Candida tropicalis Biofilm에 대한 항체의 효과를 평가하기 위한 체외 분석

곰팡이 칸디다 트로피칼리스가 들어 있는 마이크로플레이트를 가져 가십시오.

세포는 Msb2라고 하는 막관통 당단백질을 절단하여 억제 도메인을 제거하는 단백질 분해 효소인 Sap2를 분비합니다.

이것은 곰팡이가 바닥에 달라붙어 효모와 사상체 형태의 마이크로 콜로니로 자라도록 유도합니다. 세포는 가용성 성분과 생체 고분자를 분비하여 생물막 형성을 시작합니다.

Sap2 특이적 항체가 포함된 혈청 샘플을 선택한 웰에 추가하고 어두운 곳에서 배양합니다.

항체는 Sap2에 결합하여 활성을 중화하여 세포 생존력과 생물막 성숙을 방해합니다.

처리되지 않은 우물에서 생물막은 세포와 세포외 기질의 조밀한 네트워크로 성숙합니다.

액체를 흡인하고 생물막을 세척한 다음 플레이트를 자연 건조시킵니다. 발색 기질을 추가하고 어둠 속에서 배양합니다.

막 결합 산화환원효소를 이용하는 생존 세포는 기질을 유색 제품으로 환원시킵니다.

유색 상청액을 옮기고 흡광도를 읽습니다.

혈청 처리 우물에서 낮은 흡광도는 항체 매개 생물막 억제를 나타냅니다.

멸균 RPMI1640 MOPS 배지에서 열 비활성화 혈청 샘플의 연속 희석액을 준비합니다. 선택된 혈청 희석액 100마이크로리터를 96웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 첨가합니다.

10열에서 곰팡이 전용 양성 대조군에 대해 RPMI1640-MOPS 배지만 추가합니다. 컬럼 11의 모든 웰에 1-50 희석액의 혈청을 첨가하여 무진균 플러스 혈청 음성 대조군 역할을 합니다. 접시를 뚜껑과 알루미늄 호일로 덮은 후 접시를 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다.

다음날 다중 채널 피펫을 사용하여 세럼을 조심스럽게 흡인한 후 거꾸로 된 플레이트를 가볍게 두드려 잔여 세럼을 제거합니다. PBS 세척을 3회 반복하고 플레이트를 생물학적 안전 캐비닛 내부에서 실온에서 30분 동안 자연 건조시켜 과도한 PBS를 건조시킵니다.

그런 다음 필터 멸균된 젖산 링거 50밀리리터에 XTT 25mg을 녹입니다. 별도의 튜브에 10밀리리터를 분취합니다. 알루미늄 호일로 덮고 영하 80도에서 보관하십시오. 다음으로, 메나디온 8.6mg을 아세톤 5ml에 녹이고 50마이크로리터를 100개의 개별 마이크로튜브에 분배한 후 분취량을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

XTT 10밀리리터를 취하고 메나디온 1마이크로리터를 첨가하여 1마이크로몰 작동 용액을 얻습니다. 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰당 100마이크로리터의 XTT 메나디온 용액을 추가합니다. 다음으로 접시를 뚜껑과 알루미늄 호일로 덮은 후 어둠 속에서 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 마지막으로, 각 웰에서 80마이크로리터의 유색 상청액을 신선한 96웰 플레이트로 옮기고 플레이트를 490나노미터에서 판독합니다.