Caspase 활성화 분자 형광 보완성을 사용 하 여 경로를 조명

이 방법론의 전반적인 목표는 이니시에이터 카스파제 활성화의 첫 번째 단계 중 하나를 시각화하는 것입니다. 이 단계를 유도 근접(induced proximity)이라고 하며, 세포사멸(apoptotic cell death) 동안 카스파아제(caspase) 분자가 모여 활성 이량체를 형성할 때 발생합니다. 이 방법은 특정 이니시에이터 카스파제를 언제, 어디서, 얼마나 효율적으로 활성화할 수 있는지와 같은 caspase 필드의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 살아있는 세포에서 카스파제 활성화 복합체의 조립을 실시간으로 시각화할 수 있다는 것입니다. 이 생체 분자 형광 보완 방법은 카스파제에 주입된 티록신 단백질인 금성의 단편을 사용합니다. 파편은 그 자체로는 형광성이 없지만 카스파제가 유도 근접을 겪을 때 두 개의 금성 반쪽이 합쳐져 불이 들어옵니다.

세포를 transfection하려면 먼저 12마이크로리터의 transfection 시약을 멸균 튜브에 있는 750마이크로리터의 환원된 혈청 배지에 추가합니다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 10나노그램의 리포터 플라스미드를 트랜스펙션할 각 웰에 대해 스테릴 1.5밀리리터 튜브에 추가합니다.

각 튜브에 각 caspase BiFC 플라즈마 20나노그램을 추가합니다. 감소된 혈청 매체를 추가하여 각 튜브의 총 부피를 최대 100마이크로리터까지 가져옵니다. P200 피펫을 사용하여 100마이크로리터의 트랜스펙션 시약 용액을 플라스미드 혼합물에 적방울 방식으로 첨가합니다.

플라스미드 형질주입 시약 혼합물을 실온에서 20분 동안 배양한 후, 피펫을 사용하거나 흡입하여 세포에서 배지를 흡인합니다. 그런 다음 P1000 피펫을 사용하여 800마이크로리터의 무혈청 배지를 웰 측면으로 부드럽게 피펫팅합니다. P200 피펫을 사용하여 200마이크로리터의 DNA 지질 복합체를 각 웰에 적가합니다.

조직 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도의 온도에서 3시간 동안 세포를 배양합니다. 배양 후, 흡입을 사용하여 흡인하거나 피펫으로 단층을 파괴하지 않도록 주의하여 DNA 지질 복합체를 포함하는 무혈청 배지를 제거합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 배양하기 전에 2밀리리터의 예열된 완전 성장 배지를 각 웰의 측면으로 부드럽게 피펫팅합니다.

데이터를 수집하기 전에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 caspase 활성화 유도를 수행합니다. 제조업체 지침에 따라 현미경을 켜고 수집 소프트웨어를 실행합니다. 60x 또는 63x 오일 대물렌즈를 선택하고 대물렌즈에 오일 한 방울을 떨어뜨립니다.

그런 다음 올바른 플레이트 홀더를 사용하여 배양 접시를 현미경 스테이지에 놓습니다. 히터를 켜고 온도를 섭씨 37도로 설정하십시오. RFP 레이저 또는 필터를 사용하여 리포터 형광에 초점을 맞춥니다.

실험에 사용할 최적의 설정을 결정하기 위한 시작점으로 Venus와 RFP 모두에 대해 50%의 레이저 출력 백분율과 100밀리초의 노출 시간을 입력합니다. 실시간 캡처를 켜고 두 채널 모두에 대해 결과 이미지와 표시된 히스토그램을 검사합니다. 신호가 낮고 이미지를 알아보기 어려운 경우 신호와 이미지가 좋아 보일 때까지 백분율 레이저 출력 및/또는 노출 시간을 점진적으로 증가시킵니다.

그런 다음 현미경 소프트웨어에서 Z 스택 모듈을 선택하거나 엽니다. 셀이 더 이상 보이지 않을 때까지 한 방향으로 초점을 조정합니다. 이것을 맨 위 위치로 선택합니다.

셀이 다시 더 이상 보이지 않을 때까지 반대 방향으로 초점을 조정하고 이것을 하단 위치로 선택합니다. 최적의 스텝 크기를 선택하고 획득을 시작합니다. 필요한 경우 디스플레이 히스토그램을 조정하여 형광 신호의 시각적 모양을 개선합니다.

마지막으로 3차원 렌더링 소프트웨어를 사용하여 3D 이미지를 재구성합니다. 이산화탄소 공급원을 사용할 수 있는 경우 플레이트 홀더 위에 이산화탄소 전달 장치를 놓습니다. 이산화탄소 수준을 5%로 설정하고 소프트웨어 내에서 이산화탄소 컨트롤러를 켭니다.

형질주입된 세포의 필드로 이동합니다. RFP 레이저를 사용하여 카메라에서 획득하고 획득 소프트웨어가 컴퓨터 화면에 표시하는 세포의 실시간 이미지를 시각화합니다. 다음으로 RFP 레이저의 백분율 레이저 출력 및 노출 시간에 대한 설정을 입력합니다.

그런 다음 YFP 레이저 광의 백분율 레이저 출력 및 노출 시간에 대한 설정을 입력합니다. 플레이트의 각 웰에 대해 리포터를 발현하는 하나 이상의 셀을 포함하는 여러 다른 위치를 선택합니다. 시간 랩의 각 프레임과 취할 총 프레임 수 사이의 시간 간격을 입력합니다.

각 위치를 다시 확인하고 필요에 따라 초점을 수정하고 업데이트합니다. 시간 경과를 시작하고 데이터를 저장합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 사용 가능한 이미징 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다.

다음은 DNA 손상에 따른 카스파제-2 BiFC의 예입니다. 세포는 토포이소머라제 1억제제인 캄토테신(Camptothecin)으로 처리하였다. 적색 형광 단백질인 mCherry는 세포가 BiFC 프로브를 발현하고 총 세포 수를 시각화하는 데 도움이 된다는 것을 보여주기 위해 리포터로 사용되었습니다.

금성 형광은 녹색으로 표시되며 큰 반점은 카스파제-2 유도 근접성을 나타냅니다. 카스파제 활성화 복합체(caspase activation complex)의 세포 내 국소화에 대한 고해상도 시각화를 제공하기 위해 단일 세포를 3차원으로 이미지화할 수 있습니다. 카스파제-2 활성화는 여기에서 녹색으로 표시되고 핵은 빨간색으로 표시됩니다.

셀의 직교 슬라이스 보기는 xy 평면, yz 평면 및 xz 평면을 나란히 시각화할 수 있는 위치에 표시됩니다. 3차원 이미지는 셀이 y축을 중심으로 회전하는 동영상에도 표시할 수 있습니다. caspase BiFC 타임 랩스 이미징의 운동 데이터를 제공하기 위해 사용할 수 있습니다.

이 동영상은 프로테아좀 억제제인 보르테조밉(Bortezomib)으로 치료한 후 카스파제-2가 녹색으로 활성화되는 모습을 보여줍니다. 미토콘드리아는 빨간색으로 표시됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 caspase BiFC를 사용하여 caspase 활성화 복합체의 어셈블리를 실시간으로 추적하고 복합체가 생성한 크기, 모양 및 지역화를 명확하게 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 프로토콜은 caspase BiFC 실험에 대한 결과를 수집하기 위한 몇 가지 현미경 기반 접근 방식을 간략하게 설명합니다. 그러나 이러한 접근 방식의 여러 변형 및 조합을 사용하여 Caspase 활성화 경로를 창의적으로 조사할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 이 절차를 시도하는 동안 광 독성 및 광 표백과 같은 현미경 검사 유도 인공물의 대조군을 포함하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에는 이를 수행하기 위한 팁이 포함되어 있습니다.

사용할 수집 및 분석 방법을 결정하는 것은 탐색할 경계와 계측 및 이미징 소프트웨어의 가용성에 따라 결정됩니다. 이 절차에 따라 이미징 분석 접근 방식을 사용하여 데이터를 해석할 수 있습니다. 시간 경과에 따른 형광 강도의 변화 또는 형광 세포의 비율을 측정할 수 있습니다.

초점의 수 또는 물체 크기도 계산할 수 있습니다.