자동 형광 수명 이미징 현미경을 활용하여 오픈 소스 높은 콘텐츠 분석

이 절차의 전반적인 목표는 오픈 소스 소프트웨어와 기본 기기를 사용하여 자동화된 다중 웰 플레이트 작업 흐름에서 시간 개폐식 형광 수명 이미징 현미경(FLIM)을 구현하는 방법을 보여주는 것입니다. 이 방법론은 일련의 고정 또는 라이브 셀에서 FLIM 기반 판독에 적용할 수 있습니다. 또한 세포 신호 처리 또는 단백질 상호 작용을 판독하는 데 특히 유용합니다.

이 기술의 주요 장점은 FLIM이 강력한 정량적 판독값을 제공하고 단일 측정에서 상호 작용 모집단 비율을 제공할 수 있다는 것입니다. 수백 개의 시야에 걸쳐 수천 개의 세포에 글로벌 분석 기술을 적용하면 포스터 수지 에너지 전달 또는 FRET 판독을 활용할 수 있습니다. 예를 들어, 수명이 약 20피코초로 바뀐다는 이점을 활용하면 됩니다.

Frederik Gorlitz와 함께 절차를 시연하는 것은 연구원인 Sunil Kumar와 소프트웨어 개발자인 Ian Munro가 맡습니다. 마이크로매니저를 시작하고 openFLIM-HCA 플러그인을 엽니다. FLIM 제어 탭에서 지연 상자 보정 파일을 선택하고 보정 파일을 엽니다.

지연 생성기 장치와 관심 있는 레이저 반복률의 특정 조합에 대한 보정 파일을 선택합니다. 파일 메뉴에서 기본 폴더 설정을 선택하고 데이터를 저장할 폴더를 선택합니다. 모든 적절한 매개변수가 설정되었는지 확인한 후 전체 실험에 대해 게이트 광 강화 제어 상자에서 게이트 너비를 4나노초로 수동으로 설정합니다.

기기 응답 기능 이미지 데이터를 획득하려면 대물렌즈 앞의 필터 큐브 카세트에 빔 블록을 수동으로 배치하여 레이저 광이 빠져나가는 것을 방지하고 빔 블록의 각도를 조정하여 현미경 프레임으로의 반사를 최소화합니다. Light path control 탭에서 회전 디스크 장치의 여기(excitation), 이색성(dichroic) 및 방출 필터를 설정하여 회전하는 Nipkow 디스크에서 산란되는 여기광의 비율이 최소 200밀리초의 카메라 통합 시간 동안 시스템을 포화시키지 않고 이미지화될 수 있도록 합니다. FLIM control 탭에서 programmable fast delay box가 적용되는 지연의 전체 범위에 대해 find max point 함수를 사용합니다.

그런 다음 표시된 출력 추적을 확인합니다. 그리고 전체 기기 응답 기능 프로필이 빠른 지연 상자의 스캔 범위 내에 있도록 코스 지연 시간을 설정합니다. 중립 밀도 및 노출 시간 매개변수를 조정합니다.

프레임 축적뿐만 아니라 카메라가 밝기 타임 게이트에서 포화되지 않고 유효 통합 시간이 200 밀리 초 이상이되도록합니다. FLIM 제어 메뉴에서 빠른 지연 상자를 선택하고 전체 지연 범위에서 25피코초 지연 단계를 설정합니다. 다음으로, 지연을 채우고 FLIM 이미지 스냅을 클릭하여 계측기 응답 함수 이미지를 획득합니다.

그리고 인수가 완료될 때까지 기다리십시오. Light path control(광 경로 제어) 메뉴에서 neutral density(중성 밀도)를 선택하고 blocked(차단됨)를 클릭하여 레이저를 차단합니다. FLIM 제어 메뉴를 열고 fast delay box를 선택하면 increment box의 값을 늘려 delay steps 수를 줄일 수 있습니다.

그런 다음 FLIM 이미지 스냅을 클릭하여 배경 카메라 이미지를 획득합니다. 참조 다이 데이터를 획득하려면 XYZ 제어 탭으로 이동하여 go to well 대화 상자에 H4 웰을 입력합니다. 다음으로, light path control 탭으로 이동하여 fast delay box의 전체 범위에서 find max point function을 사용하여 M 청록색 형광 단백질을 이미징하기 위한 적절한 excitation, dichroic 및 emission filter를 선택합니다.

그런 다음 방금 설명한 대로 참조 다이 데이터와 해당 배경 이미지를 획득하기 위한 적절한 매개변수를 설정합니다. 다중 웰 플레이트 샘플에서 FLIM 데이터를 수집하려면 setup HCA sequenced acquisition 메뉴로 이동합니다. XYZ 위치 탭을 선택하고 이미지화해야 하는 웰과 웰당 획득할 시야 수를 설정합니다.

이미징할 샘플이 포함된 대표 시야를 선택하고 카메라 통합 시간에 최적의 중성 밀도 필터를 설정하여 판독 카메라의 다이나믹 레인지의 75%에 도달하도록 합니다. XYZ control 탭의 auto focus 대화 상자에서 return focus control을 선택하고 관심 있는 세포 또는 구조에 현미경의 초점을 수동으로 맞춥니다. 자동 초점 검색 범위를 2000마이크로미터로 설정하고 Enter 키를 누릅니다.

그런 다음 AF now를 클릭하여 자동 초점 절차를 시작합니다. 오프셋 값이 focus offset auto focus 필드에 나타납니다. 이 오프셋 값을 AF 오프셋 창에 입력하고 AF now를 두 번 클릭하여 자동 초점 절차를 반복합니다.

이제 오프셋 값이 0으로 설정되어 자동 초점 시스템이 올바르게 작동함을 나타냅니다. 다음으로, FLIM control 탭에서 autogating 함수를 선택하여 지연 지점의 로그 샘플링을 보장합니다. 누적 프레임을 원하는 총 데이터 수집 시간을 산출하는 값으로 설정합니다.

그런 다음 FLIM 수집 대화 상자에서 HCA 시퀀스 시작 버튼을 클릭하여 FLIM 다중 웰 플레이트 수집을 실행하고 방금 시연한 대로 배경 카메라 이미지를 획득합니다. 여기에서는 코셀(cocells)과 멀티 웰 플레이트(multi well plate)로 표현된 모델 프렛 시스템을 사용하는 대표적인 FLIM 프렛 분석법이 나와 있으며, 각 웰에서 명백한 일반적인 시야의 자동으로 획득된 형광 수명 이미지의 예가 나와 있습니다. 이 실험에서 negative control wells는 가장 긴 수명을 나타냈고 donor 수명은 가장 짧은 linker lengths와 함께 가장 낮은 fret 구조를 나타냈습니다.

전반적으로, 각 웰의 모든 시야에 대한 평균 수명은 다중 웰 플레이트에 따라 다양했습니다. A1 우물에서 이미징된 모든 세포에 대한 donor fluorescence intensity decay profile을 mono exponential decay model에 대한 fit과 instrument response function의 평균을 구하면 fitting model이 유효함을 알 수 있습니다. 픽셀 단위 모노 지수 적합(pixel wise mono exponential fit)에서 얻은 멀티 웰 플레이트의 각 컬럼에 대한 평균 형광 수명에 대한 추가 분석은 링커 길이가 더 짧은 프렛 구조의 수명 감소를 보여주며, 다양한 프렛 효율로 실험을 시뮬레이션합니다.

이 실험에서는 단백질 올리고머화에 대한 다양한 억제제의 작용에 대한 프렛 분석의 FLIM 데이터에 단일 지수 붕괴 모델이 적용되었습니다. 형광 수명 플레이트 맵은 8개의 시야각에 걸쳐 평균화된 웰당 평균 수명을 보여줍니다. 하나의 작은 세트, 웰당 4개의 시야를 이미징하는 반면, FLIM 분석은 기기 응답 기능, 참조 다이 데이터를 획득하고 FLIM fit에서 분석을 실행하는 시간을 포함하여 약 2시간 30분 내에 완료할 수 있습니다.

FLIM 분석을 수행할 때 FLIM 데이터를 분석하는 데 필요한 모든 정보를 얻을 수 있도록 기기 응답 기능 및 참조 다이 데이터를 배경 이미지와 함께 획득하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 당사의 오픈 소스 소프트웨어인 FLIM fit을 사용하면 이 데이터를 더 복잡한 감쇠 모델에 맞출 수도 있습니다. 예를 들어, 프렛 개체군 분수를 결정할 수 있습니다.

자사의 FLIM HCA 기술은 신약 개발 커뮤니티의 연구자들이 프렛을 확실하게 측정할 수 있도록 돕고 있습니다. 앞으로 이 기술을 통해 세포 기반 분석에서 해리 상수를 측정할 수 있기를 바랍니다. 이 비디오 논문과 Wiki의 정보가 다른 연구자들이 자체 FLIM HCA 기기를 구축하고 이를 fret 및 다른 분석에 적용하는 데 도움이 되기를 바랍니다.

레이저로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이러한 기기를 사용할 때는 항상 모든 레이저 빔을 둘러싸는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.