Name: 지원되는 지질 이중층에 리간드 나노 클러스터의 배열 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 배우세요 지원된 지질 이중층에 리간드 나노 클러스터를 배열하는 방법을 T세포 활성화 및 부착 연구에 활용하세요. 이 기술은 TIRF 및 RICM 현미경과 호환되어 면역학 및 세포 생물학 연구에 활용됩니다.

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우리는 휴대 전화 응용 프로그램에 대한 유익한 토론을 계속하기위한 로랑 Limozin, 피에르 딜라드와 아스트리드 월합니다. 우리는 또한 SEM 관찰 그의 도움을 PLANETE 클린 룸 시설에서 프레데릭 베두합니다. 이 작품은 부분적으로 허가 번호 307104 FP / 2007년부터 2013년까지 / ERC를 통해 유럽 연구위원회에 의해 투자되었다.

1. 청소 유리 커버 - 슬라이드와 관측 챔버 <ol><li> 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)와 같은 불활성 물질로 이루어진 멀티 슬라이드 트레이 유리 커버 슬라이드 배열. </li><li> 계면 활성제 용액 슬라이드 트레이 및 관찰 챔버 (적합한 석영 큐벳을 세정 추천 어떤 제품)을 담근다. </li><li> (20, 30 ° C 사이)을 실온에서 30 분 동안 활성제 용액을 초음파 욕 울트라 초음파 처리를 사용. </li><li> 초순수로 5 회 (18.2 MΩ.cm, 0.059 μS / cm)을 헹군다. </li><li> (20, 30 ° C 사이의)을 실온에서 30 분 동안 활성제 용액 울트라 초음파 처리. </li><li> 초순수로 10 회를 씻어. </li><li> 반복 두 번 1.5 및 1.6 단계를 반복합니다. </li><li> 최대 1 주일 동안 실온 (20 ° ~ 30 C) 물에 보관할 것. </li></ol> 단백질 나노 점의 2 제작 <ol><li> 구슬의 증착 <ol><li> Deposit 15 °의 경사각으로 유지 (170 μm의 두께를 24 X 24mm) 실리카 비드 (2 % V / V를 70 μL) 은폐 슬라이드 적가의 현탁액. </li><li> 90 °마다 15 초에 의해 유리를 틀지 동안 정지가 약 1 분간 확산 보자. </li><li> 액체가 주위 조건하에 증발 할 수있다. </li><li> 최대 2 일 동안 주위 조건에서 깨끗한 유리 또는 PTFE 실에 보관하십시오. </li></ol></li><li> 알루미늄 증착 <ol><li> 알루미늄 (99 %)에서 약 105 mm의 거리에서 회전 테이블 (RF) 마그네트론 스퍼터링 장치 (8), 무선 주파수 내부 슬라이드 (섹션 2.1에서 제조)를 넣 실리콘 (1 %) 타겟. </li><li> 터보 분자 펌프를 이용하여 2.6 × 10 -4 파에 상기 증착 챔버를 펌프 다운. 이 단계는 가능한 기체 불순물의 제거를 위해 중요하다. </li><li> 0.8 파 (6.6 mTorr 이하)의 압력에서 10 sccm의 유량으로 순수 아르곤 분위기 (5N, 99.999 %)를 소개한다. <br/&gt; 주 : 수신 아르곤 유속은 질량 유량 제어기에 의해 제어되며, 프로세스 압력은 압력 게이지를 사용하여 모니터된다. 아르곤 가스의 유량은 연속적이며, 입구 및 출구 밸브의 개방 사이의 균형에 의해 제어된다. </li><li> RF 전력 생성기에 스위치. 주 : 여기에서, 13.56 MHz의 주파수에서 400 내지 600 W의 고주파 전력의 전형적인 범위를 사용 하였다. 상기 RF 발생기는 용량 성 결합 플라즈마 모드의 매칭 네트워크와 함께 사용된다. 반사 전력을 모니터링하고 네트워크를 이용하여 적응 최소화된다. </li><li> 상기 플라즈마가 안정화 된 후에, 2 분의 타겟 표면에서 가능한 불순물을 제거하기 위해 셔터가 닫힌 상태를 유지하기위한 스퍼터. </li><li> 셔터를 열어 60 분, 200 nm의 두께로 유리 슬라이드에 알루미늄을 증착하기 위해 스퍼터링을 계속 할 수있다. </li><li> 아르곤의 유동을 차단 증착 챔버로부터 터보 분자 펌프를 격리하는 게이트 밸브를 폐쇄하고 깨끗한 N과 벤트 챔버itrogen 방 압력을 얻었다. 알루미늄 코팅 된 슬라이드를 복구. 한 달까지 주변 조건에서 깨끗하고 밀폐 된 유리 또는 PTFE 상자에 대한 보관하십시오. </li></ol></li><li> 유기 실란의 증기 증착 <ol><li> (20, 30 ° C 사이에 50 W, 50 ㎐,) 초음파 조에서 30 초 동안 실온 울트라 초음파 처리에 초순수의 단계 2.2.6에서 제조 한 알루미늄 - 코팅 슬라이드 담근다. </li><li> 건조기의 하단 (3- 아미노 프로필) -triethoxysilane (APTES) 0.5 mL를 입금. 주의 : APTES 쉽게 증발 독성 유기 실란이다. APTES에만 흐름 후드와 장갑으로 취급해야한다. </li><li> 데시 케이 터 내부의 세라믹 그리드와 장소에 (2.3.1 준비) 유리 슬라이드를 넣습니다. </li><li> 멤브레인 펌프에 연결하고, 데시 케이 터를 30 분은 저 진공을 발생하기위한 최대 전력에서 실행. </li><li> 데시 케이 터의 밸브를 닫고 펌프를 끕니다. </li><li> 데시 케이 터를 가열1 시간 동안 50 ° C이다. </li><li> 데시 케이 터를 열고 슬라이드를 수집합니다. </li><li> 실온에서 최대 48 시간 (20 ~ 30 ° C)에 대한 저장을 위해 다른 청정 건조기로 옮긴다. </li></ol></li><li> 단백질의 제 1 층의 증착 - 비오틴으로 표지 소 혈청 알부민 (BSA 비오틴) <ol><li> PTFE를 지원에 2.3에서 제조 된 슬라이드 중 하나를 놓습니다. </li><li> 인산 완충 식염수 (PBS)에 용해 된 25 ㎍ / ㎖의 BSA 비오틴 기탁 한 용액. 실온 (20 내지 30 °의 C)에서 30 분 동안 남겨. </li><li> PBS로 10 회를 씻어. 멀리 광원에서 4 ° C에서 최대 24 시간 동안 샘플을 저장합니다. </li></ol></li><li> 알루미늄 마스크를 제거하여 <ol><li> 상온 (20 ° C 내지 30)의 위에 박 (pH≈12을 수득 약 100 ㎖의 PBS에 1 M NaOH를 적가하여 제조) PBS 중의 NaOH의 용액에 슬라이드를 인큐베이션. 주의. NaOH를 부식 및 장갑을 사용하여 처리해야한다. </li><li> 헹구기초순수의 10 배. </li></ol></li></ol> 지원되는 지질 이중층 3. 증착 (SLB) <ol><li> 랭 뮤어 통을 청소 <ol><li> 펌프를 사용하여 랭 뮤어 통의 PTFE 인클로저에서 물을 제거합니다. </li><li> 클로로포름에 적신 보풀이없는 부직포 일회용 수건으로 닦으십시오. 주의. 클로로포름 독성 및 (또는 유동 후드) 마스크를 적절한 장갑, 통풍이 잘되는 곳에서 조작되어야한다. </li><li> 미지근한 초순수 (40 ~ 50 °의 C)와 4 번 면도. </li><li> 차가운 초순수 청소 적어도 6 회. </li></ol></li><li> 제 지방층 증착 <ol><li> 랭 뮤어 통의 PTFE 인클로저 PTFE 트레이를 배치 한 후, 초순수로 채운다. </li><li> 0 mN의 / m로 측정 된 압력을 설정 랭 뮤어 장치의 제어 소프트웨어를 사용한다. </li><li> (1 ㎎ / ㎖ 지질 용액 30 μL를 증착하는 제 1 기밀 유리 / 금속 주사기를 사용하여물 표면에 2 dioleoyl- SN -glycero -3- 포스 포 클로로포름 (DOPC)). 클로로포름을 증발 지질 분자가 자발적으로 단층을 형성한다. </li><li> 도달 (DOPC 27 mN의 / m)을 원하는 압력까지 PTFE 배리어를 폐쇄함으로써 지질 단층을 압축하는 제어 소프트웨어를 사용한다. </li><li> 전동 클램프를 사용하여 PTFE 인클로저에 섹션 2.5.2에서 제조 된 유리 슬라이드를 찍어 제어 소프트웨어를 사용한다. </li><li> 수직 한 공기 - 물 계면에, 상기 클램프에 슬라이드를 잡아. / m에서 27 mN의 일정 압력을 유지하면서, 인터페이스를 통해 천천히 (15mm / 분)을 올리는 제어 소프트웨어를 사용한다. </li><li> 실온에서 최대 24 시간 (20 ° 내지 30 C) 중 하나를 즉시 사용 또는 저장을 위해 건조한 장소. </li></ol></li><li> 제 지방층 증착 <ol><li> / m 27 Mn의 목표 값에 랭 뮤어 통의 표면 압력을 유지한다. 를 사용하여 압축랭 뮤어 장치 및 / 또는 제어 소프트웨어가 원하는 압력을 달성하기 위해, 지질 소량의 추가. </li><li> 가로 물의 표면 섹션 3.2.6에서 제조 지질 단층을 운반하는 유리 슬라이드를 놓는다. 각 슬라이드는 PTFE 트레이 위에 떠있는 것을 확인. </li><li> 아래 유리 슬라이드를 넣거나, 이들은 물에 침지되도록 PTFE 또는 금속 핀셋을 사용하여 해당 PTFE 트레이에 한 번에 하나 개의 슬라이드. 누른 상태에서 슬라이드를 기울 마십시오. </li><li> 초순수는 슬라이드가 공기에 노출되지 않도록 만드는 가득 정석으로 슬라이드를 포함하는 PTFE 트레이를 전송하는 PTFE 또는 금속 핀셋을 사용합니다. </li><li> 관찰 챔버 내로, 이중층 코팅 된 유리 슬라이드를 수중 작업하는 동안, 전송 PTFE 또는 금속 핀셋을 사용한다. 주 : 관찰 챔버는 결정 화기 내부에 물 아래에 배치됩니다. 관찰 챔버는 맞춤 제작 및 고무 가스켓기로와 PTFE 고리로 구성되는그 저면 이전 지질 이중층 코팅 유리 슬라이드로 만들어진다 수밀 챔버를 만들기 위해 수중 조립 될 수 D 스틸 케이스. </li><li> 물 속에 계속 작업 물 1 ㎖를 상기 챔버 내부에 포획되는 것을 보장하면서도 상기 챔버를 닫는다. </li><li> 물에서 조립 된 챔버를 가져 가라. 그것은 방수 및 누수가 없는지 확인합니다. </li><li> 추가 및 PBS 10 배의 500 μL를 제거하여 PBS로 관찰 챔버 내의 초순수 존재하는 1 mL로 대체. 챔버는 액체의 결코 찾아 볼 수없는 있는지 확인하십시오. </li></ol></li><li> SLB 차단 단계 <ol><li> 섹션 3.3.6에서 제조 한 슬라이드를 포함하는 관찰 챔버 내에 소 혈청 알부민 100 ㎍ / ㎖ (BSA)를 도입하고, 실온에서 30 분 (20 ° 내지 30 C) 배양한다. </li><li> 제거하고 PBS 10 배의 500 μL를 첨가하여 이중층 린스. 이중층은 4 ℃에서 24 시간 동안 유지 될 수있다. </li></ol></li></ol> 리간드 4. 기능화 <ol><li> 20 및 30 ℃ 사이의 실온에서 30 분 동안 섹션 3.4.2에서 제조 된 슬라이드 (함유하는 챔버로 2 ㎍ / ㎖의에 형광 비 형광 비딘을 (NAV 아비딘의 탈글 라이코 실화 된 버전의 pH를 7로 충전되지 않은) 추가 기음). </li><li> 첨가하고 10 배 PBS 500 μL를 제거하여 씻어. </li><li> 섹션 3.4.2에서 제조 한 슬라이드를 포함하는 챔버에 2 ㎍ / ㎖의 비오틴 화 항에 CD3 추가. SLB와 도트의 이중 작용 들어, (여기서, 이중층는 니트릴 로트리 아세트산 (NTA) 지질의 + 1 % DOPC 이루어진다) 5 ㎍ / mL로하는 FC-ICAM1 그의 태그를 추가한다. 실온에서 30 분 (20 ° 내지 30 C) 떠난다. </li><li> 10 회를 추가하고 PBS의 500 μL를 제거하여 헹구어 </li><li> 10 배 첨가하여 세포 배지 500 μL를 제거하여 세포 매체와 PBS (PBS + 0.1 % BSA)을 대체. </li><li> chambe에서 세포 매체의 200 μL를 남겨슬라이드와 r에. </li><li> 세포를 첨가하기 전에 37 ℃에서 10 분 동안 실을 놓는다. </li></ol> 5. 셀 증착 (자세한 내용은 문헌 7 참조) <ol><li> 조심스럽게 챔버에 세포 현탁액 400 μL 증착. 37 ° C에서 30 분 동안 세포를 인큐베이션. </li><li> 37 ° C에서 15 분 동안 2 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 세포를 고정. 반복 제거하고 PBS 500 μL를 첨가하여 PBS와 함께 PFA를 교체합니다. </li></ol> 6. 관측 <ol><li> Proteo-지질 나노 패턴 및 SLB 유동성 <ol><li> BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 등 여기서, EX TBP 483 + 564 + 642 (적절한 조명 파장 (639 ㎚) 및 필터 큐브를 사용하여 이미지를 에피 형광 모드의 단백질 패턴을 형광 현미경을 사용하여 688). 주 : 신호의 강도는 내부 도트 외부 단백질의 양을 추정하기 위해 정량화 될 수있다. 적절한 조명 파장 (330 ㎚) 및 F를 사용하여이미지 ilter 큐브 어두운 구멍 밝다 이중층 (BP 12분의 365, FT (395), LP (397)). </li><li> 이중층의 트레이서 지질의 확산 상수를 측정하기 위해 연속 포토 블리치 (CPB)의 기술 (13), (15)를 사용한다. 이러한 결과는 바람직하게는 단지 SLB 증착 후에 이루어진다. 주 : 확산 상수를 정량화하기 위해, 두 개의 매개 변수가 CPB 공정 동안 측정된다 : 염료 (긴장) 및 표백 영역 (tauD) 주위에 형성된 할로 형광 프로파일의 붕괴 길이의 비 표백 시간. 첫번째는 CPB 공정 동안 조명 된 영역의 중심에서 형광 강도의 시간 변화를 플로팅함으로써 얻어진다. 두 번째는 (정상 상태에 도달 한 후 12 개 라인 5 개 이미지에 걸쳐 평균화)을 조사 영역의 에지의 강도 프로파일을 플로팅함으로써 얻어진다. 곡선은 팽팽하고 tauD을 얻었다 장착된다. 확산 상수 TA 주어진다UD 2 / 긴장된 (D = <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55060/55060eq1.jpg" /> ). </li></ol></li></ol>

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<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+integrin+binding+to+Arg-Gly-Asp+peptide+activates+actin+polymerization+and+contractile+movement+that+stimulates+outward+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).</li>
</ol>

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전술 한 프로토콜 내에서 중요한 단계는 지원 지질 이중층에 의해 단백질 나노 점 또는 점 주위 공간의 백 필러의 형성에 관련이있다. 단백질 나노 도트에 대한 제 1 임계 단계 비드 마스크의 제조 방법이다. 커버 슬라이드의 청소가 중요합니다. 슬라이드 중 하나, 또는 산소 플라즈마로 석영 큐벳을 청소 추천 된 세제를 청소해야합니다. 에탄올 또는 이소프로판올의 치료와 같은 다른 침지 세정 기술을 충분히 친수성 유리 렌더링하지 않으며, 따라서 큰 따르면 비드 단층의 형성을 지원하지 않는다. 동시에, 상기 슬라이드 표면은 랭 뮤어 브로 젯트 법을 적용하는 7, 15, 16에 의해 SLB의 형성 이후의 공정과 호환 될 필요가있다. 그 다음 중요한 단계는 증착 및 제거입니다luminum. 성막은 스퍼터링 기술을 통해이면 여기에 보인 바와 같이, 타겟 (1 %의) 실리콘을 ...

<html> 세포 유착은 세포 외 기질 또는 다른 셀에 그들의 상대에 결합 할 수있는 세포막에 존재하는 전문 세포 부착 분자 (CAM들) 단백질을 통해 일어난다. 접착 된 세포에 편재하는 인테그린과 카데 포함한 대부분의 접착 분자, 클러스터 (1)의 형태로 제공된다. 항원 제시 세포와 T 림프구 (T 세포)의 작용 (장갑차)이 두 셀 사이의 인터페이스에서 형성 수용체 클러스터의 중요성은 특히 현저한 설명을 제공한다 - 종종 면역 시냅스했다. cSMAC (큰 중앙 초분자 클러스터를 형성하도록 플랫폼 (2), (3, 4)에게 시그널링 역할을하고, 최종적으로 집중되는 T 세포 형태 마이크론 스케일 클러스터의 표면상의 APC, T 세포 수용체 (TCR도)와 제 접촉을 형성하면 )아가씨 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 5, 6, 7. 최근는 APC 측 것을 도시하고, TCR의 리간드는 또한 8 클러스터된다. 은 APC가 중요한 단백질 기능화 인공 표면에 의해 모방된다 T 세포 APC 상호 작용, 하이브리드 시스템의 배치의 상황에서, 시냅스 인터페이스 2, 3, 4, 5, 6, 7에 대한 이해를 전진 크게했다 . 이러한 맥락에서, 상기 타겟 셀의 하나 이상의 양상을 포착 APC 모방 표면을 설계하는 것이 매우 적합하다. 리간드가 지원되는 지질 이중층에 이식하는 경우 예를 들어, 그들은 이중층의 평면 확산은 APC 표면에 상황을 모방하고 동시에의 형성을 허용 할 수 있습니다cSMAC 6,7. 마찬가지로, APC의 클러스터는 중합체 9, 10, 11, 12, 13, 14의 바다 섬 리간드를 모방하여 생성되었다. 그러나 이러한 두 가지 기능은 지금까지 결합되지 않았다. 여기에서는 확산 지질과 지질 이중층으로 둘러싸인 항 CD3 (TCR의 복합체를 표적 항체)의 나노 도트를 생성하는 신규 한 기술을 설명한다. 이중층은 랭 뮤어 - 블로 젯 / 랭 뮤어 쉐퍼 기술 7, 15, 16을 이용하여 증착되고, 필요하다면, 특정 단백질로 작용 화 될 수있다 - 예를 들면, T 세포의 인테그린의 리간드 (ICAM1 불림). 또한, 항 CD3 단백질 도트를 기LD는 다른 항체 또는 CAM으로 대체 될 수있다. 우리는 T 세포 접착 연구를위한 플랫폼으로 향후 사용을 위해 단백질을 선택하고 있지만, 여기에 설명 된 전략은 어떤 ​​단백질과도 DNA에 대해 적용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>유리 커버 슬립</td><td>보조, Karl Hecht KG&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>관찰</td>실 <td>집에서 만든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>알칼리성 계면활성제 농축액 (Hellmanex)</td><td>Hella Analytics</td><td>9-307-011-4-507</td><td></td></tr><tr><td>초음파처리기</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Labbox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>결정화기&nbsp;</td><td>Shott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutravidine</td><td>Thermo Fischer Scientifique</td><td>84607</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>워터 MQ&nbsp;</td><td>ELGA, 베올리아 프랑스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실리카 비드</td><td>Corpuscular Inc</td><td>147114-10</td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>시그마-알드리치</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>BSA-비오틴</td><td>시그마-알드리치</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Dansyl-PE</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>810330C</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Sigma-aldrich</td><td>650471</td><td></td></tr><tr><td>기밀 주사기&nbsp;</td><td>Dominique Dustcher, 프랑스</td><td>74453</td><td></td></tr><tr><td>필름 밸런스</td><td>NIMA</td><td>중간</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Zeiss, 독일</td><td>TIRF-III 시스템</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 타겟&nbsp;</td><td>Kurt J. Lesker Compagny, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>무선 주파수 마그네트론 스퍼터링 시스템 &egrave; 나&nbsp;</td>프랑스 <td></td><td></td><td>ALCATEL의 SMC 600 공구 수정</td></tr></tbody></table>

지원되는 지질 이중층에 리간드 나노 클러스터의 배열

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

현재 세포 생물학 연구를위한 패시베이션 표면의 바다에서 접착 단백질 섬의 순서 배열을 만드는 상당한 관심이있다. 지난 몇 년 동안, 그것은 살아있는 세포가 그들에게 제시 분자의 생화학 적 특성뿐만 아니라 이러한 분자가 제시하는 방식뿐만 아니라, 응답하는 것이 점점 명백 해졌다. 많은 생물학 실험실에서 이제 표준 그러므로 단백질 마이크로 패턴입니다 생성하는 단계; 나노 패턴은 더 액세스 할 수 있습니다. 그러나, 세포 - 세포 상호 작용의 맥락에서, 패턴에 필요뿐만 아니라 단백질뿐만 아니라 지질 이중층이있다. 이러한 이중 proteo - 지질 패턴은 지금까지 쉽게 접근 할 수 없었다. 우리는 유리에 지원되는 단백질 나노 도트를 만들고 지원되는 지질 이중층 (SLB)로 간 점 공간을 백필하는 방법을 제안 할 수있는 손쉬운 방법을 제공합니다. 트레이서의 사진에서 형광 표백 지질이 포함 SLB, 우리는 이중층의 PL-상당한 나타냄을 입증메탄을 유동성. 형광 그룹과 단백질 점을 기능화하는 이미지 그들과 그들이 정기적 육각형 격자에 정렬 것을 보여주기 위해 우리를 할 수 있습니다. 일반적인 도트 크기가 약 800 ㎚이며 여기 입증 간격은 2 마이크론이다. 이들 기판은 세포 부착, 이동 및 메카 감지 연구를위한 유용한 플랫폼을 제공 할 것으로 예상된다.

형광 이미지는 도트의 간격과 크기를 측정하기 위하여 분석되었다. 전형적인 간격은였다 1,900 ± 80 nm의 전형적인 도트 크기 600 ± 100 nm의 (도 1g)였다. 간격은 마스크에 사용되는 구슬의 크기에 의해 설정된다. 도트 크기가 비드 크기뿐만 아니라, 증착 조건에 의해 설정된다. SLB는 SLB 촬상 채널에서 볼 구멍 및 NAV 촬상 채널에서 보이는 점 사이의 완벽한 상호 보완하여, 그들 고유 단백질 점 주위 아니라 (도 2)에 증착된다. 연속 사진 표백 데이터 분석 패터닝 이중층의 지질 유체 남아 5 μm² / 초 (도 3)의 전형적인 확산 상수를 갖는다는 것을 알 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55060/55060fig1.jpg" /> 도 1...

우리는 유체 지질 이중층에 둘러싸여 나노 단백질 패치 유리를 기능화하는 프로토콜을 제시한다. 이 기판은 첨단 광학 현미경과 호환 및 세포 부착 및 이동 연구를위한 플랫폼 역할을 할 것으로 예상된다.

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

이 기술의 전반적인 목표는 세포 생물학 응용을 위한 고감도 표면 현미경 기술과 호환되는 지지 지질 이중층 내에 단백질 나노 클러스터 배열을 제작하는 것입니다. 이 방법은 세포 생물 물리학 분야의 핵심 질문, 특히 리간드의 나노 클러스터링이 T 세포의 활성화 및 접착에 어떤 영향을 미치는지에 대한 답을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 표준 생물 물리학 실험실에서 쉽게 재현 가능하다는 점과 TIRF 및 RICM과 같은 최첨단 표면 민감 현미경 기술과 호환된다는 점입니다.이 기술은 면역학에 대한 통찰을 제공하기 위해 설계되었지만, 세포 생물학, 종양학 및 조직 공학 분야의 잠재적 응용 분야를 가진 다른 세포 유형에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 유리 커버 슬라이드와 관찰 챔버를 세척하십시오. 그런 다음, 15도 경사로 유지된 커버 슬라이드 위에 2% silica bead 현탁액 70 µL를 한 방울씩 떨어뜨리십시오.현탁액이 마르는 동안 1분 동안 15초마다 유리를 90도씩 회전시킵니다. 비드의 조밀한 단일층을 형성하고 다층 구조나 오일 클러스터의 생성을 방지하는 것이 매우 중요합니다. 따라서 비드 용액의 농도와 부피, 그리고 슬라이드의 친수성을 최적화해야 합니다.액체가 증발한 후, 슬라이드를 알루미늄 실리콘 타겟에서 105 millimeters 떨어진 회전 테이블 위에 있는 고주파 마그네트론 스퍼터링 장치 내부에 놓습니다. 그 다음, 터보 분자 펌프를 사용하여 증착 챔버 내의 압력을 2.6 × 10⁻⁴ pascals로 낮춥니다. 10 standard cubic centimeters per minute의 유량과 0.8 pascals의 압력으로 순수 아르곤 분위기를 조성합니다.다음으로, 고주파 전원 발생기를 켭니다. 플라스마가 안정화되면 셔터를 닫은 상태에서 2분 동안 스퍼터링하여 타겟 표면의 불순물을 제거합니다. 셔터를 열고 60분 동안 스퍼터링을 계속하여 슬라이드 위에 200-nanometer 두께의 알루미늄 층을 증착합니다.그런 다음 아르곤 흐름을 차단합니다. 게이트 밸브를 닫아 터보 분자 펌프를 증착 챔버로부터 분리합니다. 그 후, 깨끗한 질소를 사용하여 챔버를 벤트하여 상압 상태로 만듭니다.챔버에서 알루미늄 코팅 슬라이드를 꺼냅니다. 회수한 슬라이드를 상온의 초순수에 담그고 50 watts, 50 hertz에서 30초 동안 초음파 처리합니다.

ligand-nano-cluster-arrays-in-a-supported-lipid-bilayer

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오는 지질 이중층으로 코팅된 미세구에서 셉틴 단백질 어셈블리를 연구하는 기술을 설명합니다. 이 기술은 곡면에 있는 단백질의 곡률 의존적 어셈블리를 이해하는 데 도움이 됩니다.

Spherical Supported Lipid Bilayer Assay: 마이크로스피어에서 Septin 어셈블리를 관찰하는 기술

지원되는 지질 이중층과 천연 막 입자는 세포막의 특성을 근사 할 수 있고 분석 다양한 전략에 통합 될 편리한 시스템이다. 여기에서 우리는 지원 지질 이중층 코팅 된 SiO2로 비즈, 인지질 막 소포 또는 천연 입자로 구성된 마이크로 어레이를 제조하는 방법을 보여준다.

스퀴지 기반의 조립 방법과 생체막 마이크로 어레이의 형성

우리는 코어에 자체 조립 나노 구조를 포함하는 지질 입자의 운동 안정화를 위한 탄소 나노튜브의 스마트 응용에 대해 보고합니다. 지질 입자의 준비에는 약물 전달과 같은 생물 의학 응용 분야에 사용할 수 있는 다소 낮은 농도의 탄소 나노튜브가 필요합니다.

탄소 나노 튜브에 의해 안정화 내부 자기 조립 된 지질 입자의 용이 한 제조

우리는 보유, 수송 지질 이중층 형성 시스템을 보여준다. 냉동 막 전구체는 상온 상태로 전환하면 지질 이중층 막을 80 % 성공률 1 시간 내에 형성 될 수있다. 이 시스템은 이온 채널과 관련된 힘드는 과정과 전문​​ 지식을 줄일 수 있습니다.

폴리 디메틸 실록산 박막을 사용하여 자동화 지질 이중층 제막

많은 단백질이 막 표면에 부착될 때 기능을 수행합니다. 나노 디스크 막에 대한 외인성 단백질의 결합은 투과 전자 현미경에 의해 간접적으로 이미지화될 수 있습니다. 우리는 음성 염색 인산 텅스텐 산 나트륨에 의해 유도 된 나노 디스크의 특징적인 적층 (rouleau)이 외인 단백질의 결합에 의해 방지된다는 것을 보여줍니다.

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

이 프로토콜은 거대한 유니라멜라 지질 소포와 함께 글라이딩 키네신 운동성을 사용하여 지질 나노튜브 네트워크를 제조하는 과정을 기술한다.

글라이딩 키네신 운동성 분석을 이용한 다성분 지질 나노튜브 네트워크 제작

우리는 구리 (II) 2,9,16,23 테트라 - 테르트 - 부틸 -29H,31H -phthalocyanine (CuPc) 분자와 지질 이중 층을 도핑하여 물 / 공기 인터페이스에서 하이브리드 지질 막을 생산하기위한 프로토콜을보고합니다. 그 결과 하이브리드 지질 막에는 지질/CuPc/지질 샌드위치 구조가 있습니다. 이 프로토콜은 또한 다른 기능성 나노 물질의 형성에 적용될 수 있다.

물/공기 인터페이스에서 소수성 유기 분자와 함께 도핑 하이브리드 지질 막의 자체 조립

이 프로토콜은 유니 지질 및 다중 지질 소포, 지원지질 이중층 및 일시 중단 된 지질 이중 층을 모방 하는 세포의 형성을 설명 합니다. 이러한 체외 모델은 다양한 지질 유형을 통합하도록 조정할 수 있으며 다양한 분자 및 거대 분자 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

지질 단층은 수십 년 동안 구조 연구를 위한 2차원(2D) 단백질 결정을 형성하는 기초로 사용되어 왔습니다. 그들은 공기 물 인터페이스에서 안정적이며 전자 이미징을위한 얇은 지지 재료로 작용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 생물학 연구를 위한 지질 단층을 준비하는 에 입증된 단계를 제시합니다.

전자 결정학 연구를 위한 지질 단층 방법을 이용한 샘플 준비

여기서, 나노바 담지 지질 이중층 시스템은 시험관 내에서 곡률 감지 능력을 가진 단백질의 특성 분석을 가능하게 하는 정의된 곡률을 갖는 합성 막을 제공하기 위해 개발된다.

시험관 내 막 곡률 감지 단백질 연구를 위한 나노바 지원 지질 이중층 시스템

여기에서는 인공 지질막에서 높은 시공간 정밀도로 광 조절 및 가역성 단백질 패턴을 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법은 청색광 아래에서 파트너 단백질 Nano(야생형 SspB)에 결합하는 모델 멤브레인에 고정된 단백질 iLID(Improved Light-Inducible Dimer)의 국부적인 광활성화로 구성됩니다.

모델 멤브레인에서의 Dynamic light-induced protein pattern

배우세요 지원된 지질 이중층에 리간드 나노 클러스터를 배열하는 방법을 T세포 활성화 및 부착 연구에 활용하세요. 이 기술은 TIRF 및 RICM 현미경과 호환되어 면역학 및 세포 생물학 연구에 활용됩니다.

지원되는 지질 이중층에 리간드 나노 클러스터의 배열

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