Name: 제자리에 근접 결 찰 분석 결과 사용 하 여 단백질 Isoforms의 Heterodimerization의 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 학습하세요 고정 세포에서 근접 결찰 분석(PLA)을 사용하여 MST1/MST2 단백질 이형이량체를 시각화하는 방법을 배우세요. 이 기술은 높은 감도로 단백질 상호작용을 검출하여 세포 신호전달 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 최적화 및 특정 마리아 Radu 갈리 나 Semenova에서이 프로토콜의 검증에 기여에 대 한 전체 Chernoff 연구소 감사. 우리는 또한 세포 이미징 시설 폭스 체이스 암 센터의 안드레이 Efimov 감사합니다. 이 작품은 JC (R01 CA148805) NIH에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

1입니다. 솔루션의 준비
<ol><li>통 솔루션 준비: 1 x PBS에 4 %paraformaldehyde (PFA). 10 ml, 16%의 2.5 mL 걸릴 PFA 1 x PBS의 7.5 mL를 추가. 위험: PFA는 낮은 복용량에 발암 성. 가스 및 피부 접촉 유해 있습니다. -20 ° c.에 게</li>
	<li>Permeabilization 솔루션을 준비: 0.1 %1 x PBS에 트라이 톤 X-100. 솔루션의 100 ml, 1 x PBS의 100 mL에 Triton X-100의 100 µ L를 추가 합니다. 실내 온도 (RT)에 저장 합니다.</li>
	<li>워시 버퍼 준비: 1 x TBST입니다. 1 L, 10 x TBS의 100 mL, dH2O, 890 mL 및 트윈 20 (10%)의 10 mL를 가져가 라.</li>
	<li>키트에 의해 제공 차단 솔루션을 준비 합니다. 또는 포함 하는 2% BSA 1 x PBS 솔루션 사용.</li>
	<li>키트에 의해 제공 항 체 희석 액을 준비 합니다. 1 x PBS 솔루션 1 %BSA 포함 하는 또는 사용.</li>
</ol>2입니다. 셀의 도금
참고: 이 연구에서 우리는 불멸 하 게 인간의 Schwann 세포 (iHSC)와 인간 미 발달 신장 293 세포 (HEK 293);를 사용 그러나, 많은 종류의 부착 세포에 대 한이 메서드를 사용할 수 있습니다.
<ol><li>DMEM 10% 보충에서 HEK 293 문화 FBS, 0.2% 포도 당, 2 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린 G과 5% CO2에서 37 ° C에서 조직 문화 취급 접시에 100 µ g/mL 스. 10 %FBS / DMEM 펜/Strep와 2 µ M 산림 보충 iHSC를 유지 합니다. Mycoplasma에 대 한 셀을 정기적으로 테스트 합니다. 셀 라인 인증 수행 되었다.</li>
	<li>10 µ g/mL 자연 마우스 laminin 또는 0.01% 폴 리-L-리 신 솔루션의 50 µ L 16-잘 챔버 슬라이드 코트와 5% CO2에서 37 ° C에서 30 분 동안 품 어. 0.04% 트립 신-EDTA를 사용 하 여 셀을 분할 합니다.</li>
	<li>플레이트 iHSC와 80% 합류 (15000-25000 셀/잘)에서 매체의 100 µ L에서 HEK 293.</li>
	<li>12에 대 한 셀을 품 어-24 시간 37 ° c에서 습도, 5% CO2 배양 기.</li>
</ol>3. 고정 및 Permeabilization
<ol><li>우물에서 매체를 제거 하 고 1 x PBS의 100 µ L로 씻어. 샘플을 제거의 위험을 최소화 하기 위해 micropipette와 발음.</li>
	<li>4 %PFA 당 잘 동요 없이 RT에서 10 분 동안 품 어의 50 µ L을 추가 하 여 셀을 수정. 셀은 초연에 과민 하다, 그래서 pipetting 셀에 직접 솔루션을 피 한다.</li>
	<li>0.05%로 세포 세척 TBST 5 분에 대 한 세 번. 샘플을 제거의 위험을 최소화 하기 위해 micropipette와 발음.</li>
	<li>Permeabilization 솔루션 (1 x PBS에 0.1% 트라이 톤 x-100) 셀 실시간에 동요 없이 10 분에 대 한 치료</li>
	<li>동요와 함께 각 5 분에 대 한 세 번 TBST 가진 세포를 씻어.</li>
</ol>4. 차단
<ol><li>(아주 부드럽게 micropipette)으로 TBST를 누릅니다. 셀 연결 된 남아 볼 수 현미경에 슬라이드를 시각화 합니다.</li>
	<li>차단 솔루션 x 1의 각 샘플 한 방울 (50-60 µ L)를 추가 합니다.</li>
	<li>미리는 습기 (물으로 빈 팁 상자) 37 ° C에서 열 하 고 37 ° c.에 1 시간을 위해 그것에 슬라이드를 품 어</li>
</ol>5. 1 차 항 체
<ol><li>항 체 희석제에 주 항 체 (1: 100)를 희석 ( 재료의 표참조). 잘 당 40 µ L 항 체 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>액체를 활용 하 여 슬라이드에서 차단 솔루션을 제거 합니다. 셀 건조를 허용 하지 않습니다.</li>
	<li>와 동 항 체 해결책의 40 µ L 각 우물에 추가.</li>
	<li>데워 습기에서 37 ° C에서 1 시간을 품 어.</li>
</ol>6. 근접 결 찰 조사 분석 결과
참고: PLA 프로브는 키트의 일부로 제공 됩니다 ( 재료의 표참조). 프로브 선택은 관심사의 단백질을 검출 하는 데 사용 하는 기본 항 체의 종류에 따라 달라 집니다.
<ol><li>두 개의 PLA 프로브 (반대로 마우스 빼기와 반대로 토끼 플러스) 희석 1:5 항 체 희석제에. 각 샘플에 대 한 PLA 프로브의 40 µ L를 준비 합니다. 실시간 20 분을 위한 혼합물을 품 어</li>
	<li>슬라이드에서 기본 항 체 솔루션을 누릅니다. 실시간에 두 번 세척 버퍼 각 5 분에 대 한 슬라이드를 세척</li>
	<li>부드럽게 슬라이드에서 워시 버퍼의 누르고 우물 (40 µ L/잘)에 희석제 PLA 프로브 솔루션을 추가 합니다.</li>
	<li>37 ° c.에 1 시간을 위한 미리가 열된 습도 챔버 슬라이드를 품 어</li>
</ol>7입니다. 결 찰
참고: 현장에 검출 시 약 레드, 리가, 고 결 찰 솔루션 키트의 일부로 제공 됩니다 ( 재료의 표참조).
<ol><li>사용 현장에 검출 시 약 레드.</li>
	<li>바로 전에 사용 하 여, 소용돌이 그리고 결 찰 사진 1: 5에 고 순도 물 x 5의 필요한 볼륨을 희석. 참고: 팬 들은 희석된 시 약의 정보를 저장 하지 마십시오.</li>
	<li>슬라이드에서 PLA 프로브 솔루션을 누릅니다. 워시 버퍼 두 번 5 분 마다 실시간 x 1에 슬라이드를 씻어</li>
	<li>추가 샘플, 직전 소용돌이 1시 40분에서 결 찰 솔루션에 리가 추가 희석과 다시 소용돌이.</li>
	<li>슬라이드에서 워시 버퍼에서 누르고 각 음 (40 µ L/잘)을 결 찰/리가 솔루션을 추가 합니다.</li>
	<li>37 ° c.에 30 분을 위한 미리가 열된 습도 챔버 슬라이드를 품 어</li>
</ol>8입니다. 증폭
참고: 증폭 재고 키트의 일부로 제공 됩니다 ( 재료의 표참조). 시 약은 빛에 민감한; 따라서 빛에 슬라이드를 노출 하지 마십시오.
<ol><li>소용돌이 필요한 볼륨 증폭 주식 고 순도 물에 1:5 x 5의 희석과 혼합.</li>
	<li>슬라이드에서 결 찰/리가 솔루션을 누릅니다. 워시 버퍼 두 번 실시간 각 2 분 x 1에 슬라이드를 씻어</li>
	<li>소용돌이 중 합 효소를 다시 1:80 희석 및 소용돌이에서 증폭 솔루션을 추가.</li>
	<li>슬라이드에서 워시 버퍼에서 누르고을 각 영역 (40 µ L/잘) 증폭/중 합 효소 솔루션을 추가 합니다. 37 ° c.에 100 분을 위한 미리가 열된 습도 챔버 슬라이드를 품 어</li>
</ol>9입니다. 영상에 대 한 준비
참고: 이들은 빛 민감한 시 약입니다. 슬라이드 빛 으로부터 보호 유지.
<ol><li>슬라이드에서 증폭-중 합 효소 솔루션을 누르고 실시간 워시 버퍼 x 각에 1 10 분 동안 두 번 씻어</li>
	<li>제거 약 실 및 우물 주위 실리콘 슬라이드에서 완전히. 면도기와 실리콘의 나머지 비트를 다쳤어요. 각각을 분리 하는 슬라이드에 표를 그려 잘.</li>
	<li>DAPI와 장착 매체의 ~ 40 µ L를 추가 합니다. 트래핑 커버 슬립에서 공기 방울을 피하기 위해 주의 해야 합니다. 커버 슬립의 가장자리는 매니큐어와 밀봉 될 수 있다.</li>
	<li>Confocal 현미경을 사용 하 여 이미지 분석을 수행 하기 전에 적어도 20 분을 기다립니다. 참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다.</li>
	<li>이미징, 후 어둠 속에서-20 ° C에 슬라이드를 저장 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nore1B%2FMst1+complex+restrains+antigen+receptor-induced+proliferation+of+na%C3%AFve+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).</li>
<li>Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOBKL1A%2FMOBKL1B+phosphorylation+by+MST1+and+MST2+inhibits+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation.</a> Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li>
<li>Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ste20+group+kinases+as+regulators+of+MAP+kinase+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades.</a> Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).</li>
<li>Rawat, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H-ras+Inhibits+the+Hippo+Pathway+by+Promoting+Mst1%2FMst2Heterodimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization.</a> Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).</li>
<li>Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ste20-like+protein+kinase%2C+Mst1%2C+dimerizes+and+contains+an+inhibitory+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).</li>
<li>Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Approaches+Toward+Quantitative+Mapping+of+the+Interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome.</a> Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).</li>
<li>Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li>
<li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li>
<li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

우리는 그것은 매우 편리 하 게 여러 (14-16) 셀 라인 실험을 수행 하 고 현미경 분석 하는 동안 모든 시간 샘플을 변경할 필요가 없습니다이 실험을 위해 유리 챔버 슬라이드를 사용 하 여 유용한 발견. 항 체와 교차 오염에 대 한 위험 증가 등, 몇 가지 합병증이 발생할 수 있습니다. 따라서, 우리는 것이 좋습니다 모든 잘 세척 실험의 증가 기간에도 불구 하 고 Coplin jar를 사용 하 여 대신 개별적으로. 또한, 실리콘 삽입의 제거는 섬세 한 일 이며 관심과 인 내 할 수 있어야 합니다. 도 세심 한 기술로, 그것은 때로는 제거 삽입 후 실리콘 파편의 작은 금액을 볼 수입니다. 이러한 이유로, 하나 제거 해야 합니다 실리콘 삽입 꼼꼼히, 필요한 경우 razorblade를 사용 하 여 너무 많은 unremoved 실리콘 동안 현미경 confocal 거리를 변경할 수 있습니다. 그것은 또한 현미경 셀을 찾을 수 있도록 실리콘 삽입을 제거한 후 우물의 국경으로 라인을 그릴 수 유용할 수 있습니다.
<p class=...

MST1/Hippo 신호 장애 발달 장애 및 발암1에 연결 되었습니다. 포유류에서 MST1 및 MST2 kinases 활성화 (phosphorylate) MOB1 및 LATS1/2, 후자는 phosphorylates 그리고 transcriptional 공동 활성 제 예 관련 단백질 (YAP)2생긴다. 활성 (unphosphorylated) 형태로 얍에 종양 활동, 세포 증식 유전자;의 녹음을 향상 반대로, 야프 뚱 땡 통로 의해 비활성화 됩니다, 세포 증식을 억제 하 고 apoptosis 승진3. 조직, MST1 및 MST2 활성 homodimers, 주로 존재 하지만 종양 자극 MST1/MST2 heterodimers의 수준을 높일 수 있으며 같은 heterodimers 비활성4. 그러나, MST1/MST2 heterodimerization 규제 어떻게 제대로 이해 남아 있다. 호모-및 heterodimers MST1의 C-터미널 코일 코일 지역 및 MST2 사라 도메인5로 알려진 사이의 상호 작용 중재 를 통해 있습니다. 사용 하는 제자리에서 PLA 시연이 문서에서 우리는 인간의 Schwann 세포 (HSC)와 인간 미 발달 신장 세포 (HEK 293)에 MST1/MST2 heterodimers의 존재를 표시. PLA 생 단백질-단백질 상호 작용, 식별 하 고 transgene 식의 필요 또는 피토 프 태그의 사용 없이 측정할 수 있는 감지를 허용 하기 때문에 다른 단백질/단백질 상호 작용 검출 방법에 비해 이점이 있다 6.
신호 변환 통로 크게 구성 단백질의 조건부 협회에 의해 제어 됩니다. 예를 들어 대부분 수용 체 티로신 kinases의 자극 양식 추가 단지 그들의 호모 이합체 또는 이종 화 및 후속 연관 추가 세포내 신호 전달 단백질를 스스로 리드. PLA 방법의 목적은 셀, 단백질 사이 근접 시각화 하 단백질 보다 30-40 nm 간격에 제공. 단백질 근접 일반적으로 첫 번째 종에 발생 하는 적절 한 기본 항 체와 세포 잠복기에 의해 검출 된다 (예., 토끼와 마우스) 각 상호 작용 단백질에 대 한 추가 종의 2 차 항 체, 전 짧은 결합 된 DNA 프로브합니다. DNA 프로브 가까운 위치에, 모두 제자리에서 PCR에 의해 또는 원 메커니즘을 압 연 하 여 확대를 위한 플랫폼을 형성 하는 이러한 프로브는 특정 연결 DNA oligonucleotide 동시에 바인딩할 수 있습니다. 증폭 반응에 추가 하는 형광 태그 허용 쉽게 계량 하 고 셀7,8, 에서 특정 영역에 지역화 된 수 있는 형광 점으로 표시 되는 상호 작용 단백질의 시각화 9 , 10.

<table><tbody><tr><td>챔버 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>178599</td><td>16웰, 유리 슬라이드</td></tr><tr><td>PLA 프로브 안티 마우스 마이너스</td><td>시그마-알드리치</td><td>DUO92004</td><td>1x 블로킹 용액 포함, 1x 항체 희석제</td></tr><tr><td>PLA 프로브 안티 래빗 플러스</td><td>시그마-알드리치</td><td>DUO92002</td><td>1x 블로킹 용액, 1x 항체 희석</td></tr><tr><td>세척 버퍼, 플루레시멘트</td><td>시그마-알드리치</td> <td>포함DUO82049</td>에는 <td>DAPI</td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td><td></td>검출 시약<td>이 포함된</td></tr> 세척 버퍼 A 및 세척 버퍼 B 장착 매체가 포함되어 있습니다. <tr><td>Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92008</td>에는 <td>5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase</td></tr><tr><td>p44/42 MAPK (Erk1/2) 항체</td><td>세포 신호</td><td>9102s</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)</td><td>셀이 포함되어 있습니다. 신호 :</td><td>5726s</td><td>pERK 항체</td></tr>, <tr><td>MST2 항체</td><td>세포 신호 :</td><td>3952s</td><td></td></tr><tr><td>Krs-2 (RJ-5)</td> <td>Santa Cruz</td><td>sc-100449</td><td>MST1 항체</td></tr><tr><td>: 16 % 파라 포름 알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>: 15710</td> 고정 용액 Triton x100 Fisher BioReagents BP 151-500<td>을 위해 PBS에서 4 % PFA로 희석</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>투과화 솔루션을 위해 1xPBS에서 0.1% Triton x-100을 준비하려면</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경 Leica</td><td>TCS SP8, 63x</td><td></td><td>ImageJ 소프트웨어를 사용한 이미지 분석</td></tr></tbody></table>

제자리에 근접 결 찰 분석 결과 사용 하 여 단백질 isoforms의 heterodimerization의 검출

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

레 귤 레이트 된 단백질-단백질 상호 작용은 많은 신호 이벤트, 지도 원리 이며 이러한 이벤트의 검출 같은 경로 구성 하는 방법을 그들이 작동 하는 방식 이해는 중요 한 요소. 셀, 단백질 단백질 상호 작용을 검출 하는 많은 방법이 있다 그러나 상대적으로 몇 가지를 사용할 수 있는 내 생 단백질 사이 상호 작용을 검출. 그러한 한 방법, 근접 결 찰 분석 결과 (PLA), 그것의 사용을 추천 하 몇 가지 장점이 있습니다. 단백질 단백질 상호 작용 분석의 다른 일반적인 방법에 비해, PLA는 상대적으로 높은 감도 특이성, 최소 셀 조작, 그리고, 여기에 설명 된 프로토콜에서 수행할 수 있습니다, 그리고 특정 대상만 두 필요 다른 종에서 파생 된 항 체 (예., 마우스와 토끼에서)와 1 개의 특수 시 약: covalently 특정 연결 된 oligonucleotides는 이차 항 체의 집합, 서로 가까이에 때, 만들는 제자리에서 PCR 또는 압 연 원형 증폭에 대 한 amplifiable 플랫폼. 이 프레 젠 테이이 션에서 우리 고정된 셀에 MST1 및 MST2에에서 변화를 시각화 하기 위해 PLA 기법을 적용 하는 방법을 보여 줍니다. 이 원고에 설명 된 기술은 세포 신호 전달 연구의 분석에 특히 적용 됩니다.

우리는 HEK 293와 iHSC MST1와 MST2 사이 상호 작용을 테스트 하려면 PLA 분석 결과 사용. 셀 고정 했다, permeabilized, 및 다양 한 항 체, PLA 프로토콜 (그림 1)에 따라 현장에서 증폭 다음으로 물. MST1/MST2 heterodimerization의 수준을 문서화 하 셀 MST1와 MST2 항 체 (그림 1A, 1 C 및 1 G)으로 얼룩이 있었다. 긍정적인 통제로 우리 ERK 및 특권 항 체와 세포에 근접에 있을 것으로 예상 된다 (그림 1B 및 1 층) ERK 활성화. MST1와 MST2 셀 표시 PLA 신호 (그림 1C). 셀 두 항 체의...

여기, 우리가 근접 결 찰 분석 결과 (PLA)를 사용 하 여 높은 감도와 고정된 셀에 MST1/MST2 heterodimerization를 시각화 하는 방법을 보여 줍니다.

제자리에 근접 결 찰 분석 결과 사용 하 여 단백질 Isoforms의 Heterodimerization의 검출

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

시상 근접 리깅 분석 또는 PLA에서 단백질, 부착 된 조직 및 세포 간의 상호 작용을 감지 할 수있는 기술입니다. 단백질 간의 연관성은 형질전환 발현 또는 추가 기술 없이 식별되고 정량화될 수 있다. 유일한 요구 사항은 DNA 올리고뉴클레오티드로 변형될 수 있는 특정 고효율 항체의 가용성입니다.조직에서 MST1 및 MST2는 주로 활성 호모이머로 존재하지만, 온코겐 자극은 MST1 MST2 이종기의 수준을 증가시킬 수 있으며 이러한 이종성중무는 비활성이다. 관심있는 단백질에 대한 특정 프라이머 항체를 사용하여 배양한 다음, 특수 특이적 특이적 이차 항체는 각각 고유하고 짧고 무료 DNA 가닥에 연결되어 1 차 항체에 결합하기 위해 슬롯에 첨가됩니다. 문제의 단백질이 이성구화되면 1차 항체와 이차 항체가 모두 가까이 에 있을 것입니다.이 상태에서, 제2 항체에 부착된 DNA 가닥은 2개의 다른 원 형성 DNA 올리고뉴클레오티드의 후속 첨가를 통해 상호작용할 수 있다. DNA 원의 수백 배 의 복제는 증폭 반응 후에 발생할 수 있고 형광 신호는 평준화 된 무료 올리고뉴클레오티드 프로브에 의해 생성된다. 따라서, 검출된 각 신호는 현미경 심상을 기반으로 특정 세포외 위치에 할당될 수 있는 개별 형광점으로 시각화된다.실험 전날, 마우스 라미닌 또는 폴리 L-리신50~100마이크로리터를 추가하여 16개의 잘 챔버슬라이드를 코팅하고 섭씨 37도에서 배양합니다. 30분 후에 차가운 용액을 제거한 후 트립신과 플레이트 15, 000 ~ 25, 000 세포를 잘 하여 16개의 잘 챔버슬라이드로 분할합니다. 가습된 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.24 시간 후, 우물에서 배지를 제거하고 부드럽게 PBS로 세포를 씻어. 마이크로파이프를 사용하여 샘플의 위험 복용을 최소화한 다음 PBS를 흡습하고 웰당 4%PFA의 50마이크로리터를 추가하고 교반 없이 실온에서 10분 동안 배양하여 세포를 수정합니다. 세포의 분리가 발생할 수 있기 때문에 용액을 셀에 직접 피펫하지 마십시오.고정 후, 가벼운 동요와 함께 각각 5 분 동안 TBST로 세포를 세 번 씻으라. 다음으로 세포를 투약화하고 동요없이 실온에서 10 분 동안 배양합니다. 투과가 완료되면 TBST로 셀을 3회 세척하여 교반하여 세척할 수 있습니다.TBST를 제거한 후 각 우물에 블로킹 용액 한 방울을 추가하고 예열된 습도 챔버에서 슬라이드를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 1 차적인 항체를 희석하십시오. 마이크로 피펫을 사용하여 차단 용액을 제거하지만 슬라이드가 건조되는 것을 허용하지 않습니다.소용돌이와 적절한 우물에 희석 된 항체 용액의 40 마이크로 리터를 추가하고 1 시간 동안 예열 된 습도 챔버에서 섭씨 37도에서 샘플을 배양하십시오. 인큐베이션 동안, 항체 희석제에서 두 개의 PLA 프로브를 희석시. 각 샘플에 대해 PLA 프로브의 40 마이크로리터를 준비합니다.1시간 동안 인큐베이션을 한 후, 항체 용액을 흡습하고 실온에서 TBST로 5분 동안 슬라이드를 두 번 세척합니다. 슬라이드에서 TBST를 부드럽게 제거하고 PLA 프로브 용액의 40 마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 예열된 습도 챔버에서 슬라이드를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.소용돌이및 사용 직전에 고순도물에 1~5의 결찰 육수의 필요한 부피를 희석한다. 각 웰에 대해 40개의 리차레이션 솔루션이 필요합니다. 인큐베이션 후 슬라이드에서 PLA 용액을 제거하고 동요와 실온에서 5 분 동안 TBST에서 두 번 세척하십시오.냉동고에서 리구아제를 제거하고 세포, 소용돌이에 추가하기 직전에 동결 블록을 사용하고 결찰 용액으로 희석하십시오. 슬라이드에서 TBST를 제거하고 각 웰에 40 마이크로리터의 리그레이션 리갈아제 용액을 추가합니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 예열된 습도 챔버에서 인큐베이션 슬라이드가 있습니다.인큐베이션 후 용액을 흡인시키고 동요와 함께 실온에서 5 분 동안 TBST로 두 번 세척하십시오. 시약이 빛에 민감하기 때문에 밝은 빛에 우물을 노출하지 마십시오. 마지막 세척 하는 동안, 소용돌이 및 사용 직전에 고순도 물에 증폭 용액의 요구 볼륨을 희석.폴리머라제를 얼음이나 냉각 블록에 보관하고 세포 소용돌이에 첨가하기 직전에 증폭 용액으로 희석하십시오. 우물에서 TBST를 흡인하고 각 우물에 40 마이크로 리터의 증폭 솔루션을 추가합니다. 인큐베이터는 어두운 예열 된 습도 챔버에서 섭씨 37도에서 100 분 동안 슬라이드합니다.인큐베이션 후, 슬라이드에서 증폭 폴리머라제 용액을 흡습하고 실온에서 TBST에서 각각 2회 10분 세척한다. 슬라이드에서 우물 주위의 챔버와 실리콘을 완전히 제거합니다. 면도기와 실리콘의 나머지 구슬을 긁어.각 우물을 분리하는 슬라이드에 그리드를 그립니다. DAPI를 장착한 배지의 약 40마이크로리터를 추가하여 커버 슬립 아래에 기포가 걸리지 않도록 합니다. 매니큐어를 사용하여 커버 글래스를 수정합니다.현미경 분석은 고정 후 20 분 안에 수행 될 수 있지만 실제로는 다음 날 이미지 분석을 수행하는 것이 가장 편리하다는 것을 알게됩니다. 샘플을 분석하기 위해 라이카 SP8 구성 레이저 스캐닝 현미경을 사용합니다. 여기에 도시된 시투 근접 결찰 분석에서 패널 A에서 인간 배아 신장 세포에서 MST 1과 MST2 단백질 사이의 근접성을 시각화하는 예가 있으며, 패널 H.In E의 인간 슈완 세포는 모든 패널 세포 핵이 DAPI와 적색점에 의해 파란색으로 염색되어 표시된 단백질 간의 근접성에서 발생하는 긍정적인 근접 성결 분석 신호를 나타낸다.패널 A는 MST1 과 MST2및 패널 B의 근접성을 나타내며 이러한 에피토프가 동일한 단백질에 있기 때문에 ERK와 인의 근접성을 나타낸다. 패널 C는 MST1 및 MST2 및 패널 D와 같은 이러한 세포가 서로 근접할 것으로 예상되지 않는 MST1 및 ERK에 대한 항체로 염색된 두 번째 음수 대조군을 나타내기 때문에 음의 대조군을 나타낸다. 패널 E와 F는 슈완 세포에서 인을 가진 MST2 및 ERK를 가진 MST1의 근접성을 보여줍니다.패널 G와 H는 MST1 항체 또는 MST1 및 ERK 항체로만 염색된 음의 대조군이다. 이종수의 단 한 부재만 인식해야 하는 비 반응성 1차 항체를 사용하는 것이 필수적이다. 또한 1 차적인 항체 및 PLA 프로브의 교차 오염을 피하기 위하여, 우물의 바닥을 만지지 않도록, 그리고 견본에 직접 피하 되기 위하여 다른 팁을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 비디오를 시청 한 후 고정 된 세포에서 단백질 이산화를 연구하기 위해 시투 PLA에서 사용하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

여기 우리는 뼈 Morphogenetic의 단백질 (BMP) 고정 세포에 신호를 시각화하는 항체의 조합과 근접 내고 분석 (괞찮아)를 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 우리가 BMP4 자극을 아래에 효과기 - 단지를 활성화 내생 BMP의 핵 축적에 따라 자신의 수준 시간이 지남에를 정할 수있었습니다.

효과기 - 단지에게 사용 BMP4의 다운 스트림 신호의 감지 현장에서 괞찮아, 근접 내고 분석

이 동영상은 선충 세포에서 현장 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 근접 결찰 분석에 대해 설명합니다. 관심 단백질의 근접성은 2차 항체에 부착된 PLA 프로브의 도움으로 원형 DNA 템플릿을 생성합니다. 프로브는 긴 단일 가닥 DNA를 생성한 후 검출기 프로브의 혼성화를 생성하는 증폭 용액을 사용하여 추가로 증폭되어 세포 내 단백질-단백질 상호 작용의 국소화를 가능하게 합니다.

In Situ 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 근접 결찰 분석(Proximity Ligation Assay)

이 프로토콜은 근접 내고 분석은 초파리 애벌레 신경 근육 접합부에서 현장 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출 할 수있는 방법을 보여줍니다. 이 기술, 디스크 크고 후진타오 - 리 타이 샤오는 시냅스 지역에서 복잡한, 이전에 공동 면역 통해 식별 관계를 형성하기 위해 표시됩니다.

검출 현장에서 단백질 - 단백질 복합체 초파리 애벌레 신경 근육 접합부

여기, 우리는 고정 된 세포에서 소포체와 미토콘드리아의 내생 적 상호 작용을 시각화하고 고감도로 정량화 할 수있는 절차를 설명합니다. 프로토콜은이 미토콘드리아 관련 막 계면에서 이노시톨에게 1,4,5- 트리 포스페이트 수용체 / 혈당 조절 단백질 75 / 전압 가변 음이온 채널 / 시클로 필린의 D 복합체 타겟팅 시츄 근접 결찰 분석법 최적화 기능.

소포체와 미토콘드리아의 상호 작용의 연구에 의해<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석 고정 세포의

단백질-단백질 상호 작용은 세포의 핵과 세포질 모두에서 발생할 수 있습니다. 이러한 상호 작용을 조사하기 위해 기존의 동시 면역침전과 현대의 근접 결찰 분석법이 적용됩니다. 이 연구에서는 이 두 가지 방법을 비교하여 핵과 세포질에서 NF90-RBM3 상호 작용의 분포를 시각화합니다.

공동 면역 침전에 의한 핵 및 세포질 분수에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 시각화 및<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석

여기에서는 유전 독성 스트레스에 노출 된 현탁 세포 배양 물에서 ATM과 p53 사이의 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하고 시각화하기 위해 현장에서의 근접 연결 분석 (PLA)이 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다.

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

여기 선물이 조립과 해체 biolayer 간섭계 (씨)를 사용 하 여 탄 저 균 독 소의 모니터링 하는 프로토콜. 조립/분해 바이오 센서 표면에, 다음 큰 단백질 복합물 시각화 및 각각 전자 현미경 검사 법 및 질량 분석를 사용 하 여 단지의 구성 요소 식별에 대 한 표면에서 해제 됩니다.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

이 프로토콜 단백질 호모-oligomerization에서 체 외에 상업 조명 현미경 검사를 사용 하 여 형광 변동 분광학에 따라 측정을 위한 보정 없는 접근을 설명 합니다. 올바른 인수 설정 및 분석 방법을 표시 됩니다.

생체 외에서 교정 무료 단백질 호모-oligomerization 상업 계측 및 무료, 오픈 소스 밝기 분석 소프트웨어를 사용 하 여의 정량화

Cognate J-도메인 단백질은 Hsp70 샤페론과 협력하여 단백질 폴딩에서 분해에 이르는 수많은 생물학적 과정을 지원합니다. 여기서, 우리는 세균, 효모 및 인간 세포에서 이러한 과도하게 형성된 샤페론 기계의 모니터링을 허용하는 내부 근접 결찰 분석에 대해 설명합니다.

박테리아, 효모 및 인간 세포에서 일시적으로 형성된 분자 샤페론 어셈블리의 시투 모니터링

이 프로토콜은 C. elegans 생식선에서 의한 체르메게에서 단백질-단백질 상호작용을 조사하기 위한 근접 결찰 분석법의 사용을 입증한다.

근접 결찰 분석술을 사용하여 C. 예쁜꼬마선에서 리보뉴클레오 단백질 복합어셈블리의 시투 검출

D-루프 포획(DLC) 및 D-루프 확장(DLE) 분석은 정량적 PCR과 함께 근접 결찰 원리를 활용하여 사카로마이세스 세레비시아에서 유도성 이중 가닥 절단 부위에서 D-루프 형성, D-루프 확장 및 생성물 형성을 정량화합니다.

사카로마이세스 세레비시아에서 근접 결찰 및 정량적 PCR을 통한 상동 재조합 중간체의 검출

학습하세요 고정 세포에서 근접 결찰 분석(PLA)을 사용하여 MST1/MST2 단백질 이형이량체를 시각화하는 방법을 배우세요. 이 기술은 높은 감도로 단백질 상호작용을 검출하여 세포 신호전달 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

제자리에 근접 결 찰 분석 결과 사용 하 여 단백질 Isoforms의 Heterodimerization의 검출

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