Confocal 현미경 검사 법 밝혀 세포 표면 수용 체 이미지 상관 분광학을 통해 집계

이 이미지 상관 분광법 프로토콜의 전반적인 목표는 세포 표면에서 발생하는 클러스터링 이벤트의 정량화를 위한 접근 가능한 방법론을 제공하는 것입니다. 세포 표면의 수용체에 결합하는 항체는 확인 및 클러스터링 변경을 제공할 수 있습니다. 이러한 동적 과정에 대한 분석은 약물 표적의 특성화에 중요합니다.

이 기술의 주요 장점은 쉽게 접근할 수 있는 이미징 장치를 사용하여 세포 표면에서 클러스터링 이벤트를 정량화하기 위한 접근 가능한 방법론을 제공한다는 것입니다. 시작하려면 10,000개의 A431 표피 암종 세포를 8개의 챔버로 구성된 이미징 슬라이드의 각 웰에 파종합니다. 다음 날, EGF 수용체 응집을 자극하기 위해 EGF 리간드를 밀리리터당 100나노그램을 세포에 즉시 첨가합니다.

리간드로 세포를 고정하기 전에 실온에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 함께 제공되는 텍스트 프로토콜의 면역세포화학 및 공초점 이미지 프로토콜에 따라 수집 중에 사용된 설정에 세심한 주의를 기울이고 획득한 데이터 세트를 피지에 로드합니다. 과포화는 피해야 합니다.

최종 이미지에는 1미크론 제곱 미만의 픽셀 크기가 포함되어야 합니다. 또한 정점 또는 기저 표면의 평평한 표면과 나중에 샘플 정규화를 위해 cell-free 영역을 캡처합니다. 첫 번째 이미지에서 관심 있는 정점 또는 기저 세포 표면막 영역을 식별하는 것으로 시작합니다.

2에서 n까지의 픽셀 크기를 256 x 256, 128 x 128 또는 64 x 64 범위에서 선택합니다. 그런 다음 이미지 메뉴로 이동하여 복제를 선택합니다. 다음으로 분석으로 이동하여 측정으로 이동합니다.

자른 관심 영역의 평균 강도를 계산합니다. 이제 원본 이미지에서 같은 크기의 배경 영역을 식별합니다. 이전과 같이 복제하십시오.

그리고 관심 있는 배경이 잘린 영역의 평균 강도를 계산합니다. 관심 영역과 배경을 모두 측정한 상태에서 프로세스로 이동하여 이미지 계산기를 선택합니다. 관심 영역을 이미지 1로, 배경 이미지를 이미지 2로 배치하고 빼기를 작업으로 선택합니다.

그런 다음 프로세스 메뉴로 이동합니다. FFT로 이동하여 FD Math를 선택합니다. FFT 수학 대화 상자에서 여기에 표시된 대로 이미지 입력을 선택하고 상관 관계가 있도록 작업을 설정합니다.

역 변환이 켜져 있는지 확인합니다. process를 선택하고, math까지 아래로 스크롤하고, divide를 선택하고, 대화 상자에 총 픽셀 수를 입력하여 결과 이미지를 정규화합니다. 그런 다음, 정규화된 자른 면적의 평균 강도를 제곱하여 다시 정규화합니다.

다음으로, 점 확산 함수를 통해 선을 그립니다. 이 선의 프로파일을 플롯하여 피크 값을 계산하려면 analyze로 이동하고 plot profile을 선택합니다. peak 값을 spread sheet로 전송하여 beam area당 clusters를 계산합니다.

그런 다음 빔 영역당 클러스터를 피크 값에서 1을 뺀 값보다 1 위로 설정합니다. 이미지를 일괄 처리하려면 Fiji 매크로를 설정하는 것이 좋습니다. 이를 통해 이미지 상관 분광법 분석을 위해 여러 컨포칼 이미지를 일관되고 신속하게 분석할 수 있습니다.

이미지 상관 분광법 작업 흐름에 대한 매크로를 설정하려면 프로토콜의 각 메뉴 명령을 기록하도록 프로그램을 설정합니다. 이를 위해 플러그인으로 이동하여 marcos로 이동한 다음 record를 선택합니다. 그런 다음 기본 창으로 돌아가서 이 비디오의 이전 섹션에서 설명한 프로토콜을 실행합니다.

완료되면 매크로 창으로 돌아가서 만들기를 선택하여 매크로를 생성합니다. 그런 다음 매크로 편집 창에서 언어를 LJ1 매크로로 선택해야 합니다. 선택하지 않으면 프로그램을 실행할 수 없습니다.

마지막으로 매크로를 저장합니다. 현미경의 광학 전달 기능은 분자 크기의 물체도 XY 평면에서 200-300나노미터 사이의 이미지로 나타나도록 합니다. 이 프로토콜에 설명된 바와 같이 세포와 동일한 방식으로 sub-resolution fresin beads를 이미징하여 현미경의 점 확산 기능 면적을 계산할 수 있습니다.

이 이미지는 세포 표면 EGF 수용체를 표적으로 하는 세툭시맙 1차 항체로 표지된 EGF 자극 및 시뮬레이션되지 않은 부착 A431 표피암 세포를 나타냅니다. 노란색 상자는 픽셀 치수가 64 x 64인 작물 영역을 포함하는 세포막을 나타냅니다. 이 이미지는 이미지 상관 분광법 분석을 수행하는 데 사용되었습니다.

자기 상관 함수의 정규화 후 점 확산 함수는 선 도구를 사용하여 측정할 수 있습니다. 이 line 함수의 프로파일은 피크 값을 감지하기 위해 플롯됩니다. 이러한 방법을 사용하여 EGF 자극은 자극되지 않은 세포에 비해 빔 영역당 검출된 EGFR 클러스터에서 2.56배 감소를 유도하는 것으로 관찰되었습니다.

일단 마스터하면 컨포칼 이미지를 분석하는 데 이미지당 몇 분 밖에 걸리지 않습니다. 이 절차를 시도하는 동안 이 프로토콜에 설명된 설정을 사용하여 모든 실험 조건의 여러 반복을 수집하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 이미지 상관 분광법을 확장하여 타임 랩스 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 클러스터링 이벤트의 시간적 변화를 탐색할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 연구자들이 사진 표백 ICS를 사용하여 고차 응집 상태를 탐색하는 동시에 이미지 교차 상관 분광법 방법론을 사용하여 두 막 기반 단백질의 공동 국소화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 관심 있는 세포 표면 분자의 클러스터링 상태를 계산하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.