Name: Caspase 활성화 분자 형광 보완성을 사용 하 여 경로를 조명 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 배우세요 살아있는 세포에서 카스파제 활성화 복합체의 실시간 조립을 시각화하는 이중분자 형광 보완법(BiFC)을 사용하는 방법입니다. 이 기술은 세포사멸 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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우리는 모든 이전 멤버 Bouchier 헤이즈 연구소의이 기술 개발에 기여를 인정 하 고 싶습니다. 이 작품 LBH 텍사스 아동 병원 소아 파일럿 수상에 의해 부분적으로 투자 되었다. 우리는 그녀의 팀과 함께 공동에서 출판 된 데이터를 포함 하는 허가 Joya 찬드라 (MD 앤더슨, 휴스턴, 텍사스) 감사 합니다. NIH (NIAID P30AI036211, NCI P30CA125123, 및 NCRR S10RR024574)와 조 엘 M. Sederstrom의 원조 자금 Cytometry 베일 러 의과대학에서 셀 정렬 코어에 의해 설명 하는 시 약의 개발 지원

1입니다. 셀 및 문화 요리 준비
참고: 조직 문화 층 류 두건에 1-3 단계를 수행 합니다. 장갑을 착용 한다.
<ol><li>경우 유리 하단 요리에 사용 하 여, fibronectin 함께 유리 코트. 플라스틱 접시를 사용 하 여 경우 1.2 단계를 건너뜁니다.<ol>
<li>Fibronectin의 0.1 mg/mL 해결책 확인: 1 X PBS의 9 mL에 1 mg/mL fibronectin 솔루션의 1 mL를 희석.</li>
		<li>0.5-1 각의 유리 하단 커버 fibronectin mL 및 실 온에서 1-5 분 동안 품 어.</li>
		<li>Fibronectin 솔루션을 수집 하 고 4 ° c.에서 저장 한 피 펫을 사용 하 여, 참고: fibronectin 솔루션 여러 번 다시 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>일단 1-2 mL 1 X PBS 가진 유리를 세척 하 고 PBS에서 발음.</li>
	</ol>
</li>
	<li>플레이트 1 x 105 셀 해당 셀의 2 ml에서 6 잘 플레이트의 당 문화 미디어 (다른 크기의 웰 스에 대 한 사용 하 여 셀 번호 표 1 참조). 셀 라인을 안정적으로 표현 하는 caspase BiFC 구성 요소 (내용 참조)를 사용 하 여 2 x 105 셀 접시 하 고 치료 단계 (3 단계)를 진행 합니다.</li>
	<li>조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 하룻밤 접시에 셀 수 있습니다.</li>
</ol>2. 세포의 transfection caspase BiFC 구성 요소를 소개 하
<ol><li>적절 한 transfection 시 셀 transfect 참고:이 프로토콜은 최소한의 독성에 대 한 최적화 된 Lipofectamine 2000에 대 한 지침을 설명 합니다. 이 프로토콜은 Hela 세포 MCF7 세포, LN18 세포에 성공적으로 사용 되었습니다. 추가 사용 하는 경우 transfection 시 약 제조업체의 지침에 따라 하 고 필요에 따라 최적화.<ol>
<li>무 균 튜브에 감소 된 혈 청 미디어의 750 µ L를 transfection 시 약의 12 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>5 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>10 추가 기자 플라스 미드 (형광 단백질, 예를 들어 빨간색 형광 단백질 [RFP], transfected 세포 레이블을 것입니다 인코딩 플라스)의 ng 페 수를 각 잘 살 균 1.5 mL 튜브에.</li>
		<li>20 추가 각 caspase BiFC 플라스 미드의 ng (예를 들어, 20 caspase-2 prodomain [C2 프로]의 ng-VC 및 20 ng C2 프로-VN의) 각 관 (표 2).</li>
		<li>감소 된 혈 청 미디어를 추가 하 여 100 µ L의 총 볼륨까지 각 튜브를가지고.</li>
		<li>P200 피 펫을 사용 하 여 추가 transfection 시 약 해결책의 100 µ L 단계 2.1.2에서에서 플라스 미드 혼합물에 dropwise 방식.</li>
		<li>실 온에서 20 분에 대 한 플라스 미드 transfection 시 믹스를 품 어.</li>
		<li>미디어는 피 펫을 사용 하 여 셀에서 또는 흡입으로 발음 하 고, 우물의 측면 아래로 부드럽게 혈 청 자유로운 미디어의 800 µ L 플라스틱 p1000 피 펫을 사용 하 여.</li>
		<li>P200 피 펫을 사용 하 여, 각 잘에 dropwise DNA-지질 복합체의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>셀 3 h에 대 한 37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터에 품 어.</li>
		<li>단층을 방해 하지 않도록 주의 복용는 피 펫 또는 포부 흡입을 사용 하 여 DNA 지질 복합물을 포함 하는 혈 청 무료 미디어를 제거.</li>
		<li>각의 측면 아래로 부드럽게 미리 따뜻하게 (37 ° C) 완전 한 성장 매체의 2 mL 플라스틱</li>
	</ol>
</li>
	<li>최적의 단백질 표정을 위한 24-48 h에 대 한 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포를 품 어.</li>
</ol>3입니다. caspase 활성화 유도
<ol><li>약물 또는 caspase 활성화 약 24 h 후 transfection 유도 자극으로 치료.<ol>
<li>원하는 농도의 약물을 미리 예 열 (37 ° C) 이미징 미디어 (완전 한 성장 매체 보충 Hepes [20 m m, pH 7.2-7.5]와 2-mercaptoethanol [55 μ M])와 섞어 부드럽게 추가 (표 3).</li>
		<li>미디어는 피 펫을 사용 하 여 셀에서 또는 흡입으로 발음 하 고, 우물의 측면 아래로 부드럽게 3.1.1에서 솔루션의 2 mL 플라스틱을 피 펫을 사용 하 여.</li>
		<li>치료 컨트롤 한 잘에 약물 없이 영상 미디어를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터에 셀을 품 어 또는 단계 4.3 시간 경과 실험에 대 한 진행.</li>
</ol>4입니다. Caspase BiFC 데이터 수집
<ol><li>
한 번 포인트 획득을 위한 Caspase BiFC
	<ol>
<li>현미경 및 형광 광원 제조업체의 지침에 따라 설정.</li>
		<li>RFP 필터 및 리포터 유전자 형광에 초점에서 세포를 찾아.</li>
		<li>손을-집계 카운터를 사용 하 여 시야에 RFP 긍정적인 세포의 모든 계산. 수를 기록 합니다.</li>
		<li>같은 시야를 유지 하면서는 GFP (YFP 필터 또는 사용 가능한 경우)로 전환 하 고, 녹색은 또한 적혈구의 수를 세 손을 집계 카운터를 사용 하 여 (금성 양성). 레드 셀만 금성 양성에 대 한 평가 되도록 두 필터 간에 앞뒤로 전환 합니다. (그림 3) 번호를 기록 합니다.</li>
		<li>각 접시의 세 가지 개별 영역에서 적어도 100 RFP 긍정적인 세포를 계산 합니다.</li>
		<li>각 지역에서 금성-긍정적인 transfected 세포 (즉, 레드 셀 또한 녹색)의 비율을 계산 합니다. 평균 표준 편차를 결과 백분율.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caspase BiFC의 3-차원 영상
	<ol>
<li>제조업체의 지침에 따라 현미경 켜고 수집 소프트웨어 시작.</li>
		<li>60 x 63 x 오일 목표를 선택 하 고 목적에 오일 한 방울을 배치</li>
		<li>올바른 플레이트 홀더를 사용 하 여 현미경 스테이지에 문화 접시를 놓습니다.</li>
		<li>Using epifluorescence 광원 및 현미경 눈 조각 또는 confocal 레이저와 컴퓨터 화면, 관심 분야를 탐색 합니다.</li>
		<li>RFP 레이저 또는 필터를 사용 하 여 기자 형광에 초점.</li>
		<li>이 시점까지 epifluorescence를 사용 하는 경우 confocal 레이저 광원 전환 하 고 카메라에 의해 획득 및 인수 소프트웨어 컴퓨터 화면에 표시 되는 셀의 라이브 이미지를 시각화.</li>
		<li>조이스틱 제어 및 초점 휠 using, 미세 조정 초점 및 셀의 위치는 셀 뷰 파인더의 중앙에. 서로에서 분리 되어 하 고 중복 되지 셀을 선택 합니다.</li>
		<li>실험에 사용할 최적의 설정을 결정 하는 출발점으로 비너스와 RFP에 대 한 입력 100 ms에 노출 시간을 50% 비율 레이저 파워.</li>
		<li>결과 이미지와 함께 디스플레이 히스토그램 두 채널에 대 한 검사 및 라이브 캡처를 켭니다.</li>
		<li>신호는 낮은 경우 이미지 만들 어렵다 증가 이미지에서 신호까지 증가 백분율 레이저 파워 및 노출 시간 좋아 보인다.</li>
		<li>신호 포화를 도달 하지 않는 확인 하십시오. 뚜렷한 피크는 각 형 석에 대 한 표시 되도록 디스플레이 히스토그램을 검사 합니다. 피크 포함 전체 히스토그램 표시, 경우 낮은 레이저 전원 및 노출 설정 (그림 2)를 입력 합니다.</li>
		<li>신호가 특정 되도록 동일한 조건 하에서 제어 (치료 비 페) 세포를 시각화 합니다. 참고: 단일 색상 transfectants 사용할 수 있습니다 또한 제어 크로스 오버, 그러나 신호는 고유 공간 (예: cytosolic 대 미토 콘 드리 아) 하는 경우이 필요 하지 않습니다.</li>
		<li>선택 하거나 현미경 소프트웨어에서 Z 스택 모듈을 엽니다.</li>
		<li>초점 손잡이 사용 하 여 대략적인 해당 하는 셀의 중심 초점 위치.</li>
		<li>셀이 더 이상 표시 될 때까지 한 방향으로 초점을 조정, 최고 위치이 옵션을 선택 합니다.</li>
		<li>셀이 더 이상 다시 표시 될 때까지 반대 방향으로 초점을 조정 하 고 선택이 하단에 위치 합니다.</li>
		<li>최적의 스텝 크기 (일반적으로 약 20 µ m)을 선택 하 고 자동으로 각 위쪽 및 아래쪽 위치 사이 20 µ m 단계에서 각 채널에 단일 이미지를 데리고 카메라에 수집을 시작 합니다.</li>
		<li>3D 렌더링 소프트웨어를 사용 하 여 3D 이미지 (그림 4영화 1) 재구성.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caspase BiFC의 시간 경과 영상
	<ol>
<li>실험 전에 적어도 1 시간 현미경 켜고 설정 온도 37 ° c</li>
		<li>40 x 60 x, 또는 63 x 오일 목표를 선택 하 고 목적에 오일 한 방울을 배치.</li>
		<li>올바른 플레이트 홀더를 사용 하 여 현미경 스테이지에 문화 접시를 놓습니다.</li>
		<li>CO2 소스를 사용할 수 있는 접시 홀더 위에 CO2 배달 장치 (일반적으로 CO2를 제공 하는 튜브에 부착 된 플 렉 시 유리 뚜껑)를 배치 합니다. 5% CO2 수준을 설정 하 고 소프트웨어에서 CO2 컨트롤러를 켭니다. CO2 소스를 사용할 수 없는 경우 20 mM Hepes 미디어 버퍼를 포함 합니다.</li>
		<li>이동 transfected 세포 분야 하 고 카메라에 의해 획득 및 인수 소프트웨어 RFP 레이저를 사용 하 여 컴퓨터 화면에 표시 되는 셀의 라이브 이미지를 시각화.</li>
		<li>다음 단계 4.2.8-4.2.12, RFP 레이저에 대 한 백분율 레이저 전원 및 노출 시간에 대 한 설정을 입력 합니다. 가능한 한 낮은 형광 신호를 감지할 수 이러한 값을 유지.</li>
		<li>긍정적인 통제를 사용 하 여 샘플 (예제 표 3 참조 하십시오), 따라 YFP 레이저 빛에 대 한 백분율 레이저 전원 및 노출 시간에 대 한 설정을 입력 하려면 단계 4.2.8-4.2.12. 가능한 한 낮은 아직도 금성 신호를 감지할 수 있는 동안 이러한 값을 유지.</li>
		<li>접시의 각 음에 대 한 다양 한 기자를 표현 하는 하나 이상의 셀을 포함 하는 다른 위치를 선택 합니다.</li>
		<li>촬영 프레임의 시간 경과 및 총 수의 각 프레임 사이의 시간 간격을 입력 합니다. 확인 시간 전에 다음 프레임은 받을 것 이다 모든 선택한 위치를 얻으려고 합니다.</li>
		<li>각 위치를 다시 방문 하 고 수정 하 고 필요에 따라 초점을 업데이트.</li>
		<li>온도 또는 외부 진동의 변화에서 발생할 수 있는 초점 드리프트를 수정 하려면 초점 드리프트 보정 시스템 (사용 가능한 경우)를 켭니다.</li>
		<li>시간 시작 하 고 데이터를 저장.</li>
		<li>(그림 5영화 2) 사용할 수 있는 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 분석 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이 프로토콜 caspase 유도 근접 측정을 분할 형광 단백질의 사용을 설명 합니다. 때문에 매우 밝은, 높은 photostable는 refolding 이며 빠른 13분할 금성이이 기술을 위해 선택 되었다. 따라서, caspase 유도 근접 시 refolding 비너스의 분석은 caspase 단백질 상호 작용 역동성의 실시간 의견 가까이 제공할 수 있습니다. 금성 금성 (비너스-N 또는 VN) 구성 아미노산 1-173의 N terminus 두 약간 겹치는 조각으로 분할 하 고 C 터미널 조각 (금성 C 또는 VC) 이루어진 잔류물 155-239. 다른 분할 형광 단백질 존재 하지만 분할 mCherry 같은 일부 refolding 21에 대 한 최대 2 h 4 ° C에 외피를 필요 합니다. 추가 분할 형광 단백질 리안 (청록색 형광 단백질의 버전) 분할 등 고 멀리 빨간 분할 mLumin 아직이 컨텍스트 13</s...

Caspase 프로 테아 제 가족은 apoptosis와 타고 난 면제 1에 그들의 중요 한 역할에 대 한 알려져 있다. 그들의 중요성 때문에 결정 언제, 어디서, 그리고 어떻게 효율적으로 특정 caspases 활성화 활성화 경로 caspase의 메커니즘에 대 한 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에 설명 된 이미징 기반된 프로토콜 caspase 활성화 폭포의 가장 이른 단계 시각화 수 있습니다. 이 기술은 활용 동적 단백질: 단백질 상호 작용의 그 드라이브 caspase 활성화.
Caspases는 두 그룹으로 분할 될 수 있다: 초기자 caspases (caspase-1,-2,-4,-5,-8,-9,-10, 및-12)와 사형 집행 caspases (caspase 3-6과-7). 사형 집행 caspases 미리 형성한 이합체로 셀에 존재 하 고 크고 작은 소 단위 2사이 분열에 의해 활성화 됩니다. 활성화 되 면, 그들은 apoptosis 3의 결과로 수많은 구조 및 규제 단백질을 쪼개 다. 초기자 caspases는 통로에서 활성화 될 및 일반적으로 사형 집행 caspases의 활성화를 방 아 쇠를 첫 번째 caspases. 사형 집행 caspases, 달리 초기자 caspases 이합체 화 4,5에 의해 활성화 됩니다. 이 이합체 화 활성화 플랫폼으로 알려진 특정 큰 분자량 단지를 비활성 단위체의 채용에 의해 촉진 된다. 정품 인증 플랫폼의 특정 단백질: 단백질 상호 작용의 일련에 의해 규율 됩니다. 이러한 보존된 단백질 상호 작용 주제 시작자 caspase의 proform에 의해 중재 되 고 죽음 도메인 (DD), 죽음 이펙터 도메인 (DED) 및 caspase 신규 모집 도메인 (카드) 6 (그림 1A)를 포함 합니다. 정품 인증 플랫폼은 일반적으로 수용 체 단백질과 접합 기 단백질을 포함. 수용 체는 일반적으로 수많은 분자의 oligomerization 수 있도록 구조적 변화를 유도 한 ligand의 바인딩 시 활성화 됩니다. 수용 체 다음 중 채용 caspase 직접 또는 어댑터 분자는 차례로 caspase는 복잡 합니다. 따라서, 수많은 caspase 분자 이합체 화를 허용 하는 가까이에 서. 이 유도 근접 모델 7이라고 합니다. 일단, dimerized는 caspase autoprocessing 활성 효소 4,8을 안정화 하는 역할을 겪 습. 예를 들어 Apaf1 apoptosome의 시 토 크롬 c 미토 콘 드리 아 외 막 permeabilization (MOMP) 라는 프로세스에서 미토 콘 드리 아에서 출시를 다음에 의해 트리거됩니다. Apaf1는 차례로 caspase-9 카드 두 단백질 9에 의해 중재 되는 상호 작용을 통해 보충 한다. CD95 죽음의 복잡 한 신호 유도 (디스크) caspase-8 활성화; 리드 어셈블리에 비슷한 단백질 상호 작용 결과 caspase-2;를 활성화할 수 있습니다 PIDDosome 그리고 다양 한 inflammasome 단지 caspase-1 정품 인증 10,,1112을 시작 하는. 따라서, 초기자 caspases는 유도 근접 고 이합체 화 없이 활성화를 발생 하지 것입니다 일반적인 메커니즘에 의해 특정 활성화 플랫폼을 채용.
Caspase 분자 형광 보완성 (BiFC)는 초기자 caspases의 활성화에서이 첫 번째 단계를 측정 하기 위해 개발 된 영상 기반 분석 결과 caspase 유도 근접 다음 활성화 플랫폼의 직접 시각화 어셈블리입니다. 이 방법은 분할 형광 단백질 비너스의 속성 활용합니다. 금성은 더 밝고 비 형광과 약간 겹치는 두 조각으로 분리 될 수 있다 노란 형광 성 단백질 (YFP)의 더 photostable 버전: 금성 금성 N (VN), 비너스 (금성 C 또는 VC)의 C-말단의 N terminus. 이 파편 refold 될 때 근접 13에 형광을 유지 합니다. 각 비너스 조각 활성화 플랫폼을 caspase의 최소 부분입니다 caspase의 prodomain에 융합 이다. 그러면 그는 caspases 효소 활동을 유지 하지 않습니다 및 따라서 생 이벤트와 관련 된 다운스트림 이벤트의 동시 분석 가능 하다. 금성 파편 refold caspase prodomains 활성화 플랫폼을 채용 하 고 유도 근접을 받 다. (그림 1B)입니다. 결과 금성 형광 정확 하 고 구체적으로 subcellular 지 방화, 활동, 그리고 단일 셀에서 초기자 caspase 활성화 플랫폼의 조립의 효율성을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. Confocal 현미경 검사 법에 의해 또는 표준 형광 현미경 검사 법에 의해 취득 될 수 있다 데이터 이미징 및 다른 현미경 방법 등의 숫자에 적응 시킬 수 있다: 실시간으로; caspase 활성화 추적 시간 경과 영상 subcellular 지 방화;의 정확한 결정을 위한 고해상도 이미징 그리고 활성화의 효율성의 끝점 정량화입니다.
이 기술은 caspase-214의 활성화를 조사 하기 위해 처음 개발 되었다. Caspase-2에 대 한 정품 인증 플랫폼은 PIDDosome 생각 된다, 하는 동안 구성 된 수용 체 PIDD (죽음 도메인으로 유도 하는 p53 단백질)와 RAIDD (죽음 도메인 RIP 관련 ICH-1/CAD-3 동종 단백질), 어댑터 PIDDosome-독립적인 caspase-2 정품 인증 보고 되었습니다. 이 caspase-2에 대 한 추가 활성화 플랫폼 존재 15,16나왔다. 모르고 caspase-2 활성화 플랫폼의 전체 구성 요소, 불구 caspase BiFC 기술은 분자 수준 14,17caspase-2 신호 통로의 성공적인 심문을 위해 허용 했다. 우리 또한 성공적으로이 프로토콜 염증 caspases (caspase-1,-4,-5-12)에 대 한 적응 18 , 원칙적으로, 동일한 접근 마찬가지로 나머지 초기자 caspases의 각각을 분석 하는 것을 충분 해야 한다. 이 프로토콜 마찬가지로 적응 될 수 있는 다른 경로 조사 이합체 화는 주요 활성화 신호 했다. 예를 들어, STAT 단백질 이합체 화 Janus 키 니 아 제 (JAK) 19에 따라 인 산화에 의해 활성화 됩니다. 따라서, BiFC 시스템 합계 활성화 뿐만 아니라 많은 다른 경로 동적 단백질 상호 작용에 의해 규제에 대 한 시각화 사용 될 수 있습니다. 다음 프로토콜 이미지 수집 및 분석을 위한 방법론 뿐만 아니라 세포로 기자 들의 도입에 대 한 단계별 지침을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>6-well Uncoated No. 1.5 20 mm 유리 바닥 접시</td><td>Mattek</td><td>P06G-1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>인간 플라즈마 Fibronectin 정제 단백질</td><td>Millipore</td><td>FC010-10MG</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma</td><td>D8537-6x500ML</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 시약</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>OPTI MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985088</td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VC plasmid</td><td>Addgene</td><td>49261</td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VN plasmid</td><td>Addgene</td><td>49262</td><td></td></tr><tr><td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td><td>available from LBH</td>HeLa cells 안정적으로 발현되는 C2-Pro BiFC 성분을 LBH DsRed 미토 플라스미드 Clontech Cell의 요청에 의해 입수할 수 있는 Inflammatory caspase BiFC plasmids <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td>632421 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>형광 리포터로 사용할 수 있는 유사한 플라스미드는 Addgene</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>2 Mercaptoethanol 1000X</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>q-VD-OPH</td><td>Apex Bio</td><td>A1901</td><td></td></tr>에서 찾을 수</tbody></table> 있습니다.

caspase 활성화 분자 형광 보완성을 사용 하 여 경로를 조명

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

프로 테아 제 caspase 제품군 apoptosis와 타고 난 면제에 필수적인 역할을 한다. 이 중, 초기자 caspases로 알려진 네가이 경로에서 활성화 될 먼저 있습니다. 이 그룹 포함 caspase-2,-8, 및-9, 뿐만 아니라 염증 caspases, caspase-1,-4, 그리고-5. 초기자 caspases 모두 다음 모집 활성화 플랫폼 이라고 하는 특정 multiprotein 복합물을 이합체 화에 의해 활성화 됩니다. Caspase 분자 형광 보완성 (BiFC)은 어디 caspases 초기자 caspases 그들의 활성화 플랫폼 및 그 결과의 채용을 시각화 하는 데 사용 되는 시작자를 융합 하는 형광 단백질을 분할 영상 기반 접근 유도 근접입니다. 이 형광 판독을의 초기자 caspase 활성화에 필요한 초기 단계 중 하나를 제공 합니다. 다양 한 다른 현미경-기반 접근을 사용 하 여,이 기술은 caspase 활성화 크기 및 caspase 활성화의 활동 인구 수준에 caspase 활성화의 효율성에 양적 데이터를 제공할 수 있습니다. 셀 당 기초에 있는 복합물

DNA 손상에 의해 유도 된 caspase-2 BiFC의 예는 그림 3에 표시 됩니다. Camptothecin는 topoisomerase 나 억제제, DNA 손상 및 caspase-2 활성화를 유도 하는 데 사용 되었다. 빨간 형광 단백질 mCherry 셀 BiFC 프로브 표현 게재 하 고 셀의 총 수를 시각화 하기 기자로 서 사용 되었다. 금성 형광 녹색으로 표시 됩니다 및 큰 puncta는 caspase-2 대표 근접을 유도. 이 세포는 금성-긍정적인 세포의 백분율을 결정 하기 위해 계산 수 있습니다. Subcellular 지 방화에 대 한 결론도 같은 이미지를 만들 수 있습니다. 예, caspase-2 유도 근접 세포질 17에서 또한 핵소체에서 발견 되었다. 복잡 한 caspase 활성화의 subcellular 지 방화의 고해상도 시각화를 제공 하려면 단일 셀 3 차원에...

이 프로토콜 설명 caspase 분자 형광 보완성 (BiFC); 그들의 활성화에 있는 첫걸음은 초기자 caspases의 유도 근접을 시각화 하는 데 사용할 수는 영상 기반 방법입니다.

Caspase 활성화 분자 형광 보완성을 사용 하 여 경로를 조명

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

이 방법론의 전반적인 목표는 이니시에이터 카스파제 활성화의 첫 번째 단계 중 하나를 시각화하는 것입니다. 이 단계를 유도 근접(induced proximity)이라고 하며, 세포사멸(apoptotic cell death) 동안 카스파아제(caspase) 분자가 모여 활성 이량체를 형성할 때 발생합니다. 이 방법은 특정 이니시에이터 카스파제를 언제, 어디서, 얼마나 효율적으로 활성화할 수 있는지와 같은 caspase 필드의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 살아있는 세포에서 카스파제 활성화 복합체의 조립을 실시간으로 시각화할 수 있다는 것입니다. 이 생체 분자 형광 보완 방법은 카스파제에 주입된 티록신 단백질인 금성의 단편을 사용합니다. 파편은 그 자체로는 형광성이 없지만 카스파제가 유도 근접을 겪을 때 두 개의 금성 반쪽이 합쳐져 불이 들어옵니다.세포를 transfection하려면 먼저 12마이크로리터의 transfection 시약을 멸균 튜브에 있는 750마이크로리터의 환원된 혈청 배지에 추가합니다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 10나노그램의 리포터 플라스미드를 트랜스펙션할 각 웰에 대해 스테릴 1.5밀리리터 튜브에 추가합니다.각 튜브에 각 caspase BiFC 플라즈마 20나노그램을 추가합니다. 감소된 혈청 매체를 추가하여 각 튜브의 총 부피를 최대 100마이크로리터까지 가져옵니다. P200 피펫을 사용하여 100마이크로리터의 트랜스펙션 시약 용액을 플라스미드 혼합물에 적방울 방식으로 첨가합니다.플라스미드 형질주입 시약 혼합물을 실온에서 20분 동안 배양한 후, 피펫을 사용하거나 흡입하여 세포에서 배지를 흡인합니다. 그런 다음 P1000 피펫을 사용하여 800마이크로리터의 무혈청 배지를 웰 측면으로 부드럽게 피펫팅합니다. P200 피펫을 사용하여 200마이크로리터의 DNA 지질 복합체를 각 웰에 적가합니다.조직 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도의 온도에서 3시간 동안 세포를 배양합니다. 배양 후, 흡입을 사용하여 흡인하거나 피펫으로 단층을 파괴하지 않도록 주의하여 DNA 지질 복합체를 포함하는 무혈청 배지를 제거합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 배양하기 전에 2밀리리터의 예열된 완전 성장 배지를 각 웰의 측면으로 부드럽게 피펫팅합니다.데이터를 수집하기 전에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 caspase 활성화 유도를 수행합니다. 제조업체 지침에 따라 현미경을 켜고 수집 소프트웨어를 실행합니다. 60x 또는 63x 오일 대물렌즈를 선택하고 대물렌즈에 오일 한 방울을 떨어뜨립니다.그런 다음 올바른 플레이트 홀더를 사용하여 배양 접시를 현미경 스테이지에 놓습니다. 히터를 켜고 온도를 섭씨 37도로 설정하십시오. RFP 레이저 또는 필터를 사용하여 리포터 형광에 초점을 맞춥니다.실험에 사용할 최적의 설정을 결정하기 위한 시작점으로 Venus와 RFP 모두에 대해 50%의 레이저 출력 백분율과 100밀리초의 노출 시간을 입력합니다. 실시간 캡처를 켜고 두 채널 모두에 대해 결과 이미지와 표시된 히스토그램을 검사합니다. 신호가 낮고 이미지를 알아보기 어려운 경우 신호와 이미지가 좋아 보일 때까지 백분율 레이저 출력 및/또는 노출 시간을 점진적으로 증가시킵니다.그런 다음 현미경 소프트웨어에서 Z 스택 모듈을 선택하거나 엽니다. 셀이 더 이상 보이지 않을 때까지 한 방향으로 초점을 조정합니다. 이것을 맨 위 위치로 선택합니다.셀이 다시 더 이상 보이지 않을 때까지 반대 방향으로 초점을 조정하고 이것을 하단 위치로 선택합니다. 최적의 스텝 크기를 선택하고 획득을 시작합니다. 필요한 경우 디스플레이 히스토그램을 조정하여 형광 신호의 시각적 모양을 개선합니다.마지막으로 3차원 렌더링 소프트웨어를 사용하여 3D 이미지를 재구성합니다. 이산화탄소 공급원을 사용할 수 있는 경우 플레이트 홀더 위에 이산화탄소 전달 장치를 놓습니다. 이산화탄소 수준을 5%로 설정하고 소프트웨어 내에서 이산화탄소 컨트롤러를 켭니다.형질주입된 세포의 필드로 이동합니다. RFP 레이저를 사용하여 카메라에서 획득하고 획득 소프트웨어가 컴퓨터 화면에 표시하는 세포의 실시간 이미지를 시각화합니다. 다음으로 RFP 레이저의 백분율 레이저 출력 및 노출 시간에 대한 설정을 입력합니다.그런 다음 YFP 레이저 광의 백분율 레이저 출력 및 노출 시간에 대한 설정을 입력합니다. 플레이트의 각 웰에 대해 리포터를 발현하는 하나 이상의 셀을 포함하는 여러 다른 위치를 선택합니다. 시간 랩의 각 프레임과 취할 총 프레임 수 사이의 시간 간격을 입력합니다.각 위치를 다시 확인하고 필요에 따라 초점을 수정하고 업데이트합니다. 시간 경과를 시작하고 데이터를 저장합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 사용 가능한 이미징 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다.다음은 DNA 손상에 따른 카스파제-2 BiFC의 예입니다. 세포는 토포이소머라제 1억제제인 캄토테신(Camptothecin)으로 처리하였다. 적색 형광 단백질인 mCherry는 세포가 BiFC 프로브를 발현하고 총 세포 수를 시각화하는 데 도움이 된다는 것을 보여주기 위해 리포터로 사용되었습니다.금성 형광은 녹색으로 표시되며 큰 반점은 카스파제-2 유도 근접성을 나타냅니다. 카스파제 활성화 복합체(caspase activation complex)의 세포 내 국소화에 대한 고해상도 시각화를 제공하기 위해 단일 세포를 3차원으로 이미지화할 수 있습니다. 카스파제-2 활성화는 여기에서 녹색으로 표시되고 핵은 빨간색으로 표시됩니다.셀의 직교 슬라이스 보기는 xy 평면, yz 평면 및 xz 평면을 나란히 시각화할 수 있는 위치에 표시됩니다. 3차원 이미지는 셀이 y축을 중심으로 회전하는 동영상에도 표시할 수 있습니다. caspase BiFC 타임 랩스 이미징의 운동 데이터를 제공하기 위해 사용할 수 있습니다.이 동영상은 프로테아좀 억제제인 보르테조밉(Bortezomib)으로 치료한 후 카스파제-2가 녹색으로 활성화되는 모습을 보여줍니다. 미토콘드리아는 빨간색으로 표시됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 caspase BiFC를 사용하여 caspase 활성화 복합체의 어셈블리를 실시간으로 추적하고 복합체가 생성한 크기, 모양 및 지역화를 명확하게 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 프로토콜은 caspase BiFC 실험에 대한 결과를 수집하기 위한 몇 가지 현미경 기반 접근 방식을 간략하게 설명합니다. 그러나 이러한 접근 방식의 여러 변형 및 조합을 사용하여 Caspase 활성화 경로를 창의적으로 조사할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 이 절차를 시도하는 동안 광 독성 및 광 표백과 같은 현미경 검사 유도 인공물의 대조군을 포함하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에는 이를 수행하기 위한 팁이 포함되어 있습니다.사용할 수집 및 분석 방법을 결정하는 것은 탐색할 경계와 계측 및 이미징 소프트웨어의 가용성에 따라 결정됩니다. 이 절차에 따라 이미징 분석 접근 방식을 사용하여 데이터를 해석할 수 있습니다. 시간 경과에 따른 형광 강도의 변화 또는 형광 세포의 비율을 측정할 수 있습니다.초점의 수 또는 물체 크기도 계산할 수 있습니다.

lighting-up-pathways-to-caspase-activation-using-bimolecular

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

단백질의 subcellular 지방화는 세포 신호의 spatio - 시간적 규정을 결정 중요합니다. 여기, 우리는 세포에있는 단백질의 공간적 상호 작용을 모니터링을위한 간단한 방법으로 bimolecular 형광 complementation (BiFC)를 설명합니다.

Bimolecular 형광 Complementation

이 동영상은 단백질과 단백질의 상호작용을 평가하기 위한 BiFC-PALM(광활성화 국소화 현미경과 이분자 형광 보완법의 조합)에 대해 설명합니다. BiFC는 두 개의 형광 단백질 단편과 두 개의 상호 작용하는 관심 단백질의 융합을 포함합니다. 두 단백질이 상호 작용할 때 단편이 근접하게 되어 두 부분이 함께 모여 기능적 형광 단백질을 재구성할 수 있습니다. 단일 형광단의 형광은 PALM에 의해 세포 내부의 단일 분자 수준에서 국한됩니다.

Bimolecular Fluorescence Complementation-Coupled Photoactivated Localization Microscopy

이 비디오는 이분자 형광 보완 리포터 단백질을 사용하여 인간 대식세포에서 카스파아제 단백질의 활성화를 보여줍니다. 카스파제-1의 프로 도메인은 비너스 단백질의 비형광 단편과 융합되며, 이 단백질은 인플라마솜 복합체에 동원됩니다. 인플라마솜의 근접성은 금성 단편의 재접힘과 형광을 유도하여 대식세포에서 카스파아제 활성화를 확인합니다.

Visualization of Caspase Activation in Human Monocyte-Derived Macrophages

여기에 설명된 방법은 anti-apoptotic bacterial effector 단백질의 활성을 해부하기 위해 정의된 단계에서 apoptotic signaling cascade를 유도하는 데 사용됩니다. 이 방법은 또한 pro-apoptotic 또는 독성 단백질의 유도성 발현 또는 다른 신호 경로와의 간섭을 해부하는 데 사용할 수 있습니다.

유도 발현 시스템을 적용하면 세포 내 신호와 세균 독성 요인의 간섭을 연구하기 위해

단백질-단백질 상호 작용은 BiFC(bimolecular fluorescence complementation)와 PALM(photoactivated localization microscopy)을 결합하여 나노미터 공간 해상도로 세포에서 시각화됩니다. 여기에서는 개별 Ras-Raf 복합체의 나노 스케일 클러스터링 및 확산을 시각화하기 위해 U2OS 세포에서 Ras-Raf 상호 작용을 이미징하기 위해 BiFC-PALM을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

이분자 형광 보완과 광 활성화 현지화 현미경 (BiFC-PALM)

카스파 제 활성의 낮은 농도를 포함하는 전체 동물의 건강한 세포를 검출하기 위해, CaspaseTracker 지정된 고감도 바이오 센서 초파리에 대해 생성 하였다. 카스파 따라 바이오 활성 데스 자극의 부재 하에서 최적 조건 하에서 사육 성인 동물의 내부 장기에 걸쳐 긴 수명이 건강한 세포에서 검출된다.

생체 내에서 바이오 센서는 초파리에서 비 세포 사멸 카스파 활동을 추적

Anastasis는 vivo에서 감지 하는 세포 죽음 프로세스를 반대로 세포 형태학 상으로 정상적인 건강 한 세포와 구별할 수 있기 때문에 기술적으로 도전적 이다. 여기 우리는 감지 하 고 우리의 새로 개발 된 vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서 시스템을 사용 하 여 라이브 동물에서 anastasis 받아야 하는 셀 추적에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

Anastasis에서 Vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서에 의해 감지

생체발광-루시퍼라제 효소에 의해 방출되는 광은 소분자 기질인 루시페린-광감각 단백질을 활성화시키기 위해 이용될 수 있고, 이로써 광 자극에 또 다른 차원을 추가하고 시간적 및 공간적 스케일에 걸쳐 세포에서 다수의 광-매개 기능의 조작을 가능하게 한다.

생체 발광 광유전학 2.0 : 생체 발광을 활용하여 체외 및 생체 내에서 광감각 단백질을 활성화 합니다.

이 프로토콜은 인간 혈액 샘플로부터 단핵구 유래 대식세포 (MDM)를 얻는 워크 플로우, 세포 생존력과 행동을 손상시키지 않고 염증성 카스파제 BiFC (BiFC) 리포터를 인간 MDM에 효율적으로 도입하는 간단한 방법, 살아있는 세포에서 염증성 카스파제 활성화를 측정하기위한 이미징 기반 접근법을 설명합니다.

인간 단핵구 유래 대식세포에서 근접성을 유도한 염증성 카스파제의 시각화

이 프로토콜은 시험관 내 및 생체 내 (마우스내) 감염, 무균 손상 및 암 모델 모두에 대한 반응으로 카스파제 활성화(카스파제-1, 카스파제-3, 카스파제-7, 카스파제-8, 카스파제-9 및 카스파제-11)를 평가하여 파이롭토시스, 세포자멸사, 괴사 및 PANoptosis와 같은 세포 사멸 경로의 개시를 결정합니다.

선천면역세포사멸을 평가하기 위한 카스파아제 활성화 평가

본 프로토콜은 유동 세포분석 또는 분광형광계를 사용하여 형광 기질을 통해 카스파아제 활성을 측정하는 두 가지 방법을 설명합니다.

형광 분석 또는 유세포분석을 사용한 카스파제 활성 측정

배우세요 살아있는 세포에서 카스파제 활성화 복합체의 실시간 조립을 시각화하는 이중분자 형광 보완법(BiFC)을 사용하는 방법입니다. 이 기술은 세포사멸 메커니즘 연구에 활용됩니다.

Caspase 활성화 분자 형광 보완성을 사용 하 여 경로를 조명

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