제자리에 근접 결 찰 분석 결과 사용 하 여 단백질 Isoforms의 Heterodimerization의 검출
2018년 10월 20일
여기, 우리가 근접 결 찰 분석 결과 (PLA)를 사용 하 여 높은 감도와 고정된 셀에 MST1/MST2 heterodimerization를 시각화 하는 방법을 보여 줍니다.
시상 근접 리깅 분석 또는 PLA에서 단백질, 부착 된 조직 및 세포 간의 상호 작용을 감지 할 수있는 기술입니다. 단백질 간의 연관성은 형질전환 발현 또는 추가 기술 없이 식별되고 정량화될 수 있다. 유일한 요구 사항은 DNA 올리고뉴클레오티드로 변형될 수 있는 특정 고효율 항체의 가용성입니다.
조직에서 MST1 및 MST2는 주로 활성 호모이머로 존재하지만, 온코겐 자극은 MST1 MST2 이종기의 수준을 증가시킬 수 있으며 이러한 이종성중무는 비활성이다. 관심있는 단백질에 대한 특정 프라이머 항체를 사용하여 배양한 다음, 특수 특이적 특이적 이차 항체는 각각 고유하고 짧고 무료 DNA 가닥에 연결되어 1 차 항체에 결합하기 위해 슬롯에 첨가됩니다. 문제의 단백질이 이성구화되면 1차 항체와 이차 항체가 모두 가까이 에 있을 것입니다.
이 상태에서, 제2 항체에 부착된 DNA 가닥은 2개의 다른 원 형성 DNA 올리고뉴클레오티드의 후속 첨가를 통해 상호작용할 수 있다. DNA 원의 수백 배 의 복제는 증폭 반응 후에 발생할 수 있고 형광 신호는 평준화 된 무료 올리고뉴클레오티드 프로브에 의해 생성된다. 따라서, 검출된 각 신호는 현미경 심상을 기반으로 특정 세포외 위치에 할당될 수 있는 개별 형광점으로 시각화된다.
실험 전날, 마우스 라미닌 또는 폴리 L-리신50~100마이크로리터를 추가하여 16개의 잘 챔버슬라이드를 코팅하고 섭씨 37도에서 배양합니다. 30분 후에 차가운 용액을 제거한 후 트립신과 플레이트 15, 000 ~ 25, 000 세포를 잘 하여 16개의 잘 챔버슬라이드로 분할합니다. 가습된 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.
24 시간 후, 우물에서 배지를 제거하고 부드럽게 PBS로 세포를 씻어. 마이크로파이프를 사용하여 샘플의 위험 복용을 최소화한 다음 PBS를 흡습하고 웰당 4%PFA의 50마이크로리터를 추가하고 교반 없이 실온에서 10분 동안 배양하여 세포를 수정합니다. 세포의 분리가 발생할 수 있기 때문에 용액을 셀에 직접 피펫하지 마십시오.
고정 후, 가벼운 동요와 함께 각각 5 분 동안 TBST로 세포를 세 번 씻으라. 다음으로 세포를 투약화하고 동요없이 실온에서 10 분 동안 배양합니다. 투과가 완료되면 TBST로 셀을 3회 세척하여 교반하여 세척할 수 있습니다.
TBST를 제거한 후 각 우물에 블로킹 용액 한 방울을 추가하고 예열된 습도 챔버에서 슬라이드를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 1 차적인 항체를 희석하십시오. 마이크로 피펫을 사용하여 차단 용액을 제거하지만 슬라이드가 건조되는 것을 허용하지 않습니다.
소용돌이와 적절한 우물에 희석 된 항체 용액의 40 마이크로 리터를 추가하고 1 시간 동안 예열 된 습도 챔버에서 섭씨 37도에서 샘플을 배양하십시오. 인큐베이션 동안, 항체 희석제에서 두 개의 PLA 프로브를 희석시. 각 샘플에 대해 PLA 프로브의 40 마이크로리터를 준비합니다.
1시간 동안 인큐베이션을 한 후, 항체 용액을 흡습하고 실온에서 TBST로 5분 동안 슬라이드를 두 번 세척합니다. 슬라이드에서 TBST를 부드럽게 제거하고 PLA 프로브 용액의 40 마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 예열된 습도 챔버에서 슬라이드를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.
소용돌이및 사용 직전에 고순도물에 1~5의 결찰 육수의 필요한 부피를 희석한다. 각 웰에 대해 40개의 리차레이션 솔루션이 필요합니다. 인큐베이션 후 슬라이드에서 PLA 용액을 제거하고 동요와 실온에서 5 분 동안 TBST에서 두 번 세척하십시오.
냉동고에서 리구아제를 제거하고 세포, 소용돌이에 추가하기 직전에 동결 블록을 사용하고 결찰 용액으로 희석하십시오. 슬라이드에서 TBST를 제거하고 각 웰에 40 마이크로리터의 리그레이션 리갈아제 용액을 추가합니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 예열된 습도 챔버에서 인큐베이션 슬라이드가 있습니다.
인큐베이션 후 용액을 흡인시키고 동요와 함께 실온에서 5 분 동안 TBST로 두 번 세척하십시오. 시약이 빛에 민감하기 때문에 밝은 빛에 우물을 노출하지 마십시오. 마지막 세척 하는 동안, 소용돌이 및 사용 직전에 고순도 물에 증폭 용액의 요구 볼륨을 희석.
폴리머라제를 얼음이나 냉각 블록에 보관하고 세포 소용돌이에 첨가하기 직전에 증폭 용액으로 희석하십시오. 우물에서 TBST를 흡인하고 각 우물에 40 마이크로 리터의 증폭 솔루션을 추가합니다. 인큐베이터는 어두운 예열 된 습도 챔버에서 섭씨 37도에서 100 분 동안 슬라이드합니다.
인큐베이션 후, 슬라이드에서 증폭 폴리머라제 용액을 흡습하고 실온에서 TBST에서 각각 2회 10분 세척한다. 슬라이드에서 우물 주위의 챔버와 실리콘을 완전히 제거합니다. 면도기와 실리콘의 나머지 구슬을 긁어.
각 우물을 분리하는 슬라이드에 그리드를 그립니다. DAPI를 장착한 배지의 약 40마이크로리터를 추가하여 커버 슬립 아래에 기포가 걸리지 않도록 합니다. 매니큐어를 사용하여 커버 글래스를 수정합니다.
현미경 분석은 고정 후 20 분 안에 수행 될 수 있지만 실제로는 다음 날 이미지 분석을 수행하는 것이 가장 편리하다는 것을 알게됩니다. 샘플을 분석하기 위해 라이카 SP8 구성 레이저 스캐닝 현미경을 사용합니다. 여기에 도시된 시투 근접 결찰 분석에서 패널 A에서 인간 배아 신장 세포에서 MST 1과 MST2 단백질 사이의 근접성을 시각화하는 예가 있으며, 패널 H.In E의 인간 슈완 세포는 모든 패널 세포 핵이 DAPI와 적색점에 의해 파란색으로 염색되어 표시된 단백질 간의 근접성에서 발생하는 긍정적인 근접 성결 분석 신호를 나타낸다.
패널 A는 MST1 과 MST2및 패널 B의 근접성을 나타내며 이러한 에피토프가 동일한 단백질에 있기 때문에 ERK와 인의 근접성을 나타낸다. 패널 C는 MST1 및 MST2 및 패널 D와 같은 이러한 세포가 서로 근접할 것으로 예상되지 않는 MST1 및 ERK에 대한 항체로 염색된 두 번째 음수 대조군을 나타내기 때문에 음의 대조군을 나타낸다. 패널 E와 F는 슈완 세포에서 인을 가진 MST2 및 ERK를 가진 MST1의 근접성을 보여줍니다.
패널 G와 H는 MST1 항체 또는 MST1 및 ERK 항체로만 염색된 음의 대조군이다. 이종수의 단 한 부재만 인식해야 하는 비 반응성 1차 항체를 사용하는 것이 필수적이다. 또한 1 차적인 항체 및 PLA 프로브의 교차 오염을 피하기 위하여, 우물의 바닥을 만지지 않도록, 그리고 견본에 직접 피하 되기 위하여 다른 팁을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
이 비디오를 시청 한 후 고정 된 세포에서 단백질 이산화를 연구하기 위해 시투 PLA에서 사용하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야합니다.
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개요
본 논문은 고정된 세포 내 MST1/MST2 이종이량체화를 높은 민감도로 시각화하기 위한 근접 결찰 분석법(Proximity Ligation Assay, PLA)의 활용 방법을 보여줍니다. PLA 기술은 단백질 상호작용을 in situ에서 검출할 수 있게 하여, 단백질 복합체의 역동성에 대한 통찰을 제공합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 단백질 상호작용
배경
- 근접 결찰 분석(PLA)은 단백질 상호작용을 검출하는 강력한 방법입니다.
- MST1과 MST2는 주로 호모다이머로 존재하지만, 특정 조건에서는 헤테로다이머를 형성할 수 있습니다.
- 헤테로다이머 형성은 단백질 활성과 세포 신호 전달에 영향을 미칠 수 있습니다.
- PLA 기술에는 고효율 항체가 필수적입니다.
연구 목적
- 고정된 세포 내에서 MST1/MST2 이형이량체 형성을 시각화하기 위함입니다.
- 단백질 상호작용 검출에 있어 PLA 방법의 민감도를 입증하기 위함입니다.
- 세포 내 환경에서 MST1/MST2 이형이량체 형성의 영향을 탐색하기 위함입니다.
사용된 방법
- In situ 근접 결찰 분석(PLA)
- MST1 및 MST2에 대한 특이적 1차 항체의 사용
- DNA 가닥이 결합된 2차 항체의 적용
- 근접성에 기반한 단백질 상호작용의 정량화
주요 결과
- 고정된 세포 내 MST1/MST2 헤테로다이머의 성공적인 시각화.
- 단백질 상호작용 검출에 있어 PLA의 높은 민감도 입증.
- 헤테로다이머화를 촉진하는 조건 확인.
- MST1/MST2 상호작용의 기능적 함의에 대한 통찰.
결론
- PLA는 고정된 세포 내의 단백질 상호작용을 연구하는 데 효과적인 도구입니다.
- MST1/MST2 이종이량체화는 세포 신호 전달에서 중요한 역할을 할 수 있습니다.
- 이 방법은 다양한 생물학적 맥락에서 다른 단백질 상호작용 연구에 적용될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
근접 결찰 분석(Proximity Ligation Assay, PLA)은 고정된 세포 내 내인성 단백질의 이종 이량체화를 민감하게 검출할 수 있어, 초기 탐색 단계의 타겟 검증을 지원합니다. PLA는 외래 유전자 발현 없이 MST1/MST2 상호작용을 시각화함으로써, 신호 전달 연구에서 경로의 위험 요소를 제거하고 예측 신뢰도를 높이는 기전적 통찰을 제공합니다. 이러한 기능은 치료 가설의 우선순위를 설정하고 전임상 의사 결정 과정에서의 생물학적 모호성을 줄이는 데 도움이 됩니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 활용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 생리학적으로 유의미한 환경에서 내인성 MST1/MST2 헤테로이량체 형성을 검출하여 치료 가설을 검증합니다.
- 운용적 가치: 종 특이적 1차 항체를 사용하여 높은 민감도와 특이도로 기능적 표적 검증을 가능하게 합니다.
- 예측적 가치: 발암성 자극 하에서 비활성 헤테로이량체 형성을 시각화함으로써 기전적 리스크 감소를 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 단백질 상호작용 상태를 확인함으로써 하위 스크리닝을 위한 검증된 생물학적 시스템을 준비합니다.
- 정량적 출력: 근접성에 비례하여 증폭 가능한 형광 신호를 생성하여 표준화된 검출을 가능하게 합니다.
- 플랫폼 재사용성: 서로 다른 종의 표적 특이적 항체 두 종류와 올리고뉴클레오타이드가 결합된 2차 항체만 필요하므로 분석의 확장성을 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 질병 관련성: MST1/MST2 이형이량체화를 발암성 신호 전달과 연결하여, 경로 분석을 위한 질병 관련 시스템을 제공합니다.
- 중개 연구의 연속성: 세포 내 국소화에 대한 통찰력을 통해 발견 단계의 상호작용 데이터를 전임상 검증으로 연결합니다.
- 리스크 조정 결정: 단백질 복합체 활성을 조절하는 조건을 식별함으로써 진전 기준에 대한 정보를 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
PLA는 go/no-go 결정을 지원하는 이진법적이고 공간적으로 분해된 상호작용 데이터를 제공함으로써, 타겟 결합부터 리드 화합물 도출에 이르는 발견 연속체 내에서 적절히 적용될 수 있습니다.
- 발견 생물학: 천연 세포 환경 내에서 단백질 이량체화 상태 및 경로 구성에 관한 가설을 검증합니다.
- 스크리닝: 단백질 상호작용에 대한 화합물 효과 평가가 가능한 재현 가능하고 정량적인 근접 측정 결과를 제공합니다.
- 분석: 실험 조건 비교를 위한 정량적 판독값으로 세포당 형광 점 수를 산출합니다.
- 중개 연구: 질환 모델에서 상호작용 변화를 기능적 결과와 연결함으로써 바이오마커 전략과 부합합니다.
- 기업적 재사용: 적절한 항체 쌍이 주어진다면 어떤 단백질 상호작용이든 연구할 수 있는 재사용 가능한 역량을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 세포 교란을 최소화하면서 내인성 단백질 상호작용을 검출하여 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 표준화된 고정, 프로빙 및 증폭 단계를 통해 재현성을 보장합니다.
- 전략적 가치: 질병 관련 시스템에서 표적 조절의 직접적인 증거를 제공하여 go/no-go 결정 능력을 향상시킵니다.
- 포트폴리오 영향: 상호작용 역학과 경로 컨텍스트를 기반으로 표적의 위험 조정 우선순위 결정을 가능하게 합니다.
구현 시 고려사항
- 교차 오염을 방지하기 위해 면역형광법 및 프로브 취급에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 고효율의 종 특이적 1차 항체 및 PLA 프로브 키트의 확보 여부에 따라 달라집니다.
- 신호의 무결성을 유지하기 위해 표준화된 세척 및 배양 프로토콜이 필수적입니다.
- 접근성을 보장하기 위해 서로 다른 세포 유형 및 고정 조건에 맞게 조정되어야 합니다.
- 항체 가용성과 조밀한 단백질 복합체 내의 잠재적인 입체 장애로 인해 제한될 수 있습니다.
