Visualization of Caspase Activation in Human Monocyte-Derived Macrophages

면역 세포에서 염증성 카스파제인 카스파제-1은 비활성 형태로 존재하는 주요 면역 반응 성분입니다. 이러한 비활성 형태는 촉매 도메인과 융합된 프로 도메인으로 구성되며 근접 유도 이량체화를 통해 활성화됩니다.

생체 내에서 카스파제 활성화를 시각화하려면 적색 형광 단백질과 한 쌍의 형광 상보 리포터 단백질을 발현하는 형질감염된 인간 단핵구 유래 대식균 배양으로 시작합니다. 리포터 단백질은 Venus-N 또는 Venus-C의 비형광 단편과 융합된 카스파제-1의 프로 도메인을 포함합니다.

박테리아 유래 염증 자극제인 지질다당류와 칼륨 이오노포어인 니제리신을 함유한 이미징 배지로 세포를 처리합니다.

지질다당류는 대식세포의 패턴 인식 수용체와 상호 작용하여 인플라마좀 복합체의 조립을 시작합니다.

니제리신 분자는 세포에 들어가 칼륨 이온과 결합하여 세포외 배지로 유출되고 세포내 칼륨 이온 농도를 감소시킵니다. 이것은 센서 단백질과 프로카스파제-1 사이의 가교 단백질인 어댑터 단백질로 인플라마좀 센서 단백질을 프라이밍하여 복합체를 형성합니다.

금성 단편을 포함하는 프로 도메인은 복합체의 어댑터 단백질과 상호 작용합니다. 이렇게 하면 두 조각이 가까워져 다시 접히고 형광을 발하게 됩니다.

epifluorescence 현미경으로 세포를 시각화합니다.

형질감염된 세포는 녹색 형광 반점과 함께 빨간색으로 나타나 카스파제 활성화를 확인합니다.

형질감염당 1.5밀리리터 멸균 마이크로튜브를 취하고 후드에 적절한 리포터 플라스미드와 카스파제-BiFC 플라스미드를 추가합니다. 피펫 스테이션, 장치, 팁, 전기천공 튜브 및 피펫을 멸균 층류 후드에 넣습니다. 핵 보호 장치를 연결하고 켭니다.

표시된 시작 화면에 형질감염 매개변수를 입력합니다. 전압을 누르고 1,000을 입력한 다음 완료를 눌러 1000볼트로 설정합니다. 너비를 누르고 40을 입력한 다음 완료를 눌러 펄스를 40밀리초로 설정합니다. 마지막으로 # 펄스를 누르고 2개를 입력한 다음 완료를 눌러 전기 펄스 수를 2로 설정합니다.

전기천공 튜브 중 하나를 가져다가 실온에서 3밀리리터의 전해 완충액 E로 채웁니다. 전기천공 튜브를 피펫 스테이션의 피펫 홀더에 삽입하여 튜브 측면의 전극이 안쪽을 향하고 튜브를 삽입할 때 딸깍 소리가 들리도록 합니다.

세포 펠릿을 취하여 10 마이크로리터의 예열된 재현탁 R-완충액을 각각 1 내지 2 곱 10 세포에 첨가하고 P20 마이크로피펫과 부드럽게