제브라피시 유충의 곰팡이 감염을 정량화하는 기술

후뇌실에 곰팡이 포자를 주입한 제브라피쉬 유충을 예로 들어 보겠습니다.

대식세포는 주사 부위로 모집되어 포자 주위에 촘촘한 클러스터를 형성합니다.

포자는 대식세포에 의해 식세포 삼켜집니다.

이 포자는 식체 내부의 분해에 저항하는 능력을 가지고 있어 균사로 발아하고 대식세포의 괴사성 세포 사멸을 유도할 수 있습니다.

균사는 표면에 노출된 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)을 가지고 있습니다.

감염 부위에 모집된 호중구는 PAMP를 인식하고 결합합니다. 호중구와의 접촉은 균사에서 복잡한 과분지 표현형을 유발하여 호중구에 의한 삼키는 것을 방해하고 면역 회피를 촉진합니다.

유충을 균질화하여 생존 가능한 곰팡이 포자와 균사를 방출합니다. 원심분리하여 세포 파편을 제거하고 상청액을 성장 배지에 도금합니다.

배양 시 곰팡이 식민지 형성 단위 또는 CFU를 계산합니다.

CFU 수는 숙주 면역 방어를 회피한 생존 가능한 곰팡이 포자의 수를 나타냅니다.

주사 직후 유충 8마리를 개별 1.7밀리리터 튜브에 옮기고 안락사시킵니다. 암피실린과 카나마이신이 포함된 PBS 1밀리리터를 준비합니다. 유충이 있는 튜브에서 가능한 한 많은 액체를 제거하십시오. 그런 다음 90마이크로리터의 PBS를 항생제와 함께 첨가합니다.

조직 용해기에서 6분 동안 분당 1,800회 진동으로 유충을 균질화합니다. 그런 다음 30초 동안 17,000배 g으로 회전시킵니다. 균질화된 현탁액을 각 튜브에서 라벨이 붙은 GMM 플레이트의 중앙으로 피펫팅하고 일회용 L자형 스프레더를 사용하여 림에 퍼지지 않도록 주의하면서 퍼뜨립니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 거꾸로 2-3일 동안 배양합니다. 그런 다음 형성된 식민지의 수를 세