Name: Confocal 현미경 검사 법 밝혀 세포 표면 수용 체 이미지 상관 분광학을 통해 집계 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 배우세요 공초점 현미경과 이미지 상관 분광학을 이용한 세포 표면 수용체 집계 정량화 방법을. 이 기술은 약물 표적 특성화 및 수용체 역학 연구에 필수적입니다.

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저자 인정 자금 지원을 NHMRC (교제 1084178와 보조금 1087850, 1030469, 1075898 (AMS))에서 암 호주, 루드비히 암 연구, 존 T 리드 신뢰, 치료 뇌 암 재단, 라 Trobe 대학교와 빅토리아 암 기관. Victorian 정부에 의해 제공 운영 인프라 지원 프로그램에서 자금, 호주는 또한 인정 했다.

1. 부착 셀 라인의 이미징 실험에 대 한 시드
<ol><li>10%를 포함 하는 Dulbecco의 수정이 글 매체/영양소 혼합 F-12 (DMEM/F-12) 미디어의 300 µ L에서 잘 하룻밤 (O/N) 당 10000 A431 해 암 세포를 씨앗 소 태아 혈 청, 1% 페니실린-스와 1%는 8에서 GlutaMAX 이미징 연 발 슬라이드 고해상도 기름 침수 렌즈에 적합 (예를 들어, NuncTM 실험실-TekTM coverglass 연 발).</li>
	<li>미디어 실 온 (RT)에서 10 분에 100 ng/mL EGF ligand의 추가 A431 세포에 수용 체 집계를 자극.</li>
</ol>2. 1 차적인 항 체 외피
<ol><li>미디어를 제거 하 고 실내 온도 (RT) 버퍼링 하는 인산 염 (1 x PBS)의 300 µ L 셀을 두 번 씻어.</li>
	<li>실시간에서 10 분에 대 한 PBS에 4 %paraformaldehyde 200 µ L로 셀 수정 참고: 대상 집단의 시간적 변화를 탐험,이 고정 단계 생략 해야 합니다.</li>
	<li>PFA를 제거 하 고 실내 온도 PBS의 300 µ L에 포함 된 셀을 두 번 씻어.</li>
	<li>셀 4 ° c.에 적어도 2 시간에 10 µ g/mL의 농도에서 1 차적인 항 체를 포함 하는 PBS의 200 µ L 품 어 참고: ICS 계산 유효에 대 한 모든 수용 체 세포 표면에 존재 1 차 항 체로 표시 되어야 합니다. 각 기본 항 체의 희석 시리즈와 예비 실험 필요 (1:10, 1시 50분, 1: 100, 1: 200, 1: 1:1, 500, 000 등) 수행. 최적의 기본 항 체 농도의 형광 강도 클러스터 밀도 비교 분석을 통해 결정 됩니다. 선택한 기본 농도 클러스터 밀도 일반적인 항 체 바인딩 결과로 클러스터 밀도 증가 이전 1 차 항 체 농도 증가 함께 정점 때 발생 합니다. 1 차적인 항 체 시간 코스 이미징 실험을 수행 하는 경우 혈 청 자유로운 미디어에 희석 수 있습니다.</li>
	<li>원하는 보육 시간 완료, 다음 RT PBS의 300 µ L에 포함 된 셀을 두 번 씻어.</li>
	<li>와 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS에 4 ° c.에 적어도 2 시간에 대 한 샘플을 차단 참고: 고정된 샘플 차단 정기적으로 4 ° c.에 하룻밤 (O/N)</li>
</ol>3. 이차 항 체 외피
<ol><li>이차 항 체 (예: 알 렉 사 Fluor 488 IgG) PBS에 놓여있는지 표시의 10 µ g/mL 재고를 준비 합니다. 2 µ g/mL Hoechst 33342의 현미경에 향상 된 샘플 검색에 대 한 허용이 희석에 포함 될 수 있습니다. 참고: 시간 경과 실험, PBS는 혈 청 자유로운 미디어에 대 한 교환할 수 있습니다.</li>
	<li>제거 5 %BSA / 셀에서 PBS 및 주변광에서 샘플을 보호 하면서 4 ° C에서 2 시간에 대 한 2 차 항 체 솔루션으로 품 어.</li>
	<li>완료 되 면 이차 항 체 외피 시간, PBS (2 회)의 300 µ L로 세포 세척 하 고 주위 빛에서 보호 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
	<li>증발을 방지 하기 위해, parafilm으로 챔버 슬라이드의 가장자리를 래핑하십시오.</li>
</ol>4. 샘플의 confocal 현미경 검사 법
참고: confocal 분석에 사용 된 설정 장비 및 fluorophores 개별 실험에 사용 된 따라 달라 집니다. 현대 confocal 악기 악기의 기본 이미지 파일 형식에서 실험에 사용 된 모든 이미지 매개 변수를 저장 하기 위한 메커니즘을 제공 합니다. 그것은 중요 이러한 설정은 데이터 수집의 다른 기간에 걸쳐 실험 조건의 적절 한 복제에 대 한 제공에 기록 됩니다.
<ol><li>형광 신호의 이미징, 동안-채도를 하지 마십시오. 픽셀 채도의 거짓 색상 표현을 제공 하는 테이블을 이미지 보기를 사용 하 고 검출기 이득 감소 따라 레이저 출력. 가장 confocal 악기가 수집 소프트웨어에 "범위 표시기" 설정 또는 유사한 옵션을 포함합니다.</li>
	<li>레이저 출력에 대 한 관심의 fluorophore의 노출을 최소화 합니다. Hoechst 33342 같은 DNA 라벨 얼룩의 사용 감지 하 고 수집 하기 전에 시야에서 샘플 위치는 쉬운 메커니즘을 제공 합니다.</li>
	<li>낮은 해상도에서 샘플의 초기 검사를 수행 하 고 경우 소프트웨어 빠른 스캔 속도. 이 샘플의 가능한 photobleaching를 제한 합니다.</li>
	<li>캡처 해상도 증가 하 고 느린 검색 속도 때 이미지 데이터를 수집할 준비가.</li>
	<li>경우 허용 하는 confocal 악기, 광자 계산 모드를 사용 하 여 데이터를 수집 합니다. 참고: 광자 계산 사용할 수 없는 경우는 악기에: 회색은 선형 이미지 수집 동안 보장.</li>
	<li>1 공기 단위 (AU)를 사용 하는 각 레이저 라인에 대 한 작은 구멍을 설정 합니다.</li>
	<li>사용 선 또는 프레임을 검출기를 줄이기 위해 이미지 수집 (x4) 동안 평균 소음 관련. 참고: ICS의이 변종에만 한 시간-포인트 캡처한 획득 시간 아니다 실험적인 요소를 제한.</li>
	<li>이미지 컬렉션 선택 높은 배율, 최대 해상도 (예로 계획-Apochromat 100 X 63 X /1.40 구형과 반음계 aberrations에 대 한 보정을 제공 하기 위해 계획 Apochromat 목표 등 높은 수 가늠 구멍 목표에 대 한 오일 목표).</li>
	<li>이미지 내에 포함 된 캡처된 픽셀의 크기 oversample 각 픽셀 50 x 50 nm 영역을 포착 하는 것이 좋습니다. 효과적인 ICS에 대 한 픽셀 크기 픽셀 당 0.1 µ m2 x 0.1 미만 이어야 합니다. 이 스캔 비교적 작은 영역을 확대 하 고 상대적으로 큰 이미지 형식 (예: 1024 x 1024 또는 2048 x 2048 픽셀)을 선택의 조합에 의해 이루어집니다.</li>
	<li>지역 수 평면에 셀의 꼭대기 또는 기저 표면에 초점. 하나의 이미지와 IC 분석 하는 동안 개별적으로 처리 하는 관심 영역에 여러 개의 셀을 수집할 수 있습니다.</li>
	<li>샘플 정규화에 사용할 동일한 계측기 설정을 사용 하 여 셀 무료 배경 영역을 캡처하십시오.</li>
</ol>5입니다. 이미지 상관 분광학의 계산
참고: 오픈 소스 영상 처리 플랫폼, 피지, ImageJ 프로그램의 배포 상관 및 IC에 필수적인 수학 함수를 수행 해야 합니다. ImageJ의이 배급으로 수많은 사전 설치 된 플러그 인 및 여러 이미징 실험에 걸쳐 작업을 수행할 수 있는 쉽게 업데이트 아키텍처를 포함 것이 좋습니다.
<ol><li>피지 프로그램 (http://fiji.sc/Downloads)를 설치 합니다.</li>
	<li>인수 데이터 집합을 로드 합니다.</li>
	<li>관심과 복제 2n (256 x 256, 128 × 128, 64 × 64)의 픽셀 크기를의 꼭대기 또는 기저 세포 표면 막 영역을 식별 합니다. "메뉴: 이미지 &gt; 중복..."</li>
	<li>관심의 자른 영역의 평균 강도 계산 "메뉴: 분석 &gt; 측정."</li>
	<li>배경 영역을 식별 하 고 캡처 세포 표면 막의 같은 픽셀 크기를 중복 (2n: 256 x 256, 128 × 128, 64 × 64). "메뉴: 이미지 &gt; 중복..."</li>
	<li>관심의 영역을 자른 배경의 평균 농도 계산 합니다. "메뉴: 분석 &gt; 측정."</li>
	<li>관심 영역을 포함 하는 이미지에서 백그라운드의 평균 강도를 뺍니다. "과정 &gt; 계산기 이미지 &gt; 빼기."</li>
	<li>
상관 계산을 수행 합니다. 이 계산 메뉴 구조 내에 포함 된: "과정 &gt; FTT &gt; FD 수학."
	<ol>
<li>FD 수학 대화 상자 선택: 이미지 1: 자른 이미지 이름, 상관 관계, 이미지 2 작업: 자른 이미지 이름, 역 변환에.</li>
	</ol>
</li>
	<li>픽셀의 총 수로 나누어 결과 이미지를 정상화. "메뉴: 프로세스 &gt; 수학 &gt; 분할..." (예: 64 x 64 픽셀 = 4096)</li>
	<li>정상화 다시는 정규화의 평균 휘도로 나누어 자른 영역 제곱. "메뉴: 프로세스 &gt; 수학 &gt; 분할..." 참고:이 두 번 평균 강도 값으로 이미지를 분할 하 여 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>포인트 확산 기능을 통해 선을 그립니다.</li>
	<li>피크 값을 계산 하려면이 줄의 프로필을 플롯 합니다. "메뉴: 분석 &gt; 프로필 그림."</li>
	<li>스프레드시트에 피크 값 (5.12의 결과)를 전송 하 여 빔 지역 당 클러스터를 계산 하 고 다음 계산 (Eq 6)를 수행: <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq7v2.jpg">
</li>
</ol>6. 일괄 처리 IC 데이터 집합의
참고: 피지/ImageJ 매크로의 설립 위의 프로토콜에 설명 하는 절차를 복제 하는 것이 좋습니다. 여러 이미지 파일의 일관 되 고 신속한 분석을 위한 이미지 상호 관계 분광학 분석 하는 동안 수 있습니다.
<ol><li>ICS 프로토콜에서 각 메뉴 명령을 기록 하 여 매크로 IC 워크플로 설정 "메뉴: 플러그인 &gt; 매크로 &gt; 기록...".</li>
	<li>"만들기" 매크로 생성을 선택 합니다.</li>
	<li>선택 "언어 &gt; IJ1 매크로."</li>
	<li>매크로 저장 합니다.</li>
	<li>
각 함수의 운영자에 게 알림을 제공 하는 매크로의 다양 한 단계를 대화 상자를 추가 합니다. 대화 상자는 또한 적절 한 선택 이전에 추가 처리 (즉, 영역 자르기) 만들 수 있도록 분석 프로세스를 일시 중지 하는 방법으로 봉사
	<ol>
<li>대화 상자에 매크로 코드 제목 = "대화 상자 제목"; msg = "대화 상자/프로토콜 단계 메시지"; waitForUser (제목, msg); 참고: 추가 효율성 피지 업데이트 (지침 https://imagej.net/BAR) 내에서 바 업데이트 사이트에 가입 하 여 설정할 수 있습니다. 이 "광범위 하 게 적용 가능한 루틴의 컬렉션" 14피지를 제공 한다. 이러한 루틴을 하나 찾기 봉우리 이다. 메뉴 구조: "바 &gt; 데이터 분석 &gt; 찾기 봉우리." 이 스크립트는 빠른 포인트의 프로필에 피크 값 확산 함수 계산의 의미를 제공 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 현미경의 광선 영역 프로토콜 확장: 계산
참고: 현미경의 광학 전달 함수 개체도 분자 크기의 약의 반경 가진 이미지로 나타납니다 보장 x y 평면에서 200-300 nm. ICS 프로토콜 하위 해상도 형광 구슬에 4-5 단계를 수행 하 여 포인트 확산 함수의 결정을 수 있습니다. 특히:
<ol><li>하위 해상도 탑재 (예: &lt; 100 nm 직경) 8에 형광 구슬 챔버 이미징 슬라이드.</li>
	<li>ICS 실험에 대 한 활용 하는 confocal 현미경을 사용 하 여 설명된 프로토콜에 따라 이미지 구슬.</li>
	<li>프로토콜 단계 5.1-5.13에 따라 결과 이미지에서 ICS 함수를 계산 합니다.</li>
	<li>그려진된 프로필에서 ICS 기능의 절반 최대 값에서 전체 폭으로 빔 반지름 (r)을 계산 합니다.</li>
	<li>계산 하는 빔 영역 (BA) (Eq 7):<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq8v2.jpg">
</li>
</ol>8. 프로토콜 확장: 단위 면적 당 클러스터의 계산
<ol><li>(Eq 8)로 지역의 단위 당 클러스터 밀도 (CD)를 계산: <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq9v2.jpg"> <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq10v2.jpg">
</li>
	<li>빔 (7.5의 결과)의 영역으로 빔 지역 (5.13의 결과) 당 클러스터를 나눕니다.</li>
</ol>

<ol><li>Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Antibody therapy of cancer.</a> Nature reviews. Cancer. 12 (4), 278-287 (2012).</li>
<li>Parslow, A. C., Parakh, S., Lee, F. -T., Gan, H., Scott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-Drug+Conjugates+for+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Antibody-Drug Conjugates for Cancer Therapy.</a> Biomedicines. 4 (3), 14(2016).</li>
<li>Sorkin, A., Waters, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of growth factor receptors.</a> BioEssays. 15 (6), 375-382 (1993).</li>
<li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+J+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. , Springer Science & Business Media. (2006).</li>
<li>Petersen, N. O., Höddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy%3A+concept+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophysical Journal. 65 (3), 1135-1146 (1993).</li>
<li>Wiseman, P. W., Petersen, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Correlation+Spectroscopy.+II.+Optimization+for+Ultrasensitive+Detection+of+Preexisting+Platelet-Derived+Growth+Factor-%CE%B2+Receptor+Oligomers+on+Intact+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Image Correlation Spectroscopy. II. Optimization for Ultrasensitive Detection of Preexisting Platelet-Derived Growth Factor-β Receptor Oligomers on Intact Cells.</a> Biophysical Journal. 76 (2), 963-977 (1999).</li>
<li>Costantino, S., Comeau, J. W. D., Kolin, D. L., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+Dynamic+Range+of+Spatial+Image+Correlation+and+Cross-Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Accuracy and Dynamic Range of Spatial Image Correlation and Cross-Correlation Spectroscopy.</a> Biophysical Journal. 89 (2), 1251-1260 (2005).</li>
<li>Claire Robertson, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+and+practical+recommendations+for+autocorrelation-based+image+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Theory and practical recommendations for autocorrelation-based image correlation spectroscopy.</a> Journal of Biomedical Optics. 17 (8), 080801(2012).</li>
<li>Ciccotosto, G. D., Kozer, N., Chow, T. T. Y., Chon, J. W. M., Clayton, A. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+Distributions+on+Cells+Determined+by+Photobleaching+Image+Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Aggregation Distributions on Cells Determined by Photobleaching Image Correlation Spectroscopy.</a> Biophysical Journal. 104 (5), 1056-1064 (2013).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="https://imagescience.org/meijering/publications/1115/">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).</li>
<li>Rappaz, B., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+correlation+spectroscopy+for+measurements+of+particle+densities+and+colocalization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Image correlation spectroscopy for measurements of particle densities and colocalization.</a> Current protocols in cell biology. , Chapter 4, Unit 4.27.1-15 (2013).</li>
<li>Ferreira, T., Hiner, M., Rueden, C., Miura, K., Eglinger, J., Chef, B. tferrS. criptsB. A. R. tferr/Scripts: BAR 1.5.1. Zenodo. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://zenodo.org/record/495245">https://zenodo.org/record/495245</a> (2017).</li>
<li>Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Correlation+Spectroscopy%3A+Past%2C+Present%2C+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Correlation Spectroscopy: Past, Present, Future.</a> Biophysical Journal. 101 (12), 2855-2870 (2011).</li>
<li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+molecular+interactions+in+living+cells+by+FRET+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy.</a> Current opinion in chemical biology. 10 (5), 409-416 (2006).</li>
<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2835776/">Super-Resolution Fluorescence Microscopy.</a> dx.doi.org.ez.library.latrobe.edu.au. 78 (1), 993-1016 (2009).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li>
<li>Nohe, A., Petersen, N. O. <a target="_blank" href="http://stke.sciencemag.org/content/2007/417/pl7">Image Correlation Spectroscopy.</a> Sci. Signal. (417), pl7(2007).</li>
</ol>

앤드류 M 스콧 자금 지원을 AbbVie 조제 학, EMD 세로 노와 다이 이치 산 쿄 공동 연구와 컨설팅 및 생명 공학 의약품의 주식 소유권을 하고있다. 저자는 다른 관련 제휴 또는 어떤 조직으로 금융 참여 또는 법인 금융 관심이 나 주제 또는 공개 그 외 원고에서 설명 하는 자료와 함께 금융 충돌 있다.

우리가이 프로토콜에서 설명 하는 이미지 상호 관계 분광학 (IC)의 기술 특수 감지기에 대 한 필요 없이 표준 confocal 현미경을 사용 합니다. ICS 기술 설명 잘 설립 immunocytochemistry 메서드 증가 통계 분석에 대 한 여러 치료 조건의 빠른 샘플링을 사용 합니다. 이 방법론 confocal 볼륨, 형광 등을 통해 확산 모바일 분자의 형광 동요의 상관 관계에 따라 대체 단일 분자 기법에 비해 절대 정밀도에 약간의 감소와 함께 저러 상호 관계 분광학 (FCS)15. 보다 전문적인된 FCS 접근에는 눈사태 포토 다이오드 (APD) 같은 감지기 또는 표준 confocal 악기에 일상적으로 사용할 수 있는 전용된 전문된 소프트웨어와 함께 GaAsP 경보기를 계산 하는 높은 감도 광자를 필요 합니다. IC의 정밀도 대 한 포괄적인 분석 결정이 기술을 정확 하 게 클러스터의 수를 측정할 수 있는 > 1 입자 빔 초점 레이저 스캔 현미경7</...

치료 항 체의 개발에는 여러 종양 종류1의 치료에서 놀라운 성공을 보이고 있다. 마약 항 체 어원이 같은 말 (ADC)의 최근 발전으로 세포 독성 화합물에 대 한 전달 메커니즘 셀에 항 체: 수용 체 상호 작용의 역동성을 이해 하기 위한 요구 사항을 확대 하고있다2표면. 성공적인 타겟팅 세포 표면 수용 체에 항 체의, 다음이 단지 리간드: 항 체 상호 작용3에서 관찰 된 그 유사 집계 패턴을 유도할 수 있다. 수용 체 집계에서 변경 셀 표면에서 막 하는 수용 체와 그것의 제거의 결과 국제화에 변화를 유도할 수 있다. 항 체 약물 켤레의 맥락에서이 프로세스 이후에 내 면된 endosomes와 이후 효과적인 셀 죽이 결과 세포질 세포 독성 페이로드를 해제 합니다.
Confocal 현미경 검사 법은 항 체와 그들의 대상 수용 체4의 이러한 중요 한 상호 작용을 시각화 하는 효과적인 수단을 제공 했다. 집계 대상 분자 세포 표면에서의 변화를 탐험이 프로토콜 활용 공간 이미지 상호 관계 분광학 (IC) 기술 5,6,7 통해 confocal 현미경 이미지의 후 처리 .
이미지 상관 분광학의 기초 공간 형광 강도 변동 관계 레이블이 구조체의 밀도 및 집계 상태를 공유 하는 관찰 이다. 이 관계는 캡처된 이미지5의 공간 자기 상관 함수의 계산에 따라 설정 됩니다.
이미지 상관 분광학의 모든 이체는 이미지 상관의 계산이 필요합니다. 이것은이 기능을 양적 집계 상태 매개 변수는 이미지 내에 포함 된의 추출에 대 한 2 차원 가우스 곡선 피팅 옵니다. 간단히에서 이미지 상관의 계산 포함 됩니다 모두 이미지에 포함 된 및 가능성을 계산 가능한 픽셀 쌍을 비교 하는 둘 다 동등 하 게 서로 밝은. 이 거리의 기능과 픽셀 분리8방향으로 시각 이다.
이미지 상호 관계 분광학에 대 한 이론적 프레임 워크 그리고 피터슨과 Wiseman 외정의 설립 되었다. 5 , 6.이 프로토콜 상관 계산 피지/ImageJ 스프레드시트 응용 프로그램에서 수행 됩니다, 강도 변동 공간 자기 상관 함수에 대 한 기준 (Eq 1)로 기술 될 수 있다:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq1v2.jpg">     
여기서 F 나타냅니다 푸리에 변환을; F− 1 역 푸리에 변환; F * 복소수; 공간 지연 변수 ε 그리고 η. 공간 IC에서이 프로토콜에서 설명 된 대로 자기 상관 함수 계산할 수는 2D 빠른 푸리에 변환 알고리즘7,9를 사용 하 여. 0-지연, g11(0, 0)로 그렇지 않으면 알려진 제로 공간 별거에 상관 입자 빔 현미경의 영역 당 현재 역 평균 수를 제공 합니다. 그것은 2 차원 가우스 함수 (Eq 2)공간 자기 상관 함수를 피팅 하 여 얻을 수 있습니다.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq3v2.jpg">     
와 픽셀 이미지 내에서 캡처 영역 설정된에 포함 된 이러한 측정 무한대로 확장 되지 않습니다, 용어 g∞ 이미지 내에 포함 된 장거리 공간적 상관을 오프셋으로 사용 됩니다. 분자 크기의 집계, ω 현미경의 포인트 확산 함수 이며 반-최대 공간 자기 상관 함수에의 전체 폭에 의해 설명. 악기의 확산 기능에 포함 된 지역 하위 해상도 형광 구슬을 사용 하 여 측정 될 수 있다.
여기에 설명 된 이미지 상호 관계 분광학 프로토콜, 상관 및 ICS를 완료 하는 데 필요한 수학 함수는 사용 하 여 수행 오픈 소스 영상 처리 플랫폼, 피지10는 ImageJ의 분포 프로그램11,12. 피지/ImageJ FFT 수학 함수에 사전 설치 된 빠른 푸리에 변환을 사용합니다. 이 기능은 각 차원13에서 2의 요인에 의해 데이터의 범위를 줄임으로써이 계산의 계산 시간을 줄일 수 있습니다. 2D 자기 상관 함수는 x, y 축에서에서 대략 대칭 상관 이미지를 통해 한 줄 프로필 플롯 원시 자기 상관 공간 지연의 기능으로 측정을 사용할 수 있습니다. 모든 0 지연 잡음 추가 계산을 하기 전에, 결과 상관 진폭 (피크 값, g(0)T)와 식 (Eq 3)와 함께 배경에 대 한 수정 제거 됩니다.
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq4v2.jpg">     
어디 내가b 셀을 제외 하는 배경 영역에서 평균 강도 이다. 클러스터 밀도, 또는 형광 개체의 밀도 (Eq 4)에 의해 정의 됩니다.
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq5v2.jpg">    
여기에 설명 된 프로토콜 우리 가정 접근 공간 지연 증가 함께 1.0 값을 정규화 된 자기 상관 함수 것입니다 붕괴는 관찰을 바탕으로 단순히 클러스터 밀도 (CD)의 계산을 더. 최대 공간 피로 더 이상 어떤 상관 관계가 형광의 강도 값 하 고 따라서 상관 없이이 지역에서 계산 컴퓨팅 나눈 이후에이 강도 곱한 강도 값은 그 강도, 정의 1.0의 광장. 따라서, 클러스터 정규화 된 자기 상관 함수에서 밀도 상호 (Eq 5)을복용 하기 전에 정규화 된 자기 상관 함수에서 1.0을 빼서 계산 될 수 있다:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq6v2.jpg">     
악기의 포인트 확산 함수의 영역 내에 포함 된 클러스터 수를 quantitate 하 빔 영역의 추가 보정을 수행할 수 있습니다. 이 교정은 이미지 상호 관계 분광학 분석 중에 사용 하는 동일한 광학 조건을 사용 하 여 수행 되어야 합니다.

<table><tbody><tr><td>Nunc Lab-Tek II 챔버 커버 글라스 - 8</td>웰 <td>ThermoFisher Scientific</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x), 페놀 레드 없음</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11013</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck 형광 마이크로스피어 표준 0.1&micro; m</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T7279</td><td></td></tr><tr><td>세툭시맙</td><td>머크 세로노</td><td>3023715501</td><td></td></tr><tr><td>파라필름 M 38mx100mm</td><td>머크 밀리포</td>어 <td>BRND701605</td><td></td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드(포름알데히드) 수용액</td><td>ProSciTech</td><td>C004</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 EGF</td><td>R& D 시스템</td><td>236-EG</td><td></td></tr></tbody></table>

confocal 현미경 검사 법 밝혀 세포 표면 수용 체 이미지 상관 분광학을 통해 집계

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Confocal 현미경 검사 법 특성화 및 형광 프로브로 분류 하는 전 임상 에이전트의 추가 개발에 대 한 중요 한 하위 세포 상호 작용을 캡처를 액세스할 수 있는 방법론을 제공 합니다. 기반으로 하는 항 체 세포 독성 약물에 최근 전진으로 전달 시스템, 수용 체 집계 및 국제화의 영역 내에서 이러한 에이전트에 의해 유도 된 변경 이해 중요 한 중요성 이다. 이 프로토콜 활용 하 여 형광 immunocytochemistry의 잘 설립 방법론 및 오픈 소스 피지 분포 ImageJ, inbuilt 상관와 이미지 수학 함수, 공간 이미지 상관 관계를 수행 하 분광학 (IC)입니다. 이 프로토콜은 공초점 현미경의 광선 영역의 기능으로 레이블이 지정 된 수용 체의 형광 강도 quantitates. 이 세포 표면에 대상 분자 집단의 국가의 양적 측정을 제공합니다. 이 방법론은 수용 체 집합의 일시적인 수사로 확장 하는 잠재력을 가진 정적 셀의 특성에 초점. 이 프로토콜은 클러스터링 기술 및 비 전문 이미징 장치 설립 잘 활용 하 여 세포 표면에서 발생 하는 이벤트의 정량화를 제공 하는 접근 방법론을 선물 한다.

성공적인 이미지 상호 관계 분광학 실험 치료 컨트롤의 적절 한 응용 프로그램에 따라 달라 집니다. 이러한 치료 그룹 없이 1 차적인 항 체 및 이차 항 체 치료 그룹이 없는 형광의 검사를 포함합니다. 실험에 대 한 최적의 confocal 레이저 설정 설정 되 면 이미지 샘플 내에서 일반적인 형광의 부족을 확인 하이 컨트롤 그룹의 캡처할 수 해야 합니다. 많은 부착 암 세포 라인에 대 한 ICS에 대 한 적합 한 영역의 식별 평면의 부족에 의해 제한 됩니다. 이 단일 confocal 이미지에 여러 개의 암 세포의 큰 시야를 잡으려고 기능에 의해 보상 된다. 이 치료 그룹 간의 통계적 비교를 수행 하기 위해 필요한 샘플링을 생성 하는 기능을 제공 합니다.
이 대표적인 실험 A431 EGFR 긍정적인 해 암 세포, EGFR 클러스터링을 유도 하기 위해 실 온에서 10 ...

바인딩할 대상 수용 체 세포 표면에 항 체 구조와 클러스터링 변경 부여 수 있습니다. 이러한 동적 변경 내용이 대상 셀에 약물 개발 특성화에 대 한 영향을 미칠. 이 프로토콜 confocal 현미경 검사 법 및 이미지 상호 관계 분광학 ImageJ/피지 수용 체 세포 표면에 클러스터링의 척도를 통해 활용 합니다.

Confocal 현미경 검사 법 밝혀 세포 표면 수용 체 이미지 상관 분광학을 통해 집계

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

이 이미지 상관 분광법 프로토콜의 전반적인 목표는 세포 표면에서 발생하는 클러스터링 이벤트의 정량화를 위한 접근 가능한 방법론을 제공하는 것입니다. 세포 표면의 수용체에 결합하는 항체는 확인 및 클러스터링 변경을 제공할 수 있습니다. 이러한 동적 과정에 대한 분석은 약물 표적의 특성화에 중요합니다.이 기술의 주요 장점은 쉽게 접근할 수 있는 이미징 장치를 사용하여 세포 표면에서 클러스터링 이벤트를 정량화하기 위한 접근 가능한 방법론을 제공한다는 것입니다. 시작하려면 10,000개의 A431 표피 암종 세포를 8개의 챔버로 구성된 이미징 슬라이드의 각 웰에 파종합니다. 다음 날, EGF 수용체 응집을 자극하기 위해 EGF 리간드를 밀리리터당 100나노그램을 세포에 즉시 첨가합니다.리간드로 세포를 고정하기 전에 실온에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 함께 제공되는 텍스트 프로토콜의 면역세포화학 및 공초점 이미지 프로토콜에 따라 수집 중에 사용된 설정에 세심한 주의를 기울이고 획득한 데이터 세트를 피지에 로드합니다. 과포화는 피해야 합니다.최종 이미지에는 1미크론 제곱 미만의 픽셀 크기가 포함되어야 합니다. 또한 정점 또는 기저 표면의 평평한 표면과 나중에 샘플 정규화를 위해 cell-free 영역을 캡처합니다. 첫 번째 이미지에서 관심 있는 정점 또는 기저 세포 표면막 영역을 식별하는 것으로 시작합니다.2에서 n까지의 픽셀 크기를 256 x 256, 128 x 128 또는 64 x 64 범위에서 선택합니다. 그런 다음 이미지 메뉴로 이동하여 복제를 선택합니다. 다음으로 분석으로 이동하여 측정으로 이동합니다.자른 관심 영역의 평균 강도를 계산합니다. 이제 원본 이미지에서 같은 크기의 배경 영역을 식별합니다. 이전과 같이 복제하십시오.그리고 관심 있는 배경이 잘린 영역의 평균 강도를 계산합니다. 관심 영역과 배경을 모두 측정한 상태에서 프로세스로 이동하여 이미지 계산기를 선택합니다. 관심 영역을 이미지 1로, 배경 이미지를 이미지 2로 배치하고 빼기를 작업으로 선택합니다.그런 다음 프로세스 메뉴로 이동합니다. FFT로 이동하여 FD Math를 선택합니다. FFT 수학 대화 상자에서 여기에 표시된 대로 이미지 입력을 선택하고 상관 관계가 있도록 작업을 설정합니다.역 변환이 켜져 있는지 확인합니다. process를 선택하고, math까지 아래로 스크롤하고, divide를 선택하고, 대화 상자에 총 픽셀 수를 입력하여 결과 이미지를 정규화합니다. 그런 다음, 정규화된 자른 면적의 평균 강도를 제곱하여 다시 정규화합니다.다음으로, 점 확산 함수를 통해 선을 그립니다. 이 선의 프로파일을 플롯하여 피크 값을 계산하려면 analyze로 이동하고 plot profile을 선택합니다. peak 값을 spread sheet로 전송하여 beam area당 clusters를 계산합니다.그런 다음 빔 영역당 클러스터를 피크 값에서 1을 뺀 값보다 1 위로 설정합니다. 이미지를 일괄 처리하려면 Fiji 매크로를 설정하는 것이 좋습니다. 이를 통해 이미지 상관 분광법 분석을 위해 여러 컨포칼 이미지를 일관되고 신속하게 분석할 수 있습니다.이미지 상관 분광법 작업 흐름에 대한 매크로를 설정하려면 프로토콜의 각 메뉴 명령을 기록하도록 프로그램을 설정합니다. 이를 위해 플러그인으로 이동하여 marcos로 이동한 다음 record를 선택합니다. 그런 다음 기본 창으로 돌아가서 이 비디오의 이전 섹션에서 설명한 프로토콜을 실행합니다.완료되면 매크로 창으로 돌아가서 만들기를 선택하여 매크로를 생성합니다. 그런 다음 매크로 편집 창에서 언어를 LJ1 매크로로 선택해야 합니다. 선택하지 않으면 프로그램을 실행할 수 없습니다.마지막으로 매크로를 저장합니다. 현미경의 광학 전달 기능은 분자 크기의 물체도 XY 평면에서 200-300나노미터 사이의 이미지로 나타나도록 합니다. 이 프로토콜에 설명된 바와 같이 세포와 동일한 방식으로 sub-resolution fresin beads를 이미징하여 현미경의 점 확산 기능 면적을 계산할 수 있습니다.이 이미지는 세포 표면 EGF 수용체를 표적으로 하는 세툭시맙 1차 항체로 표지된 EGF 자극 및 시뮬레이션되지 않은 부착 A431 표피암 세포를 나타냅니다. 노란색 상자는 픽셀 치수가 64 x 64인 작물 영역을 포함하는 세포막을 나타냅니다. 이 이미지는 이미지 상관 분광법 분석을 수행하는 데 사용되었습니다.자기 상관 함수의 정규화 후 점 확산 함수는 선 도구를 사용하여 측정할 수 있습니다. 이 line 함수의 프로파일은 피크 값을 감지하기 위해 플롯됩니다. 이러한 방법을 사용하여 EGF 자극은 자극되지 않은 세포에 비해 빔 영역당 검출된 EGFR 클러스터에서 2.56배 감소를 유도하는 것으로 관찰되었습니다.일단 마스터하면 컨포칼 이미지를 분석하는 데 이미지당 몇 분 밖에 걸리지 않습니다. 이 절차를 시도하는 동안 이 프로토콜에 설명된 설정을 사용하여 모든 실험 조건의 여러 반복을 수집하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 이미지 상관 분광법을 확장하여 타임 랩스 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 클러스터링 이벤트의 시간적 변화를 탐색할 수 있습니다.개발 후 이 기술은 연구자들이 사진 표백 ICS를 사용하여 고차 응집 상태를 탐색하는 동시에 이미지 교차 상관 분광법 방법론을 사용하여 두 막 기반 단백질의 공동 국소화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 관심 있는 세포 표면 분자의 클러스터링 상태를 계산하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Neisseria meningitidis (NM), g 부정적인 인간 특정 호흡기 병원체가 인간 α - actinin에 바인딩할 수 있습니다. 여기 우리는 인간의 뇌 microvascular 내피 세포 (HBMECs)에 세균 입국 후 α - actinin 세포와 세균의 colocalisation의 시각화를위한 프로토콜을 제시한다.

의 세포 상호 작용 Visualisation 및 부량 Neisseria meningitidis</em공촛점 이미징에 의해 α - actinin>과 인간

살아있는 세포의 플라즈마 막의 형광 단백질 지질 뗏목의 파티션을 알아내기 위해 기술이 설명되어 있습니다. 그것은 지질 보트 내부 또는 외부에있는 단백질의 확산시기에 불균형을 이용합니다. 취득이 통제 조건이나 약물 이외 후에 동적으로 수행할 수 있습니다.

지질 뗏목의 결정은 형광 상관 분광학 (FCS)에 의해 살아있는 세포에서 Fluorescently 태그가 추가된 프로브의 파티션

따라서, 그것이 관여 단백질의 공간적 및 시간적 행위를 파악하는 것이 중요 신호 전달 이해하기 위해, 플라즈마 막 내에서 또는 세포 내 위치에 두 단백질의 compartmentalization 크게 신호 결과에 영향을 미칠 수있는 규제 메커니즘입니다. 우리는 여기서 T 세포의 신호 전달을 연구하는 TIRF 현미경 기반 시스템을 설명하지만, 광범위하게 적용됩니다.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

우리는 단일 세포의 세 차원 공 촛점 형광에서 가져 정의되지 않은 형태의 형태학의 변화를 측정하기 Imaris 신경 과학, ImarisXT 및 MATLAB을 사용하는 소프트웨어 플랫폼을 개발했습니다. 이 새로운 접근 방식은 수용체 활성화에 따라 세포 모양의 변화를 수량화하는 데 사용되므로 약물 발견을위한 가능한 추가 도구를 나타냅니다 할 수 있습니다.

3 차원 형광 이미지에서 세포 형태학의 변경 사항 단정 지을 분석 도구

이 비디오에서는 HEK 세포 응집 분석을 통해 시냅스 세포 접착 분자 간의 세포 간 상호 작용을 측정하는 기술을 보여줍니다. 이 분석에서는 원하는 시냅스전 세포 접착 분자와 형광 단백질을 발현하는 동일한 수의 HEK 세포를 시냅스후 세포 접착 분자 및 다른 형광 단백질을 발현하는 HEK 세포와 혼합합니다. 세포 접착 분자 간의 상호 작용은 세포를 응집시키며, 이는 형광 현미경으로 측정할 수 있습니다.

Cell Adhesion Molecules 간의 Trans Interaction을 검출하기 위한 Cell Aggregation Assay

이 동영상은 형광 변동 분광법(fluorescence fluctuation spectroscopy)을 사용하여 세포 간 접촉에서 세포 표면 단백질 간의 상호 작용을 감지하는 방법을 보여줍니다. 형광 단백질로 표지된 관심 대상인 막관통 접착 수용체를 발현하고 스펙트럼으로 분리된 두 개의 형광 표지를 가진 두 개의 서로 다른 세포 집단을 혼합함으로써, 서로 다른 색의 형광을 가진 두 인접 세포의 수용체 간의 trans-interaction은 형광 강도 변동의 교차 상관관계를 통해 평가됩니다.

세포 접촉에서 단백질 상호 작용을 연구하기 위한 형광 변동 분광법(Fluorescence Fluctuation Spectroscopy)

이 비디오는 단백질 호모올리고머화를 연구하기 위한 형광 변동 분광법(FFS) 기술을 보여줍니다. 샘플의 형광 표지된 단백질은 FFS를 사용하여 단백질 올리고머화를 연구할 때 에이전트를 사용하여 이합체화됩니다. 컨포칼 현미경을 사용하여 단백질이 작은 관찰 부피 안팎으로 이동할 때 단백질의 올리고머 상태를 결정하기 위해 형광 분자의 밝기 변동 분석을 수행합니다.

단백질 호모올리고머화(Homo-Oligomerization)를 연구하기 위한 형광 변동 분광법(Fluorescence Fluctuation Spectroscopy)

우리는 T 세포 활성화 과정 중에 단백질 역학에 대한 통찰력을 제공하는 라이브 세포 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 정량적 인 결과는 T 세포 활성화에 걸쳐 복잡한 형성 신호를 따라 열매를 산출하는 T 세포의 확산 분석, 공 촛점 현미경 및 이미징 분석의 결합 사용을 보여줍니다.

T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

이 프로토콜은 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포 표면의 단일 수용체를 시각화 및 추적하여 수용체 측면 이동성, 수용체 복합체의 크기를 분석하고 일시적인 수용체-수용체 상호 작용을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 막 단백질로 확장될 수 있습니다.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

이 프로토콜 중재-셀 상호 작용, 즉 단백질 세포 접합, 살아있는 세포에 직접에 단백질 간의 상호 작용을 조사 하는 형광 변동 분광학 기반 방식을 설명 합니다. 우리 악기 교정, 데이터 수집 및 분석, 보정 가능한 인 위 소스에 자세한 지침을 제공 합니다.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

우리는 살아있는 세포의 혈장 막에서 리간드 결합에 의해 유도된 mEGFP 태그-수용체 올리고머의 평균 올리고머 상태의 측정을 위한 이미징 접근법을 기술한다. 이 프로토콜은 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 검사법과 숫자 및 밝기(N&amp;B) 분석을 기반으로 합니다.

총 내부 반사 형광 현미경 검사법에 의해 살아있는 세포에 있는 세포 표면 수용체의 올리고머화 역학 은 수 및 밝기 분석과 결합됩니다

배우세요 공초점 현미경과 이미지 상관 분광학을 이용한 세포 표면 수용체 집계 정량화 방법을. 이 기술은 약물 표적 특성화 및 수용체 역학 연구에 필수적입니다.

Confocal 현미경 검사 법 밝혀 세포 표면 수용 체 이미지 상관 분광학을 통해 집계

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