Name: 자동 형광 수명 이미징 현미경을 활용하여 오픈 소스 높은 콘텐츠 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 배우세요 자동 형광 수명 이미징 현미경(FLIM)을 활용한 고콘텐츠 분석 방법으로 단백질 상호작용을 정량적으로 측정하는 기술입니다. 고정 및 생세포 모두에 적용 가능하며 오픈소스 소프트웨어로 데이터 획득과 분석을 수행합니다.

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저자는 영국 생명공학 및 생명과학연구위원회(BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 및 BB/M006786/1), 영국 기술전략위원회(Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd와 공동) 및 Wellcome Trust(WT 095931/Z/11/Z)의 자금 지원에 감사를 표합니다. FG는 영국 공학 및 물리 과학 연구 위원회(EPSRC)의 박사 과정 학생을 인정합니다. DA, DK 및 SW는 EPSRC가 자금을 지원하는 Institute of Chemical Biology 박사 교육 센터의 박사 과정 학생을 인정합니다.

멀티 웰 플레이트 배열 1. 준비 <ol><li> 기준 측정 t 0의 결정을 사용하는 에탄올 75 μm의 쿠마린 6 (τ ~ 2.43 NS)의 용액을 준비합니다. </li><li> 종자 15 만 왜냐하면의 6 웰 플레이트의 네 우물에 세포 배양 배지에서 하룻밤 첨부 할 수 있습니다 (자료 목록 참조). </li><li> mTq5A, mTq5V, mTq17V 및 mTq32V 24 시간 동안 제조업체의 지침과 문화에 따라 상업 형질 전환 시약을 사용하여 잘 하나 하나를 형질. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 트립신 / EDTA 용액을 이용하여 세포를 분리. </li><li> 이전에 폴리 -L- 라이신 처리 된 # 1.5 두께의 유리 바닥 (96) 멀티 웰 플레이트의 각 웰 A1-G3에 mTq5A을 표현 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)에 현탁 피펫 5,000 왜냐하면 세포. mTq5V이 우물의 A4-G6에 세포를 표현하기위한 반복, 우물 A10-G12에 웰 A5-G9과 mTq32V에 mTq17V. </li&gt; <li> 빈 H1합니다 (멀티 웰 플레이트에서 모든 정적 배경의 측정을 제공하기 위해) 잘 둡니다. </li><li> HBSS 피펫 200 μL 만 아니라 H2로 (세포 배양 배지에서 모든 백그라운드 신호 측정을 제공하기 위해). </li><li> 피펫은 HBSS 5,000 비 형질 전환 세포가 잘 H3로 (휴대폰 형광도에서 어떤 배경 신호의 측정을 제공한다). </li><li> 잘 H4에 75 μM 쿠마린 염료 용액의 피펫 200 μL은 (때문에 주위 온도의 변화 또는 레이저 또는 타이밍 회로의 변동에, 예를 들어 멀티 웰 플레이트 수집, 동안 t 0의 변화에 수표를 제공합니다. </li></ol> 2. openFLIM-HCA 데이터 수집 참고 : 자세한 정보는 openFLIM-HCA 위키 (33)에서 볼 수 있습니다. <ol><li> 시작 μManager과 OpenFLIM-HCA 플러그인 </li><li> 딜레이 생성기 유닛의 특정 조합에 대한 교정 파일을 선택하고&quot;지연 상자 교정 파일 : 교정 파일 FLIM 제어&quot;에서 레이저의 반복률. </li><li> &quot;설정 자료 폴더 파일&quot;데이터가 아래에 저장 될 폴더를 설정합니다. </li><li> 전달 광파이버 그 결합을 확인하기 위해 여기 빔의 경로를 확인하면 안정적이고 커플 링 효율이 파워 미터를 이용하여 전송 광섬유를 통해 전송 된 전력을 측정함으로써 최대화된다. 5 %보다 낮은 변동이 허용됩니다. </li><li> 트리거 GOI이 GOI 입력 트리거 신호에 의해 트리거 오실로스코프에 GOI에서 모니터 출력 신호를 표시하여 안정되어 있는지 확인합니다. </li><li> 750 V로 게인을 설정하고 릴레이 렌즈 중 하나를 중심으로하도록 GOI의 광 음극을 포함하여 CCD 센서 상에 GOI 형광체의 영상을 확인 GOI 커버 불구하고 누출에 의한 배경 광에 드문 드문 단일 광자 이벤트 이미지 ( )이 CCD에 기록 가능한 한 날카로운. </li><li> 샘플 있는지 확인시야 균일 이러한 커버 슬립의 참조 염료 용액 방울로 균일 한 형광 샘플을 촬상 GOI 포화되지 않도록 충분히 낮은 여기 전력 (&lt;1 μW)을 사용하여 조명된다. </li><li> 해당 판 정의 파일을 선택, 즉, 96 웰 플레이트 옵션을 선택 ( &quot;파일 :로드 플레이트 속성&quot;). </li><li> μManager GUI를 사용하여, 빈 위치를 선택하여 현미경 프레임에는 다이크로 익 빔 스플리터 큐브가 없다는 것을 보장한다. </li><li> 수동으로 전체 실험에 ​​대한 GOI에서 4 NS의 게이트 폭을 선택합니다. </li><li> IRF 화상 데이터를 취득 : <ol><li> μManager GUI를 사용하여, 빈 위치를 선택하여 상기 빔 경로에 현미경 대물이 없어야합니다. 수동으로 다시 현미경 프레임에 임의의 반사를 최소화하는 레이저 광 탈출 각도 않도록 대물 터릿 위에 흑색 알루마이트 빔 블록을 배치했다. </li> &lt;리&gt;는 μManager GUI를 사용하여, 회전 Nipkow 디스크로부터 산란 된 여기 광의 일부는 촬상하지만 강도가 200 시스템을 포화 불충분 보장 될 수 있도록 CSUX (여진 이색, 배기 가스)의 필터를 설정 MS CCD 통합 시간. 이 광 음극에 손상을 줄 수 있습니다 너무 많은 빛에 GOI 광 음극 노출되지 않도록하는 것입니다. </li><li> 프로그램 가능한 빠른 지연 상자에 포함 지연의 전체 범위 찾기 maxpoint 기능을 사용하십시오. 표시되는 출력도를 확인하고 전체 IRF 프로파일이 빠른 지연 상자의 스캔 범위 내에 있도록 앞으로 버튼을 눌러 수동 코스 지연 상자를 조정합니다. </li><li> 인수 매개 변수 (중립 밀도, 노출 시간, 프레임 축적) 때문에 CCD는 밝은 시간 문에 포화되지 않고, 효과적인 통합 시간이&gt; 200 밀리를 조정합니다. </li><li> 전체 지연 이상 25 P의 설정 지연 단계를 울렸다전자 ( &quot;FLIM 제어 : 빠른 지연 상자 : 지연을 채 웁니다&quot;). </li><li> &quot;스냅 FLIM 이미지&quot;를 눌러 IRF 이미지를 획득. </li><li> 레이저 차단하여 배경 이미지를 획득 ( &quot;빛 경로 제어를 중립 밀도 : 차단&quot;), 지연의 수 ( &quot;FLIM 제어 : 빠른 지연 상자 : 현재 지연 설정 (PS)을&quot;) 감소, 변경되지 않은 다른 모든 속성을 떠나 를 눌러 &quot;스냅 FLIM 이미지&quot;. </li></ol></li><li> 기준 염료 데이터를 획득 : <ol><li> 잘 μManager GUI를 사용하여 H4 선택 ( &quot;XYZ 제어 : 잘 이동 : H4&quot;참조). </li><li> mTqFP 이미징을위한 μManager GUI를 선택 필터 (여진 17분의 434 nm의, 다이크로 익, 배출 25분의 482의 나노 미터)를 사용. </li><li> 빠른 지연 상자의 전체 범위 찾기 maxpoint 기능을 사용하여 전체 붕괴 프로파일이 빠른 지연 상자의 지연 범위 내에 있도록 다음 코스 지연 상자를 조정합니다. </li><li> 지연을 설정&quot;빠른 지연 상자 : 현재 지연 설정 (PS) FLIM 제어&quot;를 변경하여 최대 강도의 지점. 은 CCD가 포화되지 않도록 수집 매개 변수 (감광, 노출 시간)을 조정한다. </li><li> 전체 지연 범위에서 25 PS의 설정 지연 단계 ( &quot;FLIM 제어 : 빠른 지연 상자를 지연 채우기). </li><li> &quot;스냅 FLIM 이미지&quot;를 누르면 기준 염료 데이터를 획득. </li><li> 여기 레이저를 차단함으로써 제 2 배경 CCD 카메라 화상을 취득 (2.11.7 참조) </li></ol></li><li> μManager 수집 소프트웨어를 이용하여 멀티 웰 플레이트의 샘플 데이터를 획득 FLIM : <ol><li> 우물이 몇 군데해야 설정 및 FOV의 숫자가 아니라 ( &quot;XYZ 위치를 설정 HCA 시퀀스 인수&quot;)에 따라 획득 할 수 있습니다. </li><li> 수동으로 샘플을 포함하는 모형의 FOV가 몇 군데를 선택합니다. GOI에서 최적의 감광 필터, 게이트 폭을 결정하기 위해이 FOV를 사용카메라 일체형 시간 CCD 카메라의 동적 범위의 75 %에 도달하도록. </li><li> 설정 자동 초점 ( &quot;XYZ 제어 : 자동 초점&quot;)을 눌러 &quot;반환 초점 제어 만은&quot;다음 수동으로 세포 또는 관심의 구조에 초점을 맞 춥니 다. 2000 μm의하고 Enter 키를 누르십시오 &quot;입력&quot;을 &quot;자동 초점 검색 범위&quot;를 설정합니다. 보도는 &quot;AF는 이제&quot;자동 초점 절차를 시작합니다. 오프셋 값은 필드 &quot;FocusOffset (자동 초점)&quot;에 표시됩니다. </li><li> 자동 초점 시스템의 올바른 작동을 나타내는, &quot;AF 오프셋&quot;에 2.13.3에서 얻은 오프셋 값을 입력하고 오프셋 값이 지금 제로 있는지 확인하기 위해 ( &quot;AF 지금&quot;)의 두 배 자동 초점 절차를 반복합니다. </li><li> 지연 포인트의 로그 샘플링을 선택합니다 OpenFLIM-HCA 수집 소프트웨어의 &quot;AutoGate&quot;기능을 사용합니다. 또한, 이러한 수동으로 선택할 수 있습니다, 참조 참조자세한 내용은 36 줬어. </li><li> 수율은 총 데이터 수집 시간을 요구하는 값으로 &quot;누산 프레임&quot;을 설정합니다. 축적 된 프레임의 수를 증가 시키면 증가 총 FLIM 데이터 획득 시간의 희생 FLIM 데이터의 신호 대 잡음 비를 증가시킨다. </li><li> 은 &quot;HCA 시퀀스 시작&quot;버튼을 눌러 멀티 웰 플레이트의 FLIM 수집을 실행합니다. </li></ol></li><li> FLIM 데이터 수집에 사용되는 바와 같이 동일한 인수 설정 여진 레이저 (2.11.7 참조)를 차단하여 상기 배경 CCD 카메라 화상을 취득. </li></ol> 3. openFLIM-HCA 데이터 분석 FLIMfit 사용 <ol><li> FLIM 데이터 분석이 필요한 보조 파일이 존재 확인 (즉, IRF 참조 염료 측정). </li><li> 빈도 (H1)에서 데이터를로드, 잘 포함하는 배지 (H2)와 문화 매체에 잘 포함 된 레이블이없는 세포 (H3) FLIMfit에( &quot;파일 :로드 FLIM 데이터&quot;) 웰 A1-G3에, 즉, &quot;기증자 전용&quot;발현하는 세포에서보다 큰 1 % 신호의 배경 기여가 있는지 확인합니다. </li><li> ( &quot;로드 FLIM 데이터 파일&quot;) FLIMfit에 잘 문화 매체를로드하여 시간에 따라 변화하는 배경 (TVB) 파일을 준비합니다. 섹션 2.14에서 획득 한 카메라 배경 데이터로드 ( &quot;배경 :로드 배경을&quot;)와 FLIMfit 옵션 &quot;도구 : TVB의 강도지도 만들기&quot;를 사용 TVB를 생성합니다. TVB에 대한 자세한 사항 31을 참조하십시오. </li><li> 섹션 2.11에서 획득 한 IRF 데이터를로드하여 공간적으로 변화하는 IRF 시프트지도를 준비하고 절 2.11.7에서 취득 된 CCD 카메라 배경을 뺍니다. FLIMfit 옵션 &quot;도구 : IRF 만들기지도를 Shift 키&quot;를 사용 공간 IRF지도 시프트 변하는 계산합니다. IRF 시프트지도에 대한 세부 사항에 대한 기준 [31]을 참조하십시오. </li><li> monoexponen를 장착섹션 2.12에서 취득한 참조 염색은 최초 데이터 붕괴. 로드 참조 염료 및 3.4 절에서 계산 된 공간적으로 변화하는 IRF지도, 설정에 맞게 매개 변수 ( &quot;수명 : 호 특급 : 1&quot;)를 장착 매개 변수로 t에 0 세트 ( &quot;수명 : FIT IRF 이동 : 장착&quot;). 얻어진 t 0의 값은 &quot;매개 변수&quot;탭에 도시 된 표에보고된다. </li><li> 섹션 2.13에서 획득 한 실험 FLIM 데이터를로드하여 FLIM 데이터를 분석, 공간적 변화 IRF지도 3.4 절에서 계산, 섹션 2.14에서 획득 한 카메라 배경은 TVB 파일을 얻을 t 0의 음의 값에 3.3를 입력 준비 섹션 3.5 ( &quot;IRF : IRF 이동 : t 0&quot;). 그런 다음, 실험 조건에 따라 36 FLIMfit 사용하여 원하는 감쇠 모델 실험 데이터를 장착한다. </li></ol>

저자는 공개할 것이 없습니다. 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.

우리는 시간 게이트 FLIM를 사용하여 HCA 용으로 설계된 자동화 된 멀티 웰 플레이트 현미경을 설명했다. 이 악기는 FLIMfit (36), 오픈 소스 프로그램 OMERO 클라이언트 32 μManager의 도구로 매트랩 작성 및 사용할 수를 사용하여 수행되는 OMERO 서버와 FLIM 데이터 분석에 데이터를 저장하는 옵션을 μManager로 작성된 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 제어 제어 소프트웨어, openFLIM-HCA는 자신의 FLIM의 HCA 기기를 구성하는 학술 연구를 가능하게하는 시스템 구성 요소 (48)의 목록 33 온라인으로 사용할 수 있습니다. 강력한 FLIM 데이터를 획득하기 위해서는, GOI 및 CCD 취득 설정을 최적화 및 t 0에서 어떠한 변화를 고려하는 것이 필요하다. 3.8.2에 설명 된 바와 같이, GOI 이득 설정 및 CCD 카메라 적산 시간 ~ 다 CCD 동적 범위의 75 %에 도달하도록 설정하여야한다. 유마다 게이트 지연에 더 GOI 전압 복수 CCD 프레임 축적 노래하는 잡음비 (49)에 신호를 증가 시키지만 이는 적은 형광 광자는 CCD 카메라 포화 프레임 축적 너무 수가 이전 프레임마다 취득되기 때문에 총 FLIM 획득 시간 (증가 증가한다) 등이 트레이드 오프는 각 실험에 대해 결정해야한다. 딜레이 생성기의 보정은 레이저 반복률에 따라 그리고 사용 된 반복율에 대한 정확한 교정 파일을 수집 소프트웨어에 로딩되는 것을 보장하는 것이 필요하다. 지연 상자를 교정하기위한 절차는 openFLIM-HCA 위키 (33)에서 찾을 수 있습니다. 셀룰러 형광도는 형광 신호에 비해 낮은 경우, 우리는 시간에 따라 변화하는 배경 (TVB)를 제공하기 위해 잘 함유 단지 배지로부터의 신호를 사용한다. 세포 배양액으로부터 배경 형광을 최소화하기 위해 피페놀 레드를 포함하는 미디어. 셀룰러 형광도가 중요한 경우, TVB는 표지 된 세포의 측정으로부터 유도 될 수있다. 이것은 자기 형광 배경 이미지의 모든 픽셀에 대해 동일한 것으로 가정하지만,이 경우 관리에주의해야한다. 형광도 셀을 통해 또는 여기 빔 또는 검출 감도가 시야에 걸쳐 균일하지 않은 경우 상당히 다양 할 경우이 가정은 유효하지 않습니다. 산란 여기 광 펄스를 이용하여 IRF 화상의 취득 피팅 프로세스에 데이터 모델과 콘볼 루션되는 시간 IRF 프로파일을 제공하고, 또한 시야에 걸쳐 IRF의 공간적 변이지도를 제공한다. IRF는 Nipkow 디스크가 IRF의 클리너 측정을 제공로부터 산란 된 여기 광을 이용하여, 우리의 장비, 이러한 콜로이드 현탁액 비록 같은 산란 샘플을 이미지화하여 측정 할 수있다. 타이밍 오의 정확한 결정여기 및 시간 게이팅의 지연 시간의 오차가 크게 피팅 프로세스에 영향을 미칠 수 있기 때문에 주 6 IRF는 중요 특히 복소 지수 감쇠 모델 피팅. IRF는 IRF의 공간적 변화가 동일해야하지만, 그 타이밍에 영향을 미칠 수는 여기 파장에서보다는 형광 발광 파장에 기록되기 때문에, 피팅 프로세스에 필요하지 정확히 산란 여기 광을 이용하여 취득 두 파장에서. 광학적으로 단면 한 FLIM에 Nipkow 디스크에서 취득한 IRF 대한 경우와 같이 또한 산란 IRF 세계적으로 인한 산란 오브젝트로부터 서로 다른 광로 길이로 실제 IRF 시간에 대하여 시프트 될 수있다. Protoc에 나타낸 바와 같이, 취득 된 산란 여기 광 IRF 적용해야 필요한 전체 시간 시프트이다이 보정 t 0, 단지 수 기준 염료 데이터로부터 계산올 단계 4.4. 다음 염료 상이한 여기 파장에 대해 사용될 수있다 : 메탄올 중 75 μM 쿠마린 153 용액 (τ는 4.3 ~ 50 NS)가 범위 295-442 nm의 여기에서 사용될 수있다; 에탄올 중 75 μM 쿠마린 6 용액 (τ ~ 2.43 NS 37)는 430-500 nm의 범위에서 여기에 사용될 수있다; 물 75 μM 로다 민 B 용액 (τ는 1.7 ~ 37 NS)는 488-575 nm의 범위에서 여기에 사용될 수있다. 이 시스템의 각 픽셀에 대해 서로 다른 IRF를 사용 FLIMfit 가능하지만 우리는주의, 보통은 공간적으로 변화 IRF 이미지의 모든 픽셀에 대해 동일한 시간 프로파일을 갖는다는 가정을하는 것이 합리적이지만 범위를 제시 의 공간적 글로벌 t 0을 기준으로 시간 오프셋을 변화. 우리는 산란광의 IRF에서 결정되는 IRF 시프트지도로이 설명합니다. 이와 함께 IRF 프로파일, t 0와 IRF 시프트지도는 실내에 사용된다화각의 각 픽셀은 적절한 IRF 장착되어 있는지 확인합니다. 그것은 어떤 FLIM 데이터 취득 전에 측정해야하므로 중요한 t 0 시간 서서히 변할 수있다. 사용자는 형광 감쇄 정보를 샘플링하고, 시간 - 게이트 및 여진 후 상대적인 지연의 폭을 설정하는 데 필요한 방법을 결정한다. 일반적으로, 검출 된 신호를 최대화하기 위해 다양한 게이트 폭을 사용하고 일반적으로 우리가 형광 단백질 표지 세포의 FLIM 4 NS 설정된 게이트 폭을 사용하는 것이 바람직하다. 시간 - 게이트 지연의 수는 분석에 사용되는 피팅 모델의 복잡성 주어진 (단지 여기 펄스 전에 신호를 측정하도록 설정된 하나의 게이트를 포함), 형광 소멸 프로파일을 샘플링하기에 충분해야한다. 최적 값 수명 및 감쇠 요소의 상대 진폭에 의존 할 수있다. 일반적으로, 4 게이트 피팅 단지 수에 충분가있는 동안 7 개 이상의 게이트 수도 붕괴더 복잡한 감쇠 모델에 사용될. 우리 FLIM은 FRET (51)의 주파수 도메인 수명 판독을 이용하여 전체 필드 현미경 시간 도메인 또는 주파수 도메인 기술의 범위를 사용하여 구현 될 수 있고, 멀티 웰 플레이트 어레이들의 자동화 FLIM의 HCA가 먼저 (비 절편)으로 구현되었음을 주목. 넓은 필드 시간 문 영상 (28)을 이용하여 HCA의 첫 번째 자동 광학 절편의 FLIM 멀티 웰 플레이트 리더는 다음보고되었다. 이어서, 넓은 필드 (비 절편) 주파수 도메인 FLIM의 HCA가 FRET 52 이용한 유전자 라이브러리 및 시간 게이팅 FLIM의 HCA 걸쳐 번역 후 변형 (티로신 인산화)을위한 선별에 적용되었다 HIV-1 개그의 분석을 FRET에 적용된 올리고머 53 FOXM1 (54)과 Raichu에서 RhoA와 RAC1 바이오 센서 (33)의 SUMOylation의. 이는 멀티 웰 플레이트 FLIM 26하지만 날짜가 t와 일치하도록 도전 입증되었다 TCSPC를 사용하는 것도 가능하다그는 넓은 필드 검색을 이용 기술의 처리량. 이 문제를 해결 수있는 하나의 새로운 접근 방식은 SPAD 어레이 (55)로 단일 광자 계수 검출기의 배열의 사용이다. 우리는 형광 단백질을 이용하여 FRET 임의의 판독은 피팅 모델과 관련된 가정에 의존한다 FLIMfit 또는 다른 FLIM 분석 소프트웨어로부터 얻은 파라미터의 절대 값주의 것을 취급되어야 참고. 프렛 도너 상당한 초 잔광 구성 요소가 예를 들어, FRET FLIM 데이터에 맞게하는 biexponential 모델의 사용은 전형적으로해야보다 FRETing 인구가 높은 표시에 관련한 빨리 감쇠 성분의 기여가 발생할 수있다. 그러한 mTq2FP 같은 모노 지수 수명이 도너를 사용하는 것이 바람직하다. 그럼에도, 최근 연구 FRET 분석을 계속 받게 형광 단백질 또는 어두운 상태에 의해 영향을받을 수 있음을 보여 주었다발색단 때문에 다양한 각도와 형광체의 배좌의 분포와이 κ 배향 계수의 이질성 (56) 간 거리. 그럼에도 불구하고, 우리와 다른 FRET의 형광 수명 판독은 생화학 적 측정과 상관 관계 및 단백질 상호 작용을 선별하거나 바이오 센서의 역학을 수행하는 데 사용할 수있는 유용한 결과를 생성 할 수 있음을 보여 주었다. 따라서 본 openFLIM HCA 플랫폼 FRET 또는 셀룰러 형광도 8을 이용뿐만 아니라, 염료 계의 프로브 (25)의 정량적 인 판독을 제공하는 형광 수명 기반 분석의 넓은 범위에 적용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>현미경 프레임</td><td>올림푸스</td><td>IX81</td><td>http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf</td></tr><tr><td>광학 자동 초점</td><td>올림푸스</td><td>ZDC</td><td>http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf</td></tr><tr><td>전동 (x-y-z) 현미경 스테이지</td><td>Marzhauser</td><td>00-24-565-0000</td><td>스테이지 Corvus 제어</td></tr><tr><td>여기 레이저 소스</td><td>Fianium</td><td>SC400-4</td><td>Supercontinuum 레이저 http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/</td></tr> <tr><td>게이트 광학 강화기&nbsp;</td><td>Kentech</td><td>고속 이미저(HRI)</td><td></td></tr> <tr><td>지연 발전기</td><td>Kentech</td><td>---</td><td>민첩한 지연 발생기 및 정밀 지연 발전기</td></tr><tr><td>카메라</td><td>참조 하마마츠</td><td>ORCA-ER-II</td><td></td></tr><tr><td>Nipkow 디스크 스캐너 장치&nbsp;</td><td>요코가와</td><td>CSU-X1&nbsp;</td><td>http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/</td></tr><tr><td>탑 햇 디퓨저</td><td>Thorlabs</td><td>ED1-S20-MD</td><td>엔지니어링 디퓨저</td></tr><tr><td>mTq5V&nbsp;</td><td>Oxford Genetics</td><td>P3850</td><td>m5 개의 아미노산 링커를 가진 청록색 금성 구조체</td></tr><tr><td>mTq17V</td><td>Oxford Genetics</td><td>P3847</td><td>m17 개의 아미노산 링커를 가진 청록색 금성 구조체</td></tr><tr><td>mTq32V</td><td>Oxford Genetics</td><td>P3848</td><td>m32 개의 아미노산 링커를 가진 청록색 금성 구조체</td></tr><tr><td>Oxford</td><td>Genetics</td><td>P3849</td><td>mTurquoise Amber 구조체</td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>---</td><td>---</td><td>세포 유형 사용</td></tr><tr><td>페놀 레드-프리 HBSS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>55021C-1000ML</td><td>이미징 배지</td></tr><tr><td>배양 배지</td><td></td><td></td><td>DMEM + 10% FBS + 0.5% 항생제</td></tr><tr><td>DMEM</td> 배<td>양 배지용</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6046-500ML</td> 배양 배지</tr>용 <tr><td>FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C-500ML</td><td></td></tr><tr><td>xTremeGene9</td><td>Sigma Aldrich</td><td>6.37E+09</td><td>transfection의 경우,</td></tr><tr>세포 분리를 위한 La Roche<td>trypsin/EDTA Solution</td><td>Thermo Fischer</td>의 온라인 프로토콜 <td>따르기 R001100</td><td>, Thermo Fischer의 온라인 프로토콜 따름</td></tr></tbody></table>

자동 형광 수명 이미징 현미경을 활용하여 오픈 소스 높은 콘텐츠 분석

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

우리는 멀티웰 플레이트에서 고정 또는 살아 있는 세포의 Förster 공명 에너지 전달(FRET) 기반 판독을 사용하여 단백질 상호 작용을 분석하기 위해 자동화된 형광 수명 이미징(FLIM)을 활용하는 오픈 소스 고함량 분석 장비를 제공합니다. 이는 결합 파트너를 식별하는 데 사용할 수 있는 올리고머화 또는 헤테로이합체화와 같은 단백질 상호 작용의 분자 간 FRET 또는 분자 간 FRET를 사용하여 판독된 세포 신호 전달 과정을 스크리닝할 수 있는 수단을 제공합니다. 여기에서는 이 자동화된 멀티웰 플레이트 FLIM 기기의 기능을 설명하고 HIV Gag 단백질 올리고머화에 대한 연구의 예시 데이터와 살아있는 세포에서 FRET 바이오센서의 시간 경과를 제시합니다. 그런 다음 하드웨어 구성 요소 목록과 μManager로 작성된 오픈 소스 데이터 수집 소프트웨어에 대한 설명을 참조하여 실제 구현에 대한 자세한 설명이 제공됩니다. 멀티웰 플레이트 FLIM 데이터 어레이를 분석하기 위한 OMERO 플랫폼용 오픈 소스 MATLAB 기반 클라이언트인 FLIMfit의 응용 프로그램도 제시됩니다. 고정 세포 및 살아 있는 세포를 이미징하기 위한 프로토콜이 요약되어 있으며 형광 단백질 기반 FRET 구조를 발현하는 세포를 사용하는 자동화된 멀티웰 플레이트 FLIM 실험의 시연이 제시됩니다. 이는 이 특정 FLIM FRET 데이터 세트에 대한 데이터 분석의 연습으로 보완됩니다.

우리는 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 기초 판독하여 단백질 상호 작용을 분석 자동화 형광 수명 이미징 (FLIM)을 이용하는 오픈 소스 고 함량 분석 (HCA) 기기를 제시한다. 이 openFLIM-HCA 기기에 대한 데이터 수집은 소프트웨어 μManager 작성 및 데이터 분석 FLIMfit에 착수에 의해 제어된다.

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

이 절차의 전반적인 목표는 오픈 소스 소프트웨어와 기본 기기를 사용하여 자동화된 다중 웰 플레이트 작업 흐름에서 시간 개폐식 형광 수명 이미징 현미경(FLIM)을 구현하는 방법을 보여주는 것입니다. 이 방법론은 일련의 고정 또는 라이브 셀에서 FLIM 기반 판독에 적용할 수 있습니다. 또한 세포 신호 처리 또는 단백질 상호 작용을 판독하는 데 특히 유용합니다.이 기술의 주요 장점은 FLIM이 강력한 정량적 판독값을 제공하고 단일 측정에서 상호 작용 모집단 비율을 제공할 수 있다는 것입니다. 수백 개의 시야에 걸쳐 수천 개의 세포에 글로벌 분석 기술을 적용하면 포스터 수지 에너지 전달 또는 FRET 판독을 활용할 수 있습니다. 예를 들어, 수명이 약 20피코초로 바뀐다는 이점을 활용하면 됩니다.Frederik Gorlitz와 함께 절차를 시연하는 것은 연구원인 Sunil Kumar와 소프트웨어 개발자인 Ian Munro가 맡습니다. 마이크로매니저를 시작하고 openFLIM-HCA 플러그인을 엽니다. FLIM 제어 탭에서 지연 상자 보정 파일을 선택하고 보정 파일을 엽니다.지연 생성기 장치와 관심 있는 레이저 반복률의 특정 조합에 대한 보정 파일을 선택합니다. 파일 메뉴에서 기본 폴더 설정을 선택하고 데이터를 저장할 폴더를 선택합니다. 모든 적절한 매개변수가 설정되었는지 확인한 후 전체 실험에 대해 게이트 광 강화 제어 상자에서 게이트 너비를 4나노초로 수동으로 설정합니다.기기 응답 기능 이미지 데이터를 획득하려면 대물렌즈 앞의 필터 큐브 카세트에 빔 블록을 수동으로 배치하여 레이저 광이 빠져나가는 것을 방지하고 빔 블록의 각도를 조정하여 현미경 프레임으로의 반사를 최소화합니다. Light path control 탭에서 회전 디스크 장치의 여기(excitation), 이색성(dichroic) 및 방출 필터를 설정하여 회전하는 Nipkow 디스크에서 산란되는 여기광의 비율이 최소 200밀리초의 카메라 통합 시간 동안 시스템을 포화시키지 않고 이미지화될 수 있도록 합니다. FLIM control 탭에서 programmable fast delay box가 적용되는 지연의 전체 범위에 대해 find max point 함수를 사용합니다.그런 다음 표시된 출력 추적을 확인합니다. 그리고 전체 기기 응답 기능 프로필이 빠른 지연 상자의 스캔 범위 내에 있도록 코스 지연 시간을 설정합니다. 중립 밀도 및 노출 시간 매개변수를 조정합니다.프레임 축적뿐만 아니라 카메라가 밝기 타임 게이트에서 포화되지 않고 유효 통합 시간이 200 밀리 초 이상이되도록합니다. FLIM 제어 메뉴에서 빠른 지연 상자를 선택하고 전체 지연 범위에서 25피코초 지연 단계를 설정합니다. 다음으로, 지연을 채우고 FLIM 이미지 스냅을 클릭하여 계측기 응답 함수 이미지를 획득합니다.그리고 인수가 완료될 때까지 기다리십시오. Light path control(광 경로 제어) 메뉴에서 neutral density(중성 밀도)를 선택하고 blocked(차단됨)를 클릭하여 레이저를 차단합니다. FLIM 제어 메뉴를 열고 fast delay box를 선택하면 increment box의 값을 늘려 delay steps 수를 줄일 수 있습니다.그런 다음 FLIM 이미지 스냅을 클릭하여 배경 카메라 이미지를 획득합니다. 참조 다이 데이터를 획득하려면 XYZ 제어 탭으로 이동하여 go to well 대화 상자에 H4 웰을 입력합니다. 다음으로, light path control 탭으로 이동하여 fast delay box의 전체 범위에서 find max point function을 사용하여 M 청록색 형광 단백질을 이미징하기 위한 적절한 excitation, dichroic 및 emission filter를 선택합니다.그런 다음 방금 설명한 대로 참조 다이 데이터와 해당 배경 이미지를 획득하기 위한 적절한 매개변수를 설정합니다. 다중 웰 플레이트 샘플에서 FLIM 데이터를 수집하려면 setup HCA sequenced acquisition 메뉴로 이동합니다. XYZ 위치 탭을 선택하고 이미지화해야 하는 웰과 웰당 획득할 시야 수를 설정합니다.이미징할 샘플이 포함된 대표 시야를 선택하고 카메라 통합 시간에 최적의 중성 밀도 필터를 설정하여 판독 카메라의 다이나믹 레인지의 75%에 도달하도록 합니다. XYZ control 탭의 auto focus 대화 상자에서 return focus control을 선택하고 관심 있는 세포 또는 구조에 현미경의 초점을 수동으로 맞춥니다. 자동 초점 검색 범위를 2000마이크로미터로 설정하고 Enter 키를 누릅니다.그런 다음 AF now를 클릭하여 자동 초점 절차를 시작합니다. 오프셋 값이 focus offset auto focus 필드에 나타납니다. 이 오프셋 값을 AF 오프셋 창에 입력하고 AF now를 두 번 클릭하여 자동 초점 절차를 반복합니다.이제 오프셋 값이 0으로 설정되어 자동 초점 시스템이 올바르게 작동함을 나타냅니다. 다음으로, FLIM control 탭에서 autogating 함수를 선택하여 지연 지점의 로그 샘플링을 보장합니다. 누적 프레임을 원하는 총 데이터 수집 시간을 산출하는 값으로 설정합니다.그런 다음 FLIM 수집 대화 상자에서 HCA 시퀀스 시작 버튼을 클릭하여 FLIM 다중 웰 플레이트 수집을 실행하고 방금 시연한 대로 배경 카메라 이미지를 획득합니다. 여기에서는 코셀(cocells)과 멀티 웰 플레이트(multi well plate)로 표현된 모델 프렛 시스템을 사용하는 대표적인 FLIM 프렛 분석법이 나와 있으며, 각 웰에서 명백한 일반적인 시야의 자동으로 획득된 형광 수명 이미지의 예가 나와 있습니다. 이 실험에서 negative control wells는 가장 긴 수명을 나타냈고 donor 수명은 가장 짧은 linker lengths와 함께 가장 낮은 fret 구조를 나타냈습니다.전반적으로, 각 웰의 모든 시야에 대한 평균 수명은 다중 웰 플레이트에 따라 다양했습니다. A1 우물에서 이미징된 모든 세포에 대한 donor fluorescence intensity decay profile을 mono exponential decay model에 대한 fit과 instrument response function의 평균을 구하면 fitting model이 유효함을 알 수 있습니다. 픽셀 단위 모노 지수 적합(pixel wise mono exponential fit)에서 얻은 멀티 웰 플레이트의 각 컬럼에 대한 평균 형광 수명에 대한 추가 분석은 링커 길이가 더 짧은 프렛 구조의 수명 감소를 보여주며, 다양한 프렛 효율로 실험을 시뮬레이션합니다.이 실험에서는 단백질 올리고머화에 대한 다양한 억제제의 작용에 대한 프렛 분석의 FLIM 데이터에 단일 지수 붕괴 모델이 적용되었습니다. 형광 수명 플레이트 맵은 8개의 시야각에 걸쳐 평균화된 웰당 평균 수명을 보여줍니다. 하나의 작은 세트, 웰당 4개의 시야를 이미징하는 반면, FLIM 분석은 기기 응답 기능, 참조 다이 데이터를 획득하고 FLIM fit에서 분석을 실행하는 시간을 포함하여 약 2시간 30분 내에 완료할 수 있습니다.FLIM 분석을 수행할 때 FLIM 데이터를 분석하는 데 필요한 모든 정보를 얻을 수 있도록 기기 응답 기능 및 참조 다이 데이터를 배경 이미지와 함께 획득하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 당사의 오픈 소스 소프트웨어인 FLIM fit을 사용하면 이 데이터를 더 복잡한 감쇠 모델에 맞출 수도 있습니다. 예를 들어, 프렛 개체군 분수를 결정할 수 있습니다.자사의 FLIM HCA 기술은 신약 개발 커뮤니티의 연구자들이 프렛을 확실하게 측정할 수 있도록 돕고 있습니다. 앞으로 이 기술을 통해 세포 기반 분석에서 해리 상수를 측정할 수 있기를 바랍니다. 이 비디오 논문과 Wiki의 정보가 다른 연구자들이 자체 FLIM HCA 기기를 구축하고 이를 fret 및 다른 분석에 적용하는 데 도움이 되기를 바랍니다.레이저로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이러한 기기를 사용할 때는 항상 모든 레이저 빔을 둘러싸는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 문서에서는 우리가 자동 스캔 공촛점 현미경을 사용하여 표면에 고정화 각 DNA 분자의 흔적을 걱정 얻는 방법에 대해 설명합니다.

표면 고정화 Biomolecules의 단일 분자 형광 측정을위한 자동화된 시스템

형광 수명 이미징 (FLIM)는 이미지 환경과 특정 단백질과 생활 세포에있는 염료의 상호 작용에 핵심 기술로 부상하고있다. 형광 분자 rotors의 FLIM은 살아있는 세포의 점도 매핑 있습니다.

생활 세포의 분자 Rotors의 형광 수명 이미징

출처: Nyström, S., et al., 초분광 컨포칼 현미경 및 형광 수명 이미징에 의한 발광 복합 올리고티오펜으로 염색된 아밀로이드 조직 이미징. J. Vis. 특급 (2017). 이 동영상은 hFTAA 염료를 사용하여 아밀로이드 조직을 반영하는 색상으로 구분된 이미지에서 소형 코어를 파란색/녹색으로, 불안정한 주변부를 빨간색/노란색으로 표시하여 형광 수명 이미징 현미경 또는 FLIM으로 아밀로이드 구조를 분석하는 방법을 보여줍니다.

Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy를 사용한 조직 절편의 아밀로이드 구조 분석

출처: Pigazzini, M. L., et. al. 노화 시 아밀로이드 구조의 특성화 C. 엘레간스 형광 수명 이미징을 사용하여. J. Vis. Exp. (2020). 이 동영상은 형광 수명 이미징 현미경(FLIM)을 사용하여 C. elegans 뉴런에서 polyQ 단백질 응집을 평가하고 대조군 및 샤페론 단백질 결핍 기생충을 비교하는 방법을 보여줍니다. 샤페론이 결핍된 웜의 응집이 증가하면 군집된 형광단 간의 에너지 전달이 촉진되어 형광 수명이 단축됩니다. FLIM에서 생성된 색상으로 구분된 지도는 이러한 차이를 묘사하여 실험 그룹 간의 집계 수준을 강조합니다.

Caenorhabditis elegans 뉴런에서 PolyQ 단백질 응집의 형광 수명 이미징

형광 표지 된 세포의 다중 이미지 기반 분석을 가능하게하는 유연한 정보학 워크 플로우입니다 발표. 워크 플로는 핵 및 세포질 마커를 정량화하고 이러한 구획 사이에 마커 전위를 계산한다. 절차 96- 웰 포맷으로 간접 면역 형광에 의해 마커 검출 용 siRNA를 안정적인 방법을 사용하여 세포의 섭동 제공된다.

높은 콘텐츠, 오픈 소스 소프트웨어에 의해 지원되는 범용 현미경 데이터에서 형광 마커, 개별 셀 정량화를위한​​ 워크 플로우

아 밀 로이드 증 착 다른 질병의 특징은 고 고생 많은 다른 기관. 이 문서에서는 발광 활용된 oligothiophene 형광 형광 현미경 검사 법 기술 함께에서 얼룩의 응용 프로그램을 설명 합니다. 이 얼룩 메서드 검색 및 임상과 과학적인 설정에 단백질의 탐사를 위한 강력한 도구를 나타냅니다.

Confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 일생 화상 진 찰 Hyperspectral에 의해 발광 활용된 Oligothiophenes로 물 녹말 체 조직 이미징

이 프로토콜에는 포스터 공명 에너지 전달, 및 현미경 이미징 형광 수명에 따라 무 단백질의 복잡 한 형성의 양적 시각화에 대 한 허용 하는 새로운 방법을 설명 합니다.

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여기 우리는 widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템 (WHCAS)를 사용 하 여 슬라이드에 붙일 레이블된 조직의 자동화 된 세그먼트에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 생물 과학, 의료 공학, 건강 과학 등 생물 조직에서 형광 표식의 정량과 관련 된 모든 분야에서 광범위 한 응용 프로그램 있다.

자동된 슬라이드 스캔 및 Widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템을 사용 하 여 붙일 표시 된 조직에서 시장 세분화

마이크로패턴 어레이를 사용하여 단일 세포로부터 형광 리포터 타임 코스를 취득하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 단일 셀 어레이의 준비, 라이브 셀 스캐닝 시간 경과 현미경 검사법의 설정 및 작동 및 접착 부위당 세포 통합 형광 시간 과정의 자동화된 사전 선택, 시각적 제어 및 추적을 위한 오픈 소스 이미지 분석 도구에 대해 설명합니다.

세포 역학을 정량화하는 다목적 기술인 단세포 어레이(LISCA)의 라이브 셀 이미징

이 프로토콜은 레이저 광원 생성, 조직 샘플 준비, 이미징 수행 및 데이터 분석에 대한 세부 정보를 포함하여 SLAM(Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic) 현미경 기술에 대한 단계별 가이드를 제공합니다. SLAM은 조직 미세 환경을 조사하기 위해 4개의 상보적인 무표지 대비를 측정하여 비선형 현미경을 발전시킵니다.

동시 무표지 자가형광 다중 고조파 현미경

배우세요 자동 형광 수명 이미징 현미경(FLIM)을 활용한 고콘텐츠 분석 방법으로 단백질 상호작용을 정량적으로 측정하는 기술입니다. 고정 및 생세포 모두에 적용 가능하며 오픈소스 소프트웨어로 데이터 획득과 분석을 수행합니다.

자동 형광 수명 이미징 현미경을 활용하여 오픈 소스 높은 콘텐츠 분석

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