대식세포에서 인플라마솜 복합체 형성을 연구하기 위한 시험관 내 기술

1차 대식세포 배양액이 포함된 플레이트로 시작합니다.

대식세포의 톨 유사 수용체에 결합하는 박테리아 지질다당류(LPS)를 도입하여 단백질 NLR 패밀리 피린 도메인 함유 3 또는 NLRP3의 상향 조절을 유발합니다.

칼륨 이온의 유출을 매개하는 이오노포어를 추가합니다. 감소된 세포질 칼륨은 NLRP3를 활성화합니다. 활성화된 NLRP3는 어댑터 단백질의 모집을 올리고머화하고 유도하며, 이는 차례로 프로-카스파제-1을 모집하여 인플라마좀을 형성합니다.

자가 단백질 분해는 프로 카스파제-1을 염증성 세포 사멸 또는 파이로토시스를 매개하는 활성 카스파제-1로 전환합니다. 파이로토시스 중 DNA 손상은 핵 응축으로 이어집니다.

세포를 고정하고 세제로 처리하여 투과성을 합니다.

인플라마좀 관련 어댑터 단백질에 결합하는 1차 항체와 1차 항체에 결합하여 인플라마좀을 표지하는 형광 표지 2차 항체를 추가합니다.

핵을 표지하기 위해 형광 핵산 염색을 도입합니다. 형광 현미경에서 세포는 파이로토시스를 나타내는 응축된 핵과 인플라마솜 형성을 나타내는 어댑터 단백질의 병소를 나타냅니다.

니제리신 처리된 세포의 면역불화학적 분석을 위해 프로브 표지 세포를 세척하고 웰당 250마이크로리터의 고정 및 투과화 용액에서 세포를 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.

대식세포를 신선한 세척 완충액으로 세 번 더 세척하고, 얼음 위에서 1시간 동안 C-말단 카스파제 모집 도메인(ASC)을 포함하는 세포사멸 관련 반점 유사 단백질에 대한 1차 항체 250마이크로리터로 세포를 표지합니다.

배양이 끝날 때 세포를 세척하고 얼음 위에서 1시간 더 동안 250마이크로리터의 적절한 형광 염료 접합 2차 항체로 샘플을 라벨링하고 마지막 5분 동안 4마이크로리터의 적절한 형광 핵 염색 염료를 추가합니다.

콜드 워시 완충액으로 세포를 3회 세척한 후, 시연된 대로 7마이크로리터의 퇴색 방지 마운팅 매체로 슬라이드에 커버슬립을 장착하고 형광 공초점 현미경으로 대식세포를 이미지