Visualization of Caspase Activation in Human Monocyte-Derived Macrophages

면역 세포에서 염증성 카스파제인 카스파제-1은 비활성 형태로 존재하는 주요 면역 반응 성분입니다. 이러한 비활성 형태는 촉매 도메인과 융합된 프로 도메인으로 구성되며 근접 유도 이량체화를 통해 활성화됩니다.

생체 내에서 카스파제 활성화를 시각화하려면 적색 형광 단백질과 한 쌍의 형광 상보 리포터 단백질을 발현하는 형질감염된 인간 단핵구 유래 대식균 배양으로 시작합니다. 리포터 단백질은 Venus-N 또는 Venus-C의 비형광 단편과 융합된 카스파제-1의 프로 도메인을 포함합니다.

박테리아 유래 염증 자극제인 지질다당류와 칼륨 이오노포어인 니제리신을 함유한 이미징 배지로 세포를 처리합니다.

지질다당류는 대식세포의 패턴 인식 수용체와 상호 작용하여 인플라마좀 복합체의 조립을 시작합니다.

니제리신 분자는 세포에 들어가 칼륨 이온과 결합하여 세포외 배지로 유출되고 세포내 칼륨 이온 농도를 감소시킵니다. 이것은 센서 단백질과 프로카스파제-1 사이의 가교 단백질인 어댑터 단백질로 인플라마좀 센서 단백질을 프라이밍하여 복합체를 형성합니다.

금성 단편을 포함하는 프로 도메인은 복합체의 어댑터 단백질과 상호 작용합니다. 이렇게 하면 두 조각이 가까워져 다시 접히고 형광을 발하게 됩니다.

epifluorescence 현미경으로 세포를 시각화합니다.

형질감염된 세포는 녹색 형광 반점과 함께 빨간색으로 나타나 카스파제 활성화를 확인합니다.

형질감염당 1.5밀리리터 멸균 마이크로튜브를 취하고 후드에 적절한 리포터 플라스미드와 카스파제-BiFC 플라스미드를 추가합니다. 피펫 스테이션, 장치, 팁, 전기천공 튜브 및 피펫을 멸균 층류 후드에 넣습니다. 핵 보호 장치를 연결하고 켭니다.

표시된 시작 화면에 형질감염 매개변수를 입력합니다. 전압을 누르고 1,000을 입력한 다음 완료를 눌러 1000볼트로 설정합니다. 너비를 누르고 40을 입력한 다음 완료를 눌러 펄스를 40밀리초로 설정합니다. 마지막으로 # 펄스를 누르고 2개를 입력한 다음 완료를 눌러 전기 펄스 수를 2로 설정합니다.

전기천공 튜브 중 하나를 가져다가 실온에서 3밀리리터의 전해 완충액 E로 채웁니다. 전기천공 튜브를 피펫 스테이션의 피펫 홀더에 삽입하여 튜브 측면의 전극이 안쪽을 향하고 튜브를 삽입할 때 딸깍 소리가 들리도록 합니다.

세포 펠릿을 취하여 10 마이크로리터의 예열된 재현탁 R-완충액을 각각 1 내지 2 곱 10 세포에 첨가하고 P20 마이크로피펫과 부드럽게 혼합합니다. 각 형질감염 튜브에 10마이크로리터의 세포 현탁액을 추가하고 P20 마이크로피펫으로 부드럽게 혼합합니다. 푸시 버튼을 두 번째 정지 지점까지 눌러 팁을 피펫에 삽입하고 클램프가 팁에 있는 피스톤의 장착 스템을 완전히 들어 올리

그런 다음 피펫의 푸시 버튼을 첫 번째 정지까지 누르고 세포 또는 플라스미드 DNA 혼합물이 들어 있는 첫 번째 튜브에 담가 샘플을 흡인합니다. 샘플이 담긴 피펫을 피펫 홀더에 매우 조심스럽게 삽입하여 피펫이 딸깍 소리를 내고 적절하게 배치되었는지 확인합니다. 터치 스크린에서 시작을 누르고 전기 펄스가 전달될 때까지 기다립니다.

천히 스테이션에서 피펫을 제거하고 푸시 버튼을 첫 번째 정지까지 천천히 눌러 형질감염된 세포 현탁액을 미리 예열된 항생제 가 없는 배지가 있는 해당 웰에 즉시 추가합니다. 형질감염된 세포로 플레이트를 부드럽게 흔들고 가습된 조직 배양 인큐베이터에서 1-3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 각 웰에 200마이크로리터의 예열된 배양 배지를 추가합니다.

접시를 인큐베이터에 넣고 유전자 발현을 위해 최소 24시간을 기다립니다. 다음날, 낙산화형광현미경을 사용하여 세포 생존력과 형질감염 효율을 검사합니다.

P1000 마이크로피펫을 사용하여 세포에서 배지를 조심스럽게 제거하고 500마이크로리터의 자극 용액을 웰 측면에 추가합니다. 처리되지 않은 대조군 웰을 실행하려면 자극 없이 이미징 매체를 추가합니다.

epifluorescence 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포를 시각화하려면 제조업체의 지침에 따라 현미경과 형광등을 켜십시오. 10배 또는 20배 대물렌즈를 선택하고 배양 접시를 현미경 스테이지에 놓습니다.

접안렌즈로 568나노미터 필터 아래의 세포를 찾아 리포터 적혈구를 발현하는 세포에 초점을 맞춥니다. 시야의 모든 빨간색 셀을 세십시오. 동일한 시야에 있는 동안 488 또는 512 필터로 변경합니다. 녹색인 빨간색 셀의 수를 세십시오. 최소 3개 필드의 최소 100개의 빨간색 셀을 계산합니다.