항체에 반응하는 마우스 골수 유래 대식세포의 활성화(Activation of mouse bone marrow-derived macrophages in response to antibos)

병원체 노출 후 대식세포는 활성화되어 전염증성 및 항염증성 사이토카인을 방출하여 면역 체계 반응을 조정합니다.

시험관 내에서 골수 유래 대식세포 활성화를 연구하기 위해, 분리된 마우스 골수 세포 현탁액을 배양 플라스크로 옮긴다. 잠시 인큐베이팅합니다.

중간엽 세포, 단핵구 및 성숙한 대식세포는 플라스크 표면에 부착되는 반면 조혈 전구세포는 현탁액으로 남아 있습니다.

조혈 전구 세포를 포함하는 배지를 수집하고 원심분리합니다. 대식세포 콜로니 자극 인자, M-CSF, 배지에 재현탁된 세포를 배양 플라스크로 옮깁니다.

M-CSF는 골수 전구 하위 집단을 대식세포로 분화시키며, 대식세포는 분지되어 플라스크에 부착됩니다.

부착성 세포 함유 배지를 버립니다. M-CSF 배지를 추가하고 배양합니다. 대식세포가 완전한 기능 상태에 도달하면 수확합니다. 원심 분리기.

M-CSF 배지에 재현탁된 플레이트 대식세포를 멀티웰 플레이트 웰에 재현탁합니다. 대식세포가 웰에 부착된 후 인간 다클론 면역글로불린과 독소인 박테리아 지질다당류(LPS)를 추가합니다.

면역글로불린은 특정 FCγ 수용체에 결합하는 반면 LPS는 대식세포의 Toll 유사 수용체에 결합합니다. 이 공동 자극은 다운스트림 신호 전달 캐스케이드를 통해 항염증 대식세포 활성화를 유도하여 높은 수준의 항염증성 사이토카인과 낮은 수준의 전염증성 사이토카인의 방출을 유발합니다.

대식세포 활성화를 확인하기 위한 추가 분석을 위해 사이토카인 함유 배지를 수집합니다.

안락사된 쥐를 팔다리를 쭉 뻗은 채 폼 보드 위에 누운 자세로 고정한 다음 70% 에탄올로 다리를 청소합니다. 다음으로 약 2mm 깊이의 얕은 절단을 하여 각 뒷다리 표면의 피부와 털을 제거합니다. 그런 다음 조직을 해부하여 경골과 대퇴골에 접근합니다.

경골과 대퇴골을 제거하려면 고관절 바로 아래와 발목 위의 뼈와 근육을 자릅니다. 그런 다음 뼈에서 가능한 한 많은 근육 조직을 제거하십시오. 그런 다음 뼈를 70% 에탄올로 세척하고 1분 동안 증발시킨 다음 뼈 플러시 배지로 채워진 6웰 플레이트에 뼈를 넣습니다.

플레이트에서 대퇴골의 양쪽 끝에서 1mm를 다듬어 내부 구멍이 노출되도록 합니다. 26게이지 바늘이 충치에 접근할 수 있는지 확인하십시오. 다음으로 경골과 대퇴골을 무릎 관절에서 분리합니다. 그런 다음 10밀리리터 주사기에 부착된 바늘을 골강에 삽입하고 골수를 채취합니다.

4개의 뼈 모두에서 골수를 50밀리리터의 뼈 플러시 배지가 있는 50밀리리터 원추형 튜브에 모입니다. 배지와 골수를 위아래로 여러 번 피펫팅하거나 느린 속도로 소용돌이치어 현탁액의 덩어리를 부드럽게 분산시킵니다. 골수 끈은 길이가 반 밀리미터 미만인 작은 골수 조각으로 나누어야 합니다.

다음으로, 튜브에 뼈 플러시 배지로 50밀리리터까지 채우고 75제곱센티미터 조직 배양 플라스크에 옮깁니다. 골수를 한 시간 동안 배양합니다. 배양하는 동안 성숙한 세포는 플라스크에 부착되고 원하는 조혈 전구세포는 현탁액으로 유지됩니다. 현탁액을 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 세포를 펠릿으로 회전시킵니다.

다음으로, 상청액을 버리고 세포 펠릿을 5밀리리터의 MCSF 배양 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 세포 밀도를 밀리리터당 500,000으로 조정하고 새 75제곱센티미터 플라스크에 30밀리리터를 넣습니다. 세포를 계속 배양하고 4일, 7일, 10일에 세포가 부착되어 있고 거꾸로 된 위상차 명시야 현미경을 사용하여 약간 분지되어 있는지 확인합니다.

세포를 확인할 때 비부착 세포가 포함된 배지를 폐기하십시오. 그런 다음 부착 세포를 IMDM으로 한 번 세척하고 신선한 MSCF 배양 배지 30밀리리터를 플라스크에 다시 추가합니다. 10일째에 배지를 8밀리리터의 효소가 없는 EDTA 기반 세포 해리 완충액으로 교체하여 세포를 수집합니다. 세포를 잠시 배양한 다음 세포를 부드럽게 긁어내고 현미경을 사용하여 방출되었는지 확인합니다.

세포가 방출되면 세포가 포함된 완충액을 50밀리리터 원추형 튜브로 옮긴 다음 플라스크를 5밀리리터 IMDM으로 세 번 헹구어 더 많은 세포를 수집합니다. 모든 수집품을 모으고 원심분리한 다음 펠릿을 3밀리리터의 MCSF에 재현탁합니다. 이제 세포의 수를 세고 농도를 밀리리터당 100만 개로 조정합니다.

그런 다음 96웰 평평한 바닥 플레이트에 웰당 100마이크로리터의 세포 현탁액을 플레이트합니다. 전체 접시는 채울 수 있어야 합니다. 세포가 부착될 때까지 약 한 시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 IMDM에서 준비된 다양한 농도의 LPS 또는 정맥 면역글로불린 또는 둘 다로 자극합니다. 모든 조작을 이중으로 또는 세 번 복제하여 수행하고 처리되지 않은 대조군을 유지한 다음 세포를 24시간 동안 배양하고 상청액을 분석합니다.