Fluorescence Anisotropy-based Detection of Protein-Protein Interaction(단백질-단백질 상호작용의 형광 비등방성 기반 검출)

형광 이방성 기반 단백질-단백질 상호작용 검출을 위해 적절한 이방성 완충액에서 C-말단 테트라시스테인 모티프로 태그된 재조합 표적 단백질로 시작합니다.

형광단 함유 염료를 추가하여 테트라시스테인 모티프를 통해 표적 단백질에 결합합니다. 이방성 완충액으로 투석하여 결합되지 않은 염료를 제거합니다. 혼합물을 석영 큐벳으로 옮깁니다. 흡광도를 측정하여 성공적으로 표지된 표적 단백질의 비율을 결정합니다.

형광 큐벳에서 형광단 표지된 표적 단백질과 표지되지 않은 단백질을 혼합합니다. 분광형광계를 사용하여 형광 이방성을 측정합니다.

표적 단백질이 완충액에 자유롭게 부유함에 따라 표적 단백질에 부착된 형광단은 브라운 운동으로 인해 축을 중심으로 무작위로 회전합니다. 적절한 파장의 수직 편광으로 여기되면 형광단은 수직 및 수평면에서 편광된 빛을 방출합니다. 수직 및 수평 편광 방출의 형광 강도 비율(이방성)이 측정됩니다.

표지되지 않은 단백질이 형광단 표지 표적에 결합하면 단백질 복합체의 분자 크기가 증가하여 회전 운동이 감소합니다. 결과적으로 방출된 빛은 더 편광되어 수평면보다 수직면에서 더 높은 방출을 하여 이방성을 증가시킵니다.

표지되지 않은 단백질의 농도를 증가시키고 이방성 측정을 반복합니다.

표지되지 않은 단백질 첨가의 증가와 함께 이방성의 비선형 증가는 형광단 태그가 지정된 표적 단백질의 여러 개의 동일하지 않은 결합 부위에서 표지되지 않은 단백질 결합을 나타냅니다.

SBDS-FlAsH 단백질 3나노몰과 Lumio Green 염료 3나노몰을 5마이크로리터 부피의 이방성 완충액에 혼합합니다. 섭씨 4도에서 8시간 동안 반응을 진행합니다. 8시간 후, 이방성 완충액에 대해 밤새 샘플을 투석하여 유리 염료를 제거합니다. 석영 큐벳을 사용하여 분광 광도계에서 280나노미터 및 508나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 그런 다음 Lambert-Beer 법칙을 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 표지된 단백질의 백분율을 정량화합니다.

이방성 값을 측정하기 전에 단백질 리간드의 각 적정 단계를 신중하게 수행하여 전체 샘플이 용액에 분배되고 균질해지도록 해야 합니다.

형광 큐벳에 200마이크로리터의 30나노몰 SBDS-FlAsH를 이방성 완충액에 넣고 2마이크로리터의 30마이크로몰 EFL1을 적정합니다. 완전히 혼합하고 이방성과 형광 값을 측정하기 전에 반응을 3분 동안 그대로 둡니다. 총 40마이크로리터의 EFL1이 추가될 때까지 이 과정을 반복합니다. 마지막 단계로 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터를 추정된 바인딩 모델에 맞춥니다.