면역 복합체를 사용한 수지상 세포 활성화에 대한 유세포 분석 기반 분석

화학적으로 고정된 종양 세포 현탁액으로 시작합니다.

종양 세포 표면 항원에 결합하여 면역 복합체 또는 IC를 형성하는 종양 결합 면역글로불린 G의 최적 농도를 추가합니다.

IC를 부착된 수지상 세포가 포함된 배양 플레이트로 옮깁니다. 인큐베이트.

수지상 세포는 IC를 인식하고 내재화하여 펩타이드 단편으로 처리합니다.

단편은 주요 조직적합성 복합체 클래스 II 또는 MHC-II 분자에 로드되고 공동자극 분자 CD86과 함께 세포 표면에 제시됩니다.

미디어를 제거합니다. 세포 해리 완충액을 추가하고 세게 피펫팅하여 세포를 분리합니다.

세포를 튜브로 옮깁니다.

세포를 원심분리하고 차단 용액에 재현탁하여 비특이적 상호 작용을 차단합니다.

MHC-II 및 CD86을 표적으로 하는 형광단 표지 항체 칵테일과 오버레이합니다.

DNA 결합 염료를 첨가하고 잠시 배양하여 죽은 세포 핵을 염색합니다.

유세포 분석을 사용하여 MHC-II와 CD86을 공동 발현하는 살아있는 세포를 식별하여 IC 매개 수지상 세포 활성화를 확인합니다.

먼저, 실온에서 10분 동안 1.8% 완충된 파라포름알데히드에 세포를 고정합니다. U자형 96웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액을 시드합니다. 다음으로, 각 웰에 종양 결합 항체의 다양한 희석액을 추가합니다. 그 후, 세포를 얼음 위에서 15-20분 동안 배양합니다.

배양 후, 150마이크로리터의 인산염 완충 식염수로 세포를 세척한 다음 섭씨 4도에서 5-10분 동안 400배g 으로 원심분리합니다. 원심분리 후 상청액을 배출하고 세포를 두 번 세척합니다. 형광단 접합 2차 항체를 포함하는 100마이크로리터의 FACS 완충액에 세포를 용해시킵니다. 다음으로, 접시를 얼음 위에서 15-20분 동안 배양합니다.

15-20분 후, 200마이크로리터의 FACS 완충액을 첨가하여 세포를 세척합니다. 플레이트를 400배 g에서 5-10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 디캔팅합니다. 유세포 분석을 수행하여 종양 결합을 분석하고 세포를 코팅하는 데 필요한 면역글로불린 G의 최소 농도를 결정합니다.

세포가 최소 면역글로불린 G 농도로 코팅되면 CFSE 표지 종양 면역 복합체를 단핵구 유래 수지상 세포에 1:5 비율로 첨가합니다. 그런 다음 혼합물을 완전한 배지에서 밤새 12-16시간 동안 배양합니다. 단핵구 유래 수지상 세포 활성화의 FACS 분석을 수행합니다.