Bimolecular Complementation Affinity Purification - 두 개의 상호 작용하는 단백질을 분리합니다.

이분자 상보 친화성 정제를 사용하여 한 쌍의 특정 상호 작용 단백질을 검출하고 분리하려면 한 쌍의 이분자 형광 상보 플라스미드-형질감염제 혼합물을 포유류 세포가 포함된 배양 플레이트에 추가합니다.

하나의 플라스미드는 하나의 상호 작용 단백질(미끼 단백질)을 리포터 형광 단백질 단편에 융합하여 암호화합니다. 다른 플라스미드는 형광 단백질의 상보적 단편에 융합된 다른 결합 단백질인 먹이 단백질을 암호화합니다.

인큐베이트. 형질감염제는 플라스미드 세포 흡수를 촉진합니다. 성공적으로 형질감염된 세포는 세포막 국소 단백질을 발현합니다.

미끼-먹이 단백질의 상호 작용은 형광 단백질 조각을 더 가깝게 만듭니다. 이로 인해 단편이 융합되고 다시 접혀 기능성 형광 단백질이 형성되며, 형광 현미경으로 형광을 시각화할 수 있습니다.

배지를 비이온성 세제 함유 용해 완충액으로 교체하여 세포막을 파괴하여 융합 단백질을 방출합니다. 튜브에 세포 용해물을 수집합니다. 원심 분리기.

융합 단백질 함유 상청액을 신선한 튜브로 옮깁니다. 접힌 형광 단백질의 3차원 에피토프를 인식하고 결합하는 형광 단백질 표적 단일 도메인 항체인 나노바디와 접합된 아가로스 비드를 추가합니다.

원심 분리기. 융합 단백질 결합 아가로스 비드를 완충액에 재현탁합니다. 가열하여 아가로스 비드에서 융합 단백질을 해리시킵니다. SDS-PAGE를 수행하여 개별 단백질을 분리한 다음 형광 단백질 단편에 특이적인 항체로 웨스턴 블로팅

형광 단편으로 태그가 지정된 상호 작용 단백질만 검출되어 분리가 확인됩니다.

먼저, 10밀리리터의 DMEM이 들어 있는 10센티미터 접시에 HEK293T 세포를 시드합니다. 그런 다음 각 이분자 형광 상보 벡터 2.5마이크로그램을 500마이크로리터의 형질감염 완충액에 희석합니다.

10마이크로리터의 형질감염 시약을 첨가하고 혼합물을 10초 동안 소용돌이치게 합니다. 그런 다음 샘플을 잠시 원심분리하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로, DNA 형질감염 혼합물을 접시에 적방울 첨가합니다. 그런 다음 샘플을 8-24시간 동안 배양합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 용해 완충액 및 보충된 세포 용해 완충액을 준비합니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. PBS를 흡인하고 얼음처럼 차갑게 보충된 세포 용해 완충액 1밀리리터를 추가합니다.

그런 다음 접시를 얼음 위에 놓고 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 제거하고 냉각된 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브를 섭씨 4도에서 5분 동안 중력 18,000배로 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. 그런 다음 투명한 상청액을 신선한 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

적절한 양의 아가로스 비드를 PBS 1밀리리터로 세척합니다. 그런 다음 비드를 중력의 300배로 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 각 샘플에 20마이크로리터의 아가로스 비드를 추가하고 섭씨 4도에서 종단 간 회전으로 2시간 동안 배양합니다.

비드를 300배 중력으로 원심분리하고 세포 용해 완충액에서 세 번 세척합니다. 그런 다음 세척된 비드를 50마이크로리터의 희석된 샘플 완충액에 재현탁합니다. 마지막으로 샘플을 섭씨 95도에서 2-3분 동안 가열합니다.