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지원되는 지질 이중층 또는 SLB가 포함된 흐름 슬라이드를 가져갑니다.
SLB는 형광단으로 표지된 특정 리간드(세포간 접착 분자 1 또는 ICAM-1 및 항-CD3 항체)에 접합됩니다.
T 세포와 형광단 태그가 부착된 항-CD107a Fab(탈과립 마커에 대한 항체의 항원 결합 단편)을 추가합니다.
T 세포 수용체-CD3 또는 TCR-CD3 복합체는 항-CD3 항체에 결합하여 TCR을 유발합니다.
트리거링 유도 인사이드 아웃 신호는 고정된 ICAM-1에 결합하는 표면의 인테그린을 활성화합니다.
접합은 세포골격 재구성(미세소관 재배열 및 SLB 표면에서 세포의 측면 확산을 유도하는 액틴 중합)을 유도합니다.
확산은 더 많은 리간드-수용체 상호 작용을 통해 초분자 활성화 클러스터 또는 SMAC를 형성하여 면역 시냅스를 생성합니다.
T 세포 용해 과립은 미세소관을 따라 이동하고 원형질막과 융합하여 항-CD107a Fab에 결합하는 세포 표면의 탈과립 마커를 노출시킵니다.
형광 현미경을 사용하여 TCR-CD3 복합체, 인테그린 및 탈과립 마커가 풍부한 면역 시냅스를 시각화합니다.
먼저 폴리프로필렌 가위형 집게를 사용하여 유리 커버슬립을 갓 준비한 산성 피라냐 용액에 25-30분 동안 담그십시오. 세탁이 끝나면 세탁할 때마다 신선한 양의 초순수로 커버슬립을 7번 헹구고 젖은 커버슬립을 따로 보관하여 깨끗한 유리에서 남은 물이 굴러떨
어지도록 합니다.커버슬립이 건조되면 멸균 흐름 후드 내의 자체 접착식 슬라이드 채널 중앙에 최종 리포솜 혼합물 2마이크로리터를 정확하게 분취하고, 즉시, 그러나 조심스럽게 깨끗하고 건조한 커버슬립 하나를 슬라이드에 정렬하여 커버슬립이 슬라이드의 끈적끈적한 쪽으로 부드럽게 내려갈 수 있도록 하고, 폴리프로필렌 가위형 집게의 외부 링을 사용하여 주변 접촉부에 부드러운 압력을 가합니다. 슬라이드와 함께 커버슬립을 덮고 누출을 방지하기 위해 슬립이 슬라이드에 단단히 부착되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 슬라이드를 뒤집고 유성 마커를 사용하여 슬라이드 어셈블리 외부의 이중층 주위에 4개의 점을 그립니다.
첫 번째 주입 전에 채널의 한 포트를 진입 포트로, 다른 포트를 출구 포트로 지정하여 실험 내내 이 지정을 유지합니다. 기포 형성을 방지하려면 슬라이드 채널의 고무 씰이 팁에 관통되는 느낌이 들 때까지 피펫 팁의 끝을 입구 포트에 직접 삽입하십시오.
천천히 채널을 50마이크로리터의 따뜻한 분석 완충액으로 채웁니다. 카제인 차단 용액에 200마이크로리터의 염화니켈(II)을 입구 포트에 주입하고 출구 포트에서 50마이크로리터의 완충액을 제거합니다. 45분 배양 후 출구에서 여분의 카제인 용액을 제거합니다.
100마이크로리터의 ICAM-1 및 스트렙타비딘 용액을 입구 포트에 주입하여 실온에서 45분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 출구 포트에서 과도한 단백질 용액을 제거하고 세척당 100마이크로리터의 분석 완충액으로 이중층을 두 번 세척합니다. 그런 다음 실온에서 45분 동안 100마이크로리터의 형광단 접합 항-CD3 항체로 이중층을 표지한 다음 실시된 바와 같이 세척당 100마이크로리터의 분석 완충액으로 2회 세척합니다.
T 세포-이중층 상호작용을 이미지화하려면 전내반사 형광(TIRF) 현미경의 섭씨 37도 가열 스테이지에 슬라이드를 놓고 잉크 마크를 사용하여 스테이지를 조정하여 이중층을 100 배율 대물렌즈 중앙에 배치합니다.
과립 방출 이미징의 경우, 형광 접합 항-CD107a 항체 Fab 단편을 CD4 T 세포 현탁액에 첨가하고, 표지된 세포를 50마이크로리터의 분석 완충액에 재현탁하여 슬라이드 채널의 진입 포트에 주입합니다. 그런 다음 적절한 수의 실험 필드를 선택하고 주입 후 30분 동안 1분에 한 번씩 각 필드의 이미지를 기록합니다.
