스테로이드 수용체의 생화 학적 리간드의 Reconstitution • Hsp90 단백질 단지와 재가입 바인딩

이 절차의 전반적인 목표는 스테로이드 수용체 HSB 90 단백질 복합체를 생화학적으로 재구성하고 스테로이드 수용체 리간드 결합 활성을 재활성화하는 것이며, 이는 HSB 90 보조인자 요구 사항 및 재구성 과정에 외인성 화합물을 추가하는 효과를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 이는 먼저 기능성 글루코코르티코이드 수용체를 함유하는 세포 세포질을 준비함으로써 달성됩니다. 다음으로, 세포 세포질의 GR은 면역 흡수 및 내인성입니다.

HSP 90은 해리됩니다. 그런 다음 HSP 90 이종 복합체를 HSP 90 및 기타 샤페론 단백질 및 보조 인자의 외인성 공급원을 사용하여 재구성합니다. 마지막으로, 재구성된 단백질 복합체 및 리간드 결합 활성을 구체적으로 분석하여 SDS 페이지, 웨스턴 블로팅 및 방사성 리간드 결합 분석법을 사용하여 GR HSP 90 이종 복합체 형성 및 스테로이드 결합 활성을 나타냅니다.

이 방법은 HSP 90 분자 샤페론 분야의 주요 질문, 예를 들어 HSP 90 기능 활성을 촉진하는 데 필요한 보조 인자 샤페론 및 COS 샤페론에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 단백질 접힘에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, HSP 90 의존성 선도 화합물 개발 및 HSP 90 필요한 세포 내 신호 경로 분석과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 연구실에서 최근에 졸업한 두 명의 AWA의 Hannah Franklin과 Nathan이 될 것입니다. 기능적 글루코코르티코이드 수용체 또는 GR 성장 마우스 섬유아세포 L 9 29 세포 또는 SF 9 세포를 분리하기 위해 감염된 세포 재조합 GR 바오 바이러스이며 기하급수적 성장 단계에 있습니다. 5, 4 섭씨 온도에 5 분 동안 000 GS에 세포 현탁액을 원심 분리하십시오.

결과 펠릿의 부피는 약 1-5 밀리리터여야합니다. 세포 펠릿을 15ml의 행크 완충 식염수로 세 번 세척합니다. HEM 완충액 1개, 페닐 메틸 실플루오라이드 또는 PMSF 1개, 다운 50스트로크를 사용하여 분쇄된 완전한 미니 프로테아제 억제제 정제 3개를 포함하는 1.5부피의 균질화 완충액을 준비합니다.

균질화기는 세포를 파열시키고 단백질 분해를 방지하기 위해 얼음에 단계를 수행했습니다. 초원심분리기 100, 섭씨 4도에서 30분 동안 000Gs에서 균질화. 사이토졸을 함유한 슈퍼 나틴을 각각 500마이크로리터의 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 분취하고 영하 20도에서 보관합니다.

수용체 특이적 GR에 대해 제기된 단클론 IgG 항체를 포함하는 혼합물을 제조하려면 100마이크로리터의 해동 GR에 시토졸을 함유합니다. TEGM 완충액 200마이크로리터, 20% 단백질 아세로 또는 PAS 슬러리 100마이크로리터 및 버거 2와 같은 항G 단일클론 IgG 항체 5마이크로그램. PAS 비드 크기가 상대적으로 크기 때문입니다.

절단된 P 200 피펫 팁을 사용하여 20% 슬러리에서 시료 튜브로 PAS를 이송합니다. 샘플을 수직 회전 휠에 놓고 일정한 회전으로 최소 2시간 동안 배양합니다. 다음으로, 냉장 원심분리기에서 1분 동안 샘플을 회전시켜 항체 PAS 펠릿에서 결합되지 않은 단백질을 제거합니다.

10, 000 Gs에, TEGM 완충기 와류의 1 밀리리터를 추가해서 펠릿을 두번 세척하고, 그 후에 회전시키. 주름진 P 200 피펫 팁을 사용하여 GR 면역 펠릿에서 내인성 HSB 90을 분리하고 355마이크로리터의 TEG 완충액 및 45마이크로리터의 5몰 염화나트륨을 항체로 해리합니다. PAS 펠릿은 이전에 준비되었습니다.

샘플을 수직 회전 휠에 놓고 일정한 회전으로 1시간 30분 동안 배양합니다. 10, 000 Gs.Wash에 1 분 동안 그(것)들을 위한 회전시켜서 immuno 펠릿에서 unbound 단백질을 TEG 완충기의 1 밀리리터로 그리고 10 millimolar 더미의 1 밀리리터로 한 번 제거하십시오. 버퍼 pH 7.4 주름진 P 200 피펫 팁을 사용하여 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 세척을 제거합니다.

GR HSB 90 헤테로 복합체를 재구성하려면 토끼 망상적혈구, 용해물과 같은 분자 샤페론 공급원의 50마이크로리터 및 A TP 생성 시스템 시스템의 5마이크로리터를 포함하는 혼합물을 펠릿에 첨가합니다. 이 다음 단계는 펠릿 용액과 재구성 용액의 적절한 혼합을 보장하는 데 중요합니다. 섭씨 30도의 수조에서 정확히 20분 동안 샘플을 배양합니다.

펠릿을 부드럽게 방해하고 재구성 용액을 혼합하기 위해 1-2분마다 튜브를 튕깁니다. 10, 000 Gs.For에 TEGM 완충기 와동 그리고 분리기의 1개의 밀리리터를 추가하십시오. 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 상등액을 제거하십시오.

세척을 두 번 더 반복하여 재구성된 펠릿에서 단백질을 식별합니다. 베타 메르캅토에탄올 v.를 함유한 50마이크로리터의 SDS 페이지 샘플 버퍼를 추가하여 전기영동을 위한 샘플을 준비합니다. 샘플을 텍스트로 보낸 다음 끓는 수조 또는 섭씨 100도의 전자 열 블록에서 5분 동안 배양합니다.

10, 1 분 동안 000 GS에 표본을 분리기로 만드십시오. 이 샘플의 상등액을 SDS 페이지 또는 미세유체 전기영동에 사용한 후 웨스턴 블롯을 사용합니다. P 200 크림프 팁을 사용하여 supnate를 로드하면 펠릿의 우발적인 흡인을 제한할 수 있습니다.

다음 단계는 스테로이드 결합 활성을 위해 GR HSP 90 단백질 복합체를 분석하는 것입니다. 삼중화 스테로이드를 사용하여 재구성된 면역 펠릿에 첨가하는 것으로 시작합니다. 47.5 마이크로 리터의 HEM 완충액과 2.5 마이크로 리터의 2 마이크로 몰 삼중화 덱사메타손.

마이크로 원심분리기 튜브의 벽으로 변위된 샘플의 양을 최소화하도록 주의하면서 펠릿을 부드럽게 혼합합니다. 얼음 위에서 방해받지 않고 밤새 샘플을 배양합니다. TEGM 완충액 1 밀리리터를 부드럽게 혼합하고 1 분 동안 10, 000 GS에서 원심 분리하십시오.

마음챙김을 버리십시오. 그것은 TEGM 완충액을 가진 3개의 세척의 합계를 위한 unbound tritiated 스테로이드 반복을 완전하게 포함한다. 최종 세척이 끝나면 모든 상층액을 제거하십시오.

크림프 P 200 피펫 팁 사용. 세척된 면역 펠릿을 200마이크로리터의 TEGM 완충액에 현탁하고 10밀리리터로 옮깁니다. 섬광 바이알.

바이알과 와류에 4.8ml의 섬광 칵테일을 추가합니다. 마지막으로, 액체 섬광 분광법을 실시하여 대표적인 SDS 페이지와 웨스턴 블롯 데이터가 본 kumasi stain gel에 나타나 있습니다. 내인성 GR HSB 90 이종 복합체는 항 GR 항체를 사용하여 세포 세포질에서 면역 흡수되고 GR과 함께 흡수된 개별 단백질이 시각화되어 표시됩니다.

다음은 재구성된 GR HSP 90 헤테로 복합체를 나타내는 Experian 미세유체 전기영동 데이터입니다. GR 면역 흡수의 특이성은 과도한 양을 사용하더라도 항 GR 항체를 흡수하는 면역 광고를 비면역 항체로 대체함으로써 확인됩니다. GR 또는 분자 샤페론은 면역 침전되지 않습니다.

마찬가지로, 박리 및 재구성된 면역 펠릿의 웨스턴 블로에 의해 염이 제거된 GR로부터 HSP 90 및 기타 샤페론 단백질의 해리를 확인할 수 있습니다. 면역흡수 항체의 중쇄는 kumasi stain과 western blotting으로 모두 검출할 수 있으며, 각 레인에서 동일한 크기의 면역 펠릿이 시각화되고 있음을 확인합니다. 면역 흡수성 GR의 대표적인 스테로이드 결합 활성 데이터는 망상적혈구 용해물 또는 정제된 단백질을 사용하여 여기에 제시됩니다.

재구성된 GR HSB 90 이종 복합체의 스테로이드 결합 활성은 일반적으로 내인성 GR HSB 90 결합 활성 수준의 75 내지 100%로 복귀합니다. 전기영동 데이터와 유사하게, 항 GR 항체 대신 비면역 항체를 음성 대조군 및 비특이적 트리티화 스테로이드 결합의 척도로 사용할 수 있습니다. 이 절차에 따라 HSP 90 번역 후 변형이 이종 복합체 재구성 및 스테로이드 결합 재구성에 미치는 영향과 같은 추가 질문에 답하기 위해 2D 겔 전기영동과 같은 다른 방법을 수행할 수 있으며, 여기에 설명된 것과 같은 스테로이드 결합 재구성 분석을 통해 연구자들은 글루코코르티코이드 수용체를 모델 HSP 90 클라이언트로 사용하여 HSP 90 HSP 70 기반 MultiPro 샤프론 기계 및 단계적 조립의 기능적 중요성을 탐구할 수 있었습니다 단백질.

이 동영상을 시청한 후에는 세포 용해물의 정제된 단백질에서 기능성 글루코코르티코이드 수용체 HSP 90 단백질 복합체를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 사용되는 단계에는 세포 용해물 수용체 면역 흡수를 포함하는 GR 준비, 내인성 단백질의 염 제거 및 외인성 HS P 90, HSP 70 보조 인자 및 cos chaperones를 사용하여 이종 복합체의 재구성이 포함됩니다.