Murine 골 복 막 대 식 세포 활성화에 대 한 항 체 기반 약물 효과의 평가

항 체 기반 약물 염증 성 질병을 위한 처리를 혁명 있다. 데 뿐만 아니라 특정 대상에 대 한 직접 효과, 항 체 항 염증 되는 세포를 활성화할 수 있습니다. 이 프로토콜에 설명 합니다 어떻게 항 염증 제 대 식 세포 활성화 평가 생체 외에서, 마우스 골 수 세포, 그리고 vivo에서 복 막 대 식 세포를 사용 하 여 사용 될 수 있습니다.

이 실험의 전반적인 목표는 마우스 골수와 복막 대식세포를 사용하여 항염증 대식세포 활성화 상태에 대한 항체 기반 약물의 효과를 확인하는 것입니다. 이 방법은 특정 항체 약물이 대식세포를 IL-10 생성 항염증 활성화 상태로 변화시켜 작용하는지와 같은 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 in vitro 및 in vivo 복막강에서 골수에서 1차 마우스 대식세포의 반응을 측정한다는 것입니다.

멸균 후드에서 이 절차를 수행하십시오. 안락사된 쥐를 팔다리를 쭉 뻗은 폼 보드에 누워 고정합니다. 그런 다음 70% 에탄올로 다리를 청소합니다.

다음으로, 약 2mm 깊이의 얕은 절단을 만들어 각 뒷다리 표면의 피부와 털을 제거합니다. 그런 다음 조직을 절개하여 경골과 대퇴골에 접근합니다. 경골과 대퇴골을 제거하려면 고관절 바로 아래와 발목 위의 뼈와 근육을 자릅니다.

그런 다음 뼈에서 근육 조직을 최대한 많이 제거한다. 다음으로 70% 에탄올로 뼈를 세척하고 1분 동안 증발시킵니다. 그런 다음 뼈 살 배지로 채워진 6개의 웰 플레이트에 뼈를 놓습니다.

플레이트에서 대퇴골의 양쪽 끝에서 1mm를 잘라 내강이 노출되도록 합니다. 26게이지 바늘이 캐비티에 접근할 수 있는지 확인하십시오. 다음으로, 무릎 관절에서 경골과 대퇴골을 분리합니다.

그런 다음 10ml 주사기에 장착된 바늘을 골강에 삽입하고 골수를 채취합니다. 4개의 뼈 모두에서 골수를 50ml 원뿔형 튜브에 넣고 5ml의 뼈 살을 배지로 만듭니다. 배지와 골수를 여러 번 위아래로 파이프로 빼냅니다.

또는 느린 속도로 소용돌이를 일으켜 서스펜션의 덩어리를 부드럽게 분산시킵니다. 골수 줄은 길이가 50mm 미만인 작은 골수 알갱이로 분해해야 합니다. 다음으로, 뼈 살 배지로 튜브를 50ml로 채우고 75제곱센티미터 조직 배양 플라스크에 옮깁니다.

골수를 한 시간 동안 배양합니다. 배양 중에 성숙한 세포는 플라스크에 부착되고 원하는 조혈 전구 세포는 현탁 상태로 유지됩니다. 현탁액을 50ml 원뿔형 튜브로 옮기고 세포를 펠릿으로 회전시킵니다.

다음으로, 상등액을 버리고 세포 펠릿을 5 밀리리터의 MCSF 배양 배지에 재현탁시킵니다. 그런 다음 셀 밀도를 밀리리터당 500, 000으로 조정하고 새로운 75제곱센티미터 플라스크에 30밀리리터를 로드합니다. 세포를 계속 배양하고 4일, 7일, 10일에 반전 위상차 브레이크필드 현미경을 사용하여 세포가 부착되어 있고 약간 분지되어 있는지 확인합니다.

세포를 확인할 때 비부착성 세포가 포함된 배지를 폐기합니다. 그런 다음 부착 세포를 IMDM으로 한 번 세척하고 30ml의 신선한 MCSF 배양 배지를 플라스크에 다시 추가합니다. 10일째에 배지를 8ml의 효소가 없는 EDTA 기반 세포 해리 완충액으로 교체하여 세포를 수집합니다.

세포를 잠깐 배양한 다음 세포를 부드럽게 긁어내고 현미경을 사용하여 세포가 방출되었는지 확인합니다. 세포가 방출되면 세포와 함께 완충액을 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 더 많은 세포를 수집하기 위해 5ml의 IMDM으로 플라스크를 세 번 헹굽니다.

모든 컬렉션을 당겨 원심 분리하고 펠릿을 MCSF 3 밀리리터에 다시 현탁시킵니다. 이제 세포를 세고 농도를 밀리리터당 100만 개로 조정하십시오. 그런 다음 웰당 100마이크로리터의 셀 현탁액을 96웰 평면 바닥 플레이트에 플레이트합니다.

전체 접시는 채울 수 있어야 합니다. 세포가 부착될 때까지 약 한 시간 동안 배양합니다. 그런 다음 IMDM에서 준비된 다양한 농도의 LPS 또는 정맥 면역글로불린 또는 둘 다로 자극합니다.

모든 조작을 중복 또는 삼중으로 수행하고 처리되지 않은 컨트롤을 유지하십시오. 그런 다음 24시간 동안 세포를 배양하고 상층액을 분석합니다. 필요한 양의 면역글로불린과 LPS가 든 1ml 주사기를 준비하고 26게이지 바늘을 부착합니다.

컨트롤의 경우 PBS와 LPS를 대신 사용합니다. 쥐의 목덜미를 잡고 한 손으로 뒷다리와 꼬리를 고정합니다. 복부의 오른쪽 아래 사분면을 대상으로 베벨을 위로 하여 바늘을 30-40도 각도로 삽입하고 약 1.5cm 정도 삽입합니다.

그런 다음 덩어리를 주입합니다. 한 시간 후, 쥐를 안락사시킨 후 복막 대식세포를 채취합니다. 멸균 후드에서 안락사된 쥐를 팔다리를 벌린 폼 보드에 고정하고 70% 에탄올로 복부를 살균합니다.

그런 다음 정중선을 따라 2mm의 얕은 절개를 만들고 복부 피부를 당겨냅니다. 복막벽에 구멍을 뚫지 마십시오. 다음으로, pH 7.4의 멸균 PBS를 5ml 주사기에 완전히 로드하고 25 또는 27 게이지 바늘을 사용하여 바늘의 경사가 위로 향하게 하여 복막강 상단의 양쪽에서 정중선을 향해 마우스를 주입합니다.

바늘을 뽑은 후 복막을 10초간 마사지하여 세포를 제거합니다. 이제 바늘을 다시 삽입하고 캐비티에 다시 삽입하고 약 3.75ml의 세척액을 모으십시오. 세척액을 얼음 위의 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

주입, 마사지 및 세척액 수집을 세 번 더 반복하고 모든 수집물을 동일한 튜브로 당깁니다. 최종 수집 중에는 마우스의 먼 쪽에서 세척액을 빼내는 것이 더 쉬울 수 있습니다. 다음으로 세포를 스핀 다운하고 500 마이크로 리터의 도금 매체에 재현탁시킵니다.

그런 다음 생존 가능한 대식세포를 세고 밀리리터당 100만 개로 다시 부유시킵니다. 이제 100마이크로리터의 현탁액을 96웰 평평한 바닥 플레이트의 웰에 플레이트합니다. 다음으로, 한 시간 동안 세포를 배양합니다.

복막 대식세포는 플레이트에 부착됩니다. 그런 다음 비부착 세포를 제거하고 200마이크로리터의 따뜻한 IMDM으로 각 웰을 두 번씩 헹굽니다. 세탁할 때마다 10초 동안 기다렸다가 접시를 천천히 기울여 헹굼 용액을 당겨 빼냅니다.

세척 후 100마이크로리터의 도금 매체를 다시 추가하고 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다. ELISA의 경우 24시간 동안 자극 없이 세포를 계속 배양합니다. 그런 다음 사이토카인 분석을 위해 조절된 배지를 수집하고 정화합니다.

BMDM은 in vitro에서 염증성 자극에 도전할 때 항체 기반 약물 반응을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. LPS와 함께 면역글로불린을 정맥 주사하면 LPS 자극만 투여할 때보다 항염증성 사이토카인 IL-10의 생성이 7배 증가합니다. 그리고 IL-12/23p40의 생산을 감소시킵니다.

또한, 면역글로불린 정맥 주사 단독 또는 LPS와 함께 면역글로불린 자극은 MAP 키나아제 ERK1/2의 활성화를 증가시켰으며, 조기 및 장기간의 인산화를 동반했습니다. P-38의 활성화도 더 빨리 이루어졌습니다. 또한, 복막 대식세포는 PBS 주입 마우스와 비교했을 때 시험관 내 자극으로 IL-10 생산을 크게 증가시켰습니다.

다음으로 사이토카인 생산은 세척액과 생체 외 자극 복막 대식세포의 상등액에서 평가되었습니다. IL-10은 마우스에게 정맥 면역글로불린과 LPS를 투여할 때 세척액, 복막 세포 및 복막 대식세포에서 증가했습니다. 이에 비해 배양된 복막 대식세포에서는 전염증성 사이토카인 서브유닛 IL-12/23p40의 생성이 유의하게 감소했지만 세척액에서는 감소하지 않았습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 마우스 골수와 복막 대식세포를 사용하여 in vitro 및 in vivo에서 대식세포 활성화 상태에 대한 항체 기반 약물의 효과를 테스트하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.