단백질에서 다중 인산화를 식별하기 위한 핵 자기 공명 분광법(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

단백질의 다중 인산화는 다양한 위치, 특히 세린 및 트레오닌 잔기에서 단백질에 인산염기를 추가하는 것을 포함합니다.

단백질의 여러 인산화를 식별하려면 아미드 수소를 단백질의 다른 수소와 구별하는 데 도움이 되는 질소-15로 표지된 인산화 단백질이 들어 있는 튜브로 시작합니다.

상대 공명 주파수의 정확한 측정을 위해 내부 NMR 참조 화합물을 추가합니다. 혼합물을 핵 자기 공명 또는 NMR 튜브로 옮깁니다. 튜브를 회전하는 구멍에 삽입하고 NMR 분광계에 넣습니다.

인산염의 존재는 인산화된 세린 및 트레오닌 잔기에서 전자 인류 효과를 나타냅니다. 그 결과, 인산화된 잔기의 아미드 수소는 다른 아미드 수소에 비해 더 낮은 전자 밀도로 차폐가 해제되는 것으로 보입니다.

다양한 전자 환경을 가진 아미드 수소는 핵 주변에서 차동 자기장을 경험하여 저에너지 상태에 도달합니다.

짧은 고주파 펄스를 적용하여 수소 핵을 전자 환경에 따라 특정 공명 주파수에서 더 높은 에너지 상태로 여기시킵니다.

이완 동안 핵은 흡수된 에너지를 방출하여 저에너지 상태로 돌아가며, 이는 NMR 신호를 생성하도록 감지됩니다.

개별 아미드 수소를 나타내는 2차원 NMR 스펙트럼을 플로팅합니다.

인산화 단백질의 스펙트럼을 인산화되지 않은 단백질의 스펙트럼과 비교하십시오. 인산화된 단백질의 NMR 스펙트럼에서 추가 공명의 출현은 다중 인산화를 확인합니다.

400마이크로리터의 NMR 완충액에 동결건조된 ^15N및 ^13C농축 ERK-인산화-타우 4mg을 가용화합니다. NMR 분광계의 자기장 차단을 위해 5% 중수소 산화물을 추가하고 내부 NMR 신호 기준으로 1밀리몰 TMSP를 추가합니다. 또한 완전한 프로테아제 억제제 칵테일의 40x 원액 10마이크로리터를 추가합니다.

긴 바늘이 달린 전자 주사기 또는 파스퇴르 피펫을 사용하여 5밀리리터 NMR 튜브에 샘플을 옮깁니다. 플런저를 사용하여 NMR 튜브를 닫습니다. 플런저를 움직여 플런저와 액체 사이에 갇힌 기포를 제거합니다.

NMR 튜브를 스피너에 놓습니다. 적절한 게이지를 사용하여 스피너의 수직 위치를 조정하여 대부분의 샘플 용액이 NMR 코일 내부에 있도록 합니다. 그런 다음 자석 제어 시스템 창에서 "리프트"를 클릭하여 NMR 장비의 공기 흐름을 시작합니다. 튜브가 있는 스피너를 자석 보어 상단의 공기 흐름에 조심스럽게 놓은 다음 공기 흐름을 멈추고 튜브가 자석 내의 프로브 헤드 내부에 위치하도록 합니다.

샘플이 섭씨 25도까지 평형을 이룬 후 명령줄에 'atmm'을 입력하여 프로브 헤드의 반자동 튜닝 및 매칭을 수행하여 전력 전송을 최적화합니다. 그런 다음 자석 제어 시스템 창에서 "잠금"을 클릭하여 분광계의 필드 주파수 잠금을 사용합니다.

명령줄에 'topshim gui'를 입력하여 심 창을 열어 샘플 위치에서 자기장의 균질성을 최적화하기 위해 시밍 절차를 시작합니다. 그런 다음 심 창에서 "시작"을 클릭합니다. 잔차 B 0 표준 편차를 확인하여 심이 최적인지 확인합니다.

다음으로, 양성자 고주파 펄스의 길이(마이크로초)인 P1 매개변수를 보정합니다. 이 매개변수는 양성자 스핀 자화의 90도 회전을 얻는 데 필요합니다. 물 양성자의 1차원 스펙트럼을 사용하여 360도 펄스를 목표로 합니다.

01 매개변수를 1차원 스펙트럼의 양성자 물 주파수로 설정하여 주파수 오프셋을 조정합니다. 마지막으로 명령줄에 'zg'를 입력하여 1차원 양성자 스펙트럼 획득을 시작합니다.