명확한 최대값과 안정적인 값을 가질 때까지 자동 조정을 눌러 X와 Y를 번갈아 조정합니다.

두 개의 서로 다른 형광단으로 표지된 세포가 있는 경우 인접한 챔버에 적색 형광단 용액 한 방울을 추가합니다. 그런 다음 두 번째 채널을 보정합니다. 적색 레이저를 고출력으로 설정하고 안정성 보정 절차를 반복합니다.

다음으로, 초점을 통해 자유롭게 확산되는 형광단의 통과 시간을 측정합니다. 그리고 우리는 그 단계를 사용하여 초점 내에 있는 세포막의 면적을 계산합니다. 시작하려면 조정 절차를 신중하게 수행하여 용액 방울에 집중하십시오.

그런 다음 Measurement 창의 Acquisition 탭으로 이동하여 세 번 반복하여 획득 시간을 30초로 설정합니다. 레이저 출력을 거의 포화 상태로 설정하고 시작을 눌러 측정합니다. 측정이 완료된 후 분자 또는 CPM당 개수를 기록합니다.

그런 다음 레이저 출력을 반복적으로 줄여 새로운 측정을 수행합니다. 이 전력 범위 내에는 향후 셀 측정의 예상 전력이 포함됩니다. 다음으로 CPM 값이 레이저 출력에 따라 선형으로 확장되는지 확인합니다.

스케일의 나머지 부분이 선형인 경우 최고 전력에서의 포화가 허용됩니다. 새로 접합된 형광 항체를 처음 사용하는 경우 자유 확산 항체의 FCS 측정을 수행하여 예상 CPM을 정량화합니다. 그리고 유리 항체를 위해 PEG Poly-L-Lysine으로 코팅된 웰을 사용하는 것이 중요합니다.

이 절차를 위해 폴리에틸렌 글리콜에 접목된 200마이크로리터의 Poly-L-Lysine으로 챔버 슬라이드를 코팅합니다. 용액을 실온에서 한 시간 동안 고착시키십시오. 스톡 용액은 최대 2주 동안 냉장 보관할 수 있습니다.

그리고 분말 스톡은 냉동실에 보관해야 합니다. 나중에 액체를 제거하고 챔버를 자연 건조시킵니다. 현미경에서 PBS의 항체를 밀리리터당 1-10마이크로그램 사이로 희석합니다.

유리 형광단에 대한 이전 섹션에서 설명한 대로 자유 항체의 통과 시간을 측정합니다. 세포에서 측정하려면 PBS에 125마이크로리터의 세포와 항체 표지된 세포 현탁액의 1%FCS를 추가합니다. 그리고 150마이크로리터의 투명한 Roswell Park Memorial Institute Medium 1640을 PLL 코팅된 유리 슬라이드의 빈 우물에 넣습니다.

세포가 부착되고 평형을 이룰 수 있도록 진행하기 전에 최소 20분 동안 측정 온도에서 어둠 속에서 세포를 배양합니다. 세포를 보는 데 필요한 가장 낮은 레이저 출력을 찾기 위해 빠른 XY 스캔으로 이미징을 시작합니다. 그런 다음 멤브레인이 명확하게 정의된 평균 밝기의 둥근 셀에 이미지를 중앙에 배치합니다.

세포질에 형광 신호가 없는 것이 중요합니다. 셀이 이미지의 대부분을 덮을 때까지 확대합니다. 그런 다음 세포막의 상단에 초점을 맞춥니다.

세포의 중앙에서 시작하여 이미지의 중앙에 형광이 균일한 작은 둥근 영역이 나타날 때까지 위쪽으로 이동합니다. 초점을 신중하게 배치하는 것이 중요합니다. 초점이 멤브레인에 있지 않으면 검출된 형광은 형광 표지된 멤브레인 수용체에서 나오지 않습니다.

따라서 결과는 그들의 행동을 반영하지 않습니다. 이제 Measurement 창의 Acquisition 탭에서 Crosshair를 활성화하여 FCS 측정 위치를 선택합니다. 그런 다음 반복 횟수를 6에서 10 사이로 설정하고 측정 시간을 반복당 10초로 설정합니다.

이제 Measurement 창의 System Configuration 탭으로 돌아가서 FCS 측정을 위한 레이저 출력을 1에서 10마이크로와트 사이로 낮춥니다. 그런 다음 시작을 누릅니다. 처음 10초 동안 강도 트레이스가 30% 이상 떨어지면 셀이 너무 많이 표백된 것이므로 다른 셀을 더 낮은 전력으로 측정해야 합니다.

신호가 손실되면 Z 방향으로 초점을 조정하고 측정을 다시 시작하십시오. 측정이 완료된 후 Scan Control 창에서 셀이 여전히 중앙에 있는지 확인하여 멤브레인이 측정되었는지 확인합니다. 셀이 이동했다면 데이터를 버리십시오.

이제 Auto Correlation 창으로 이동하여 확대/축소 동작, 표백, 큰 클러스터 또는 기타 아티팩트가 포함된 개별 반복을 수동으로 삭제합니다. 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 삭제를 선택하여 아티팩트를 제거합니다. 실제 아티팩트를 선택하려면 연습이 필요합니다.

반복을 제거하는 것은 간단한 프로세스이지만 제거해야 할 것과 제거하지 말아야 할 것을 알기 위해 반복을 올바르게 평가해야 합니다. 그런 다음 최종 파일을 FCS 형식으로 저장합니다. 추가 분석을 위해 아티팩트 제거 후 최소 4번의 반복이 남아 있는 셀만 유지합니다.

일반적인 막 수용체 자동 상관 곡선은 매끄럽고 통과 시간이 10-400밀리초 사이입니다. 확산을 나타내는 가장 가파른 경사 부분의 시작과 끝이 모두 표시되도록 피팅 영역을 설정합니다. 데이터를 피팅하기 위해 2차원의 자유 확산 모델을 사용하여 곡선에서 가장 깊게 기울어진 부분에 주의를 기울입니다.

잔차에서 볼 수 있는 타우 규모에서 약 1초 또는 그 안팎의 작은 변동은 허용됩니다. 곡선이 잘못 적합하지만 셀에 이동, 백화 또는 군집과 같은 명백한 문제가 없는 경우 모델의 시작 값 또는 상한 및 하한을 변경해야 할 수 있습니다. 모형이 자동 상관 관계 곡선에 잘 맞으면 변수 매개변수의 값을 추출합니다.

분자의 수는 내인성으로 발현된 단백질의 경우 평방 미크론당 0.5개에서 약 200개 사이로 다양할 수 있습니다. 세포 측정의 CPM 값이 자유롭게 확산되는 항체에서 기록된 값의 33% 이상인지 확인합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 형광 상관 분광법을 사용하여 단백질의 확산 속도를 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 5-6시간 안에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 측정 시작 약 20분 전까지 세포를 얼음 위에 두는 것이 중요합니다. 2시간 이상 샘플을 측정하지 마십시오.

이 절차에 따라 확산 속도가 특정 단백질의 발현 수준과 어떻게 상관되는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 이미징과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 분자 생물학 및 면역학 분야의 연구자들이 살아있는 세포에서 단백질의 역학을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.