지원되는 지질 이중층에 리간드 나노 클러스터의 배열

이 기술의 전반적인 목표는 세포 생물학 응용을 위한 과민한 표면 현미경 검사법 기술과 호환이 되는 지원한 지질 이중층에 있는 단백질 nano 송이의 배열을 날조하기 위한 것입니다. 이 방법은 세포 생물 물리학 분야의 주요 질문, 특히 리간드의 나노 클러스터링이 T 세포 활성화 및 접착에 미치는 영향에 대한 답변에 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 표준 생물물리학 실험실에서 쉽게 재현할 수 있고 TIRF 및 RICM과 같은 고급 표면 민감성 현미경 기술과 호환된다는 것입니다.

이 기술은 면역학에 대한 통찰력을 제공하도록 설계되었지만 세포 생물학, 종양학 및 조직 공학에 잠재적으로 응용될 수 있는 다른 세포 유형에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 유리 덮개 슬라이드와 관찰실을 청소합니다. 그런 다음 70마이크로리터의 2%실리카 비드 현탁액을 15도 경사로 유지되는 덮개 슬라이드에 한 방울씩 떨어뜨립니다.

서스펜션이 건조되는 동안 1분 동안 15초마다 유리를 90도로 뒤집습니다. 촘촘하게 채워진 비드 단층을 만들고 다층 및 오일 클러스터의 형성을 피하는 것이 중요합니다. 그렇기 때문에 비드 용액의 농도와 부피, 슬라이드의 친수성을 최적화해야 합니다.

액체가 증발한 후 무선 주파수 마그나트론 스퍼터링 장치 내부의 슬라이드를 알루미늄 실리콘 타겟에서 105mm 떨어진 회전 테이블에 놓습니다. 그런 다음 터보 분자 펌프를 사용하여 증착 챔버의 압력을 2.6 곱하기 10으로 음의 4 파스칼로 줄입니다. 분당 10 표준 입방 센티미터의 플럭스와 0.8 파스칼의 압력을 가진 순수한 아르곤 대기를 도입합니다.

그런 다음 무선 주파수 발전기를 켭니다. 플라즈마가 안정화된 후 셔터를 닫은 상태에서 2분 동안 스퍼터링하여 대상 표면에서 가능한 불순물을 제거합니다. 셔터를 열고 스퍼터링이 60분 동안 계속되어 슬라이드에 200나노미터 두께의 알루미늄 층이 증착되도록 합니다.

그런 다음 아르곤의 흐름을 끊습니다. 게이트 밸브를 닫아 터보 분자 펌프를 증착 챔버에서 분리합니다. 그런 다음 깨끗한 질소로 챔버를 환기시켜 주변 압력에 도달합니다.

챔버에서 알루미늄 코팅 슬라이드를 회수합니다. 회수된 슬라이드를 실온의 초순수에 담그고 50와트 및 50헤르츠에서 30초 동안 초음파화합니다. 다음으로, 0.5밀리미터의 APTES를 데시케이터 바닥에 증착합니다.

유리 슬라이드를 세라믹 격자에 놓습니다. 그리드를 데시케이터에 놓습니다. 데시케이터를 멤브레인 펌프에 연결합니다.

그런 다음 펌프를 최대 출력으로 30분 동안 작동하여 저진공을 생성합니다. 데시케이터의 밸브를 닫고 펌프를 끕니다. 섭씨 50도까지 1시간 동안 가열합니다.

그런 다음 데시케이터를 열고 슬라이드를 수집합니다. 수집된 슬라이드를 PTFE 지지대에 놓습니다. PBS에 용해된 밀리리터당 25마이크로그램의 비오틴 2밀리리터를 증착합니다.

슬라이드를 실온에서 30분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 PBS로 10회 헹굽니다. 슬라이드를 수산화나트륨과 PBS 용액에 넣고 실온에서 밤새 배양합니다.

그런 다음 슬라이드를 초순수로 10회 헹굽니다. Langmuir 트로프를 청소한 후 PTFE 트레이를 트로프의 PTFE 인클로저에 놓습니다. 그런 다음 초순수로 채우십시오.

측정된 압력을 미터당 0밀리뉴턴으로 설정합니다. 기밀 유리 금속 주사기를 사용하여 밀리미터 당 1밀리그램 DOPC와 클로로포름 용액 30마이크로리터를 물 표면에 침전합니다. 지질 단층을 압축하기 위해 원하는 압력인 미터당 27밀리뉴턴에 도달할 때까지 PTFE 장벽을 닫습니다.

그런 다음 전동 클램프를 사용하여 준비된 유리 슬라이드를 PTFE 인클로저에 담그십시오. cl에 슬라이드를 잡습니다.amp 공기-물 인터페이스에 수직입니다. 분당 15mm의 속도로 인터페이스를 통해 슬라이드를 올리면서 미터당 27밀리뉴턴의 일정한 압력을 유지합니다.

그런 다음 유리 슬라이드를 PTFE 트레이 위의 물 표면에 수평으로 놓습니다. 그런 다음 금속 핀셋을 사용하여 슬라이드를 PTFE 트레이에 밀어 넣고 초순수에 담그십시오. 핀셋을 사용하여 슬라이드가 들어 있는 PTFE 트레이를 초순수로 채워진 결정화기로 옮깁니다.

코팅된 슬라이드를 수중에서 관찰실로 옮깁니다. 그런 다음 챔버를 닫고 약 1ml의 물이 내부에 갇히도록 합니다. 또 다른 섬세한 단계는 수중에서 시료 챔버를 조립하는 것입니다.

그리고 증착 된 이중층의 공기와의 접촉을 절대적으로 피해야하므로이를 보장하기 위해 많은 양의 물을 사용하고 전체 조립 공정이 수중에서 발생할 수 있도록해야합니다. 조립된 챔버를 물에서 제거하고 챔버가 방수되고 누출이 없는지 확인하십시오. PBS 500마이크로리터를 추가한 다음 챔버에서 500마이크로리터의 액체를 제거합니다.

이 과정을 10회 반복하여 챔버에 있는 1ml의 초순수를 PBS로 완전히 교체합니다. 다음으로, 밀리리터당 100마이크로그램의 소 혈청 알부민을 관찰실에 도입합니다. 실온에서 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 챔버에서 500 마이크로 리터를 제거하고 추가하여 이중층을 10 번 헹굽니다. 그런 다음 리간드로 기능화하고, 세포를 증착하고, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단백질지질 나노패턴과 SLB 유동성을 관찰합니다. 이 프로토콜에서 비드 마스크는 알루미늄의 제어된 증착에 의해 2차 금속 마스크를 만드는 데 사용됩니다.

그런 다음 비드 마스크가 제거되고 구멍이 있는 알루미늄 층이 남습니다. 다음으로, APTES라고 하는 유기 아미노 실린이 증기상에 증착된 후 수성상에서 BSA-비오틴이 증착됩니다. 그런 다음 알루미늄을 제거하여 나노 단백질 패치를 드러냅니다.

마지막으로, inter-dot 공간은 지지된 지질 이중층으로 다시 채워집니다. 그런 다음 나노 점과 지지된 지질 이중층을 Epiflourescence 이미지로 촬영합니다. 합성 이미지는 단백질 점 주위에 고유하게 증착된 지질 이중층과의 완벽한 상보성을 보여주지만, 그 위에는 그렇지 않습니다.

새로 증착된 지지된 지질 이중층의 상형광 이미지에서 단백질 점은 밝은 지질의 바다에서 어두운 점으로 나타납니다. 그러나 50초 동안 연속 광표백을 한 후 이미지는 자기장 다이어프램으로 구분된 영역 내부에 후광을 보여 지질이 이동성을 나타냅니다. 자기장 다이어프램의 가장자리를 따라 평균 강도 프로파일을 분석하고 표백 과정에서 시간이 지남에 따라 이 강도가 감소하는 것을 보면 확산 상수가 초당 5마이크로미터 제곱임을 알 수 있습니다.

이 기술은 제대로 수행되면 이틀 안에 완료할 수 있습니다. 알루미늄 증착 중에 매우 깨끗한 상태를 유지하고 증착 곡선을 신중하게 보정하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 패턴화된 슬라이드를 추가로 기능화할 수 있습니다.

예를 들어, 이중층에 다른 생체 분자를 추가함으로써. 우리는 T 세포 활성화를 연구하기 위해 항원 식물을 먹는 세포를 모방하기 위해 이것을 사용합니다. 따라서 개발 후 이 기술은 다양한 청중의 관심을 끌 것입니다.

예를 들어, 조직 엔지니어는 인공 조직을 성장시키기 위한 골격으로 이를 사용할 수 있으며, 종양 전문의는 이를 암세포 추가에 대한 근본적인 질문을 제기하기 위한 플랫폼으로 사용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후 고급 현미경 기술과 호환되는 지원되는 지질 이중층에서 단백질 나노 클러스터 영역을 제조하는 방법을 잘 이해해야 합니다. 우리는 이것을 T 세포를 연구하는 데 사용하지만, 이 기질이 통제된 패턴 단백질지질막과 모든 종류의 세포의 상호 작용을 연구하기 위해 선택되는 플랫폼이 될 가능성이 있다고 믿습니다.