Name: 분화 한 인간 단핵구 유래 대식세포에서 세포 외 트랩 방출의 시험관 내 자극 및 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 배우세요 분화된 인간 단핵구 유래 대식세포에서 세포 외 트랩 방출을 자극하고 형광 현미경으로 시각화하는 방법을. 1차 인간 세포를 사용하여 생리학적 관련성이 높은 염증 반응 연구 모델을 제공합니다.

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이 작품은 영구 충격 보조금 (IPAP201601422)과 노보 노디스크 재단 생물 의학 프로젝트 보조금 (NNF17OC0028990)에 의해 지원되었다. YZ는 또한 시드니 대학에서 호주 대학원 상을 수상한 것을 인정합니다. 우리는 단핵구 격리 및 조직 문화에 도움을 주셔서 씨 팻 피산사라킷과 모건 존스 씨에게 감사드립니다.

HMDM은 시드니 지역 보건 지구의 윤리 승인을 받아 혈액 은행이 제공하는 인간 버피 코트 제제에서 분리되었습니다.
1. HMDM 문화
<ol><li>림프구를 분리하기 위해 시판되는 제제를 사용하여 건강한 인간 기증자의 말초 혈액으로부터 제조된 버피 코트 제제로부터 단핵구를 분리하고, 이어서 역전류 원심용해19, 20.</li>
	<li>단핵구 특성화에 대한 변형 된 Giemsa 얼룩으로 세포 방사 및 염색에 의한 단핵구의 존재를확인19.</li>
	<li>멸균 조건에서 혈청 없이 RPMI-1640 매질로 단핵구밀도를 1 x 106 셀/mL로 조정합니다. 이 세포 현탁액의 1 mL를 12웰 조직 배양 판의 각각의 웰에 첨가한다. 37°C에서 세포 인큐베이터에서 배양하여 5%CO2의 존재에 대해 2시간 동안 조직 배양판에 대한 순응을 촉진한다.</li>
	<li>멸균 조건하에서, 세포 매체를 제거하고 10% (v/v) 풀링된 인간 혈청 및 20 mM L-글루타민을 포함하는 완전한 RPMI-1640 배양 매체로 대체한다.</li>
	<li>세포 인큐베이터에서 5%CO2의 존재 하고 37°C에서 세포를 8일 동안 배양하고, 2일마다 배지를 변경한다.</li>
</ol>2. HMDM의 양극화
<ol><li>멸균 조건하에서, 완전한 RPMI-1640 배양 배지에 인터페론 γ(IFNγ; 20 ng/mL) 및 리포폴리사카라이드(LPS; 1 μg/mL)를 첨가하여 M1 프라이밍 배지를 제조한다. 완전한 RPMI-1640 배양 배지에 인터류키틴 4(IL-4; 20 ng/mL)를 추가하여 M2 프라이밍 미디어를 준비한다.</li>
	<li>멸균 조건 하에서, HMDM을 함유하는 조직 배양 플레이트 웰로부터의 배지는 섹션 1에 기재된 바와 같이 시드 및 배양되었다.</li>
	<li>멸균 PBS(37°C로 미리 데운 것)로 세포를 함유하는 웰을 1 mL 의 PBS 를 사용하여 조심스럽게 세척합니다.</li>
	<li>HMDM을 포함하는 각 웰에 M1 또는 M2 프라이밍 미디어의 1mL를 추가합니다(실험에 적합한 중 하나).</li>
	<li>세포 인큐베이터에서 5%CO2의 존재에서 37°C에서 48시간 동안 세포를 배양한다.</li>
</ol>3. MET 방출을 유도하는 HMDM의 자극
<ol><li>멸균 조건하에서, 완전한 RPMI-1640 배지에 MET 방출의 상이한 자극기(실험에 적합한 것)를 포함하는 배양 배지를 준비한다: PMA (25 nM), 인간 재조합 TNFα (25 ng/mL), 또는 인간 재조합 IL-8(50 ng/mL) ).</li>
	<li>HOCl 자극을 가진 실험을 위해, 세포에 첨가하기 직전에 HBSS(37°C로 미리 데운 것)에서 HOCl(200 μM)을 준비한다. HOCl이 완전한 셀 매체에 준비되지 않았는지 확인합니다. 참고: HOCl의 스톡 용액의 농도는 용액의 UV 흡광도를 292 nm 및 pH=116에서 측정하고 350M-1cm-121의소멸 계수를 사용하여 정량화된다.</li>
	<li>섹션 2에 기재된 편광 처리 후, 각 웰로부터 세포 매체를 흡인하고 1 mL aliquots로 세포를 조심스럽게 세척합니다: 멸균 PBS(PMA, TNFα 및 IL-8용) 또는 HBSS(HOCl용)는 37°C로 미리 예열되었습니다.</li>
	<li>PMA, TNFα 또는 IL-8을 실험하는 경우: 최종 세척 단계에서 PBS를 제거한 후 PMA, TNFα 또는 IL-8을 포함하는 전체 매체의 1 mL을 첨가한다.</li>
	<li>TNFα를 사용하여 실험하기 위해, 세포 인큐베이터에서 5%CO2가 존재하면서 37°C에서 6시간 동안 세포를 배양한다. PMA 및 IL-8을 사용하여 실험하기 위해, 세포 인큐베이터에서 5%CO2가 존재하면서 37°C에서 24시간 동안 세포를 배양한다.</li>
	<li>
HOCl을 가진 실험은, 마지막 세척 단계에서 HBSS를 제거한 후에 HBSS에 HOCl의 1 mL를 추가합니다. 이어서, 세포 인큐베이터에서 5%CO2의 존재 에서 37°C에서 15분 동안 세포를 배양한다.
	<ol>
<li>조심스럽게 세포 상류를 흡인하고 단계 3.3에 기재된 바와 같이 HBSS의 1 mL aliquots로 세포를 3x 세척한다.</li>
		<li>최종 세척 단계에서 HBSS를 제거한 후, 완전한 RPMI-1640 배양 배지의 1 mL을 추가합니다. 이어서, 세포 인큐베이터에서 5%CO2의 존재 에서 37°C에서 24시간 동안 세포를 배양한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 살아있는 세포 배양에서 MET의 시각화
<ol><li>40 μM의 농도로 HBSS에서 SYTOX 녹색 염료를 준비합니다.</li>
	<li>MET 방출을 유도하기 위해 섹션 3에 기재된 처리의 끝에서, HMDM을 함유하는 각 웰에 염료의 25 μL을 직접 첨가한다.</li>
	<li>실온(RT)에서 5분 동안 암흑에서 세포를 배양한다.</li>
	<li>HMDM을 이미징용 반전형광현미경의 현미경 단계에 조직 배양 우물에 놓습니다.</li>
	<li>
현미경 절차
	<ol>
<li>고해상도 컬러 디지털 카메라로 설치된 광스펙트럼 형광광원, 브라이트필드 광원 및 반전현미경을 켭니다(재료 표참조).</li>
		<li>필터 휠을 녹색 형광에 대한 "넘버 2" 위치(여기 = 504 nm, 방출 = 523 nm)로 회전하여 조직 배양 웰 내에 함유된 녹색 스테인드 샘플의 이미징을 위해.</li>
		<li>5x 목표를 사용하여 거친 초점으로 이미지를 초점을 맞춘 다음 현미경 접안 렌즈를 통해 볼 때 이미지가 선명하고 선명하고 초점이 맞춰지도록 현미경의 미세 초점 노브를 표시합니다.</li>
		<li>현미경을 카메라 모드로 전환합니다.</li>
		<li>연결된 소프트웨어를 시작합니다.</li>
		<li>소프트웨어에서 캡처 탭을 선택합니다.</li>
		<li>재생 버튼을 클릭하여 이미지를 미리 보고 이미지가 소프트웨어 미리 보기 창에 선명하고 선명하고 초점이 맞물때까지 현미경의 미세 초점 노브를 조정합니다.</li>
		<li>캡처 버튼을 클릭합니다. 참고: 캡처된 이미지가 함께 제공되는 소프트웨어에 자동으로 표시됩니다.</li>
		<li>소프트웨어 내에서 파일 | 필요한 이미지 파일 유형으로 저장합니다.</li>
		<li>현미경에서 필터 휠을 "숫자 5" 위치로 회전하여 밝은 시야 이미징을 하고 4.5.2-4.5.9 단계를 반복하여 해당 브라이트필드 이미지를 얻습니다.</li>
		<li>후속 이미지 수집에 필요한 경우 4.5.2-4.5.10 단계를 반복합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin%2C+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639(2009).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+suicide%3A+why+neutrophils+die+to+make+NETs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li>
<li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li>
<li>Keshari, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+induced+neutrophil+extracellular+traps+formation%3A+implication+for+the+inflammatory+disease+condition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition.</a> PLoS One. 7 (10), 48111(2012).</li>
<li>Rayner, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+hypochlorous+acid+%28HOCl%29+and+other+inflammatory+mediators+in+the+induction+of+macrophage+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).</li>
<li>Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traps+and+hyperinflammation+-+new+ways+that+neutrophils+promote+or+hinder+survival%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Traps and hyperinflammation - new ways that neutrophils promote or hinder survival.</a> British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).</li>
<li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidylarginine+deiminase+inhibition+reduces+vascular+damage+and+modulates+innate+immune+responses+in+murine+models+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis.</a> Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).</li>
<li>Megens, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+luminal+neutrophil+extracellular+traps+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis.</a> Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).</li>
<li>Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Footprints+of+neutrophil+extracellular+traps+as+predictors+of+cardiovascular+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).</li>
<li>Goldmann, O., Medina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expanding+world+of+extracellular+traps%3A+not+only+neutrophils+but+much+more%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more.</a> Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).</li>
<li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+traps+and+macrophages%3A+new+roles+for+the+versatile+phagocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).</li>
<li>Pertiwi, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+traps+derived+from+macrophages%2C+mast+cells%2C+eosinophils+and+neutrophils+are+generated+in+a+time-dependent+manner+during+atherothrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis.</a> Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).</li>
<li>Okubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+extracellular+trap+formation+promoted+by+platelet+activation+is+a+key+mediator+of+rhabdomyolysis-induced+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury.</a> Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).</li>
<li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+NET+or+not+to+NET%3Acurrent+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li>
<li>Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Extracellular+Traps%3A+A+Scoping+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innate+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review.</a> Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).</li>
<li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5 (1), 8668(2010).</li>
<li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+not+men%3A+differences+between+mouse+and+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li>
<li>Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycation+of+low-density+lipoprotein+results+in+the+time-dependent+accumulation+of+cholesteryl+esters+and+apolipoprotein+B-100+protein+in+primary+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages.</a> FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).</li>
<li>Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+macrophage-mediated+oxidation+of+low-density+lipoprotein+is+delayed+and+independant+of+superoxide+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production.</a> Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).</li>
<li>Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acid+ionization+constant+of+HOCl+from+5+%C2%B0C+to+35+%C2%B0C%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Phyical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The acid ionization constant of HOCl from 5 °C to 35 °C.</a> Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).</li>
<li>Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pivotal+role+for+NF-kappaB+in+the+macrophage+inflammatory+response+to+the+myeloperoxidase+oxidant+hypothiocyanous+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).</li>
<li>Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase+associated+with+neutrophil+extracellular+traps+is+active+and+mediates+bacterial+killing+in+the+presence+of+hydrogen+peroxide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide.</a> Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

M1 분화된 HMDMs를 이용한 MET 형성의 생성 및 시각화는 이러한 대식세포 구조의 잠재적인 병리학적 역할을 조사하는 데 유용할 수 있는 새로운 시험관 내 모델을 나타내며, 특히 만성 염증성 하에서 조건. 그것은 또한 인간 단핵구 또는 뮤린 대식세포 세포주를 가진 관련 연구 결과에서 이용될 수 있는 MET를 풀어 주기 위하여 1 차적인 인간 대식세포의 자극을 위한 강력한 프로토콜을 제공합니다. HMDM에 의한 MET 형성의 자극을 위한 이 프로토콜의 성공적인 구현은 양호한 세포 생존력을 유지하기 위해 신중한 세포 배양 및 취급에 의존한다. 이렇게 하면 관찰되는 MET의 범위와 품질이 향상됩니다. 더 나은 세포 영양을 제공하기 위해, HMDM을 유지하는 데 사용되는 RPMI 매체는 태아 소 혈청뿐만 아니라 L-글루타민을 포함하는 인간 혈청을 포함해야합니다. 이 완전한 RPMI 미디어의 각 재고 솔루션은 1주일 이내에 사용해야 합니다. 미디어의 올바른 저장도 중요합니다. 매체는 빛이 없는 경우 4°C에서 보관해야 한다.
...

호중구에서 ETs의 방출은 세균성 감염에 의해 시작되는 선천적인 면역 반응으로 처음 확인되었습니다1. 그(것)들은 항균 특성을 가진 각종 과립 단백질이 호중구 엘라스타아제 및 골수페록시다아제2를포함하여 결합되는 DNA 백본으로 이루어져 있습니다. 호중구 ETs (NETs)의 주요 역할은 병원체를 포착하고 그들의 제거를 촉진하는것입니다 3. 그러나, 면역 방어에 있는 ETs의 보호 역할 이외에, 연구 결과의 증가는 또한 질병 병인에 있는 역할을, 특히 염증 구동한 질병의 발달 도중 발견했습니다 (즉, 류마치스성 관절염 및 죽상 동맥 경화증4). ETs의 방출은 인터류킨 8 (IL-8) 및 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)5,6,및 국부적 인 축적을 포함한 다양한 염증성 사이토카인에 의해 유발될 수 있으며, ET의 국소축적은 조직 손상을 증가시키고 불러일으키고 프로 염증 반응7. 예를 들어, ETs는 동맥경화증8의발달에 인과적 역할을 하는 것으로, 혈전증9를촉진하고, 심혈관위험도 10을예측하는 것으로 연루되어 왔다.
이제 호중구 이외에, 다른 면역 세포(즉, 비만 세포, 호산구, 및 대식세포)가 미생물 또는 프로-염증 자극에 노출될 때 ET를 방출할 수 있다는 것을 인식하고있다 11,12. 이것은 만성 염증성 질병의 발달, 규칙 및 해결에 있는 그들의 중요한 역할을 고려하여 대식세포의 경우에 특히 중요할 지도 모릅니다. 따라서 대식세포에서 ET 방출과 염증 관련 질병 개발 사이의 잠재적 인 관계를 더 잘 이해하는 것이 중요합니다. 최근 연구는 그대로 인간의 죽상 경화성 플라크와 조직 혈전13에METs와 NETs의 존재를 보여 주었다. 유사하게, MET는 선동적인 반응의 규정을 통해 신장 상해를 운전에 연루되었습니다14. 그러나, 호중구와는 달리, 대식세포로부터의 MET 형성 메커니즘에 대한 제한된 데이터가 있다. MET 형성의 인간 체외 모델을 이용한 최근 연구는 각 세포 유형에 관여하는 경로에 약간의 차이를 보여준다 (즉, 대식세포와 히스톤 시트룰린의 부재에 관한)6. 그러나, 일부는 NET 방출이 히스톤 시트룰린(15)의부재에서 발생할 수 있음을 보여 주었다.
이 프로토콜의 전반적인 목표는 임상적으로 관련된 대식세포 모델에서 MET 방출을 평가하는 간단하고 직접적인 방법을 제공하는 것입니다. METs(즉, THP-1 인간 단핵구 세포주 및 다양한 뮤린 대식세포 세포주)를 연구하기 위해 사용되어 온 여러 가지 시험관내 대식세포 세포 모델이있다 16. 이러한 모델과 관련된 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, THP-1 단핵구를 대식세포로 분화시키는 것은 일반적으로 단백질 키나아제 C(PKC) 의존적 경로를 활성화시키는 포르볼 마이스테이트 아세테이트(PMA)의 첨가와 같은 프라이밍 단계를 필요로 한다. 이 과정은 ET 방출4를 트리거하는 것으로 알려져 있으며 THP-1 세포로부터 낮은 기저 MET 방출을 초래한다. 다른 연구는 PMA 처리 된 THP-1세포17에비해 생체 내에서 대식세포에 의해 장착 된 생체 활성 및 염증 반응의 몇 가지 차이점을 강조했다.
유사하게, 상이한 뮤린 대식세포유사 세포주들의 거동및 염증반응은 1차 인간 대식세포의 반응 스펙트럼을 완전히 나타내지않는다(18). 따라서, 임상 적 설정에서 대식세포 ET 형성을 조사하기 위한 목적으로, 1차 인간 단핵구 유래 대식세포(HMDMs)는 단낭 또는 무린 대식세포 유사 세포주보다는 보다 관련성이 있는 모델로 여겨진다.
M1 편광 HMDMs로부터의 ET 방출은 골수페록시다아제 유래 산화하이포염소산(HOCl), PMA, TNFα 및 IL-86을포함하는 다수의 상이한 염증 자극에 이들 세포를 노출시킨 후 입증되었다. 여기서 설명된 프로토콜은 HMDM을 M1 표현형으로 편광시키고 이러한 염증 자극에 노출될 때 후속 MET 방출을 시각화하는 프로토콜이다. PMA는 호중구를 사용한 이전 연구와의 비교를 용이하게 하기 위해 MET 방출의 자극으로 사용됩니다. 중요하게도, HOCl, IL-8, 및 TNFα는 또한 생체 내에서 염증 환경의 더 나은 모델로 여겨지는 MET 방출을 자극하는데 사용된다. ET 방출의 가시화를 위한 현미경 방법은 SYTOX 녹색을 사용하여 살아있는 세포 배양에 있는 세포외 DNA를 염색하는 관련시킵니다, 이전 호중구 연구 결과에서 성공적으로 적용된 불투과성 형광 녹색 핵산 얼룩. 이 방법은 ET 방출의 신속하고 질적 평가를 허용하지만 ET 방출 범위의 정량화를 위한 독립형 방법으로는 적절하지 않다. 다른 처리 조건 또는 내정간섭에서 유래한 ET 방출의 넓이비교하기 위하여 정량화가 요구되는 경우에 대체 방법론을 이용되어야 합니다.

<table><tbody><tr><td>120Q 광역 스펙트럼 형광 광원</td><td>EXFO Photonic Solutions, 토론토, 캐나다</td><td></td><td>x-cite 시리즈</td></tr><tr><td>Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3336</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa)</td><td>Polysciences Inc.</td><td>24606</td><td>단핵구의 특성화</td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt solution (HBSS)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14025050</td><td>세척 단계 및 HOCl 처리용</td></tr><tr><td>차아염소산(HOCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>MET 자극용</td></tr><tr><td>인터페론 감마</td><td>Thermo-Fisher</td><td>PMC4031</td><td>M1 프라이밍용</td></tr><tr><td>인터루킨 4</td><td>Integrated Sciences</td><td>rhil-4</td><td>M2 프라이밍용</td></tr><tr><td>인터루킨 8</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-943</td><td>MET 자극용</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59202C</td><td>배양 배지에 추가</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide</td><td>Integrated Sciences</td><td>tlrl-eblps</td><td>M1 프라이밍용</td></tr><tr><td>림프hoprep</td><td>Axis-Shield PoC</td><td>AS 1114544</td><td>단핵구 분리용</td></tr><tr><td>Olympus IX71 반전 현미경</td><td>올림푸스, 도쿄, 일본</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12- 미리 스테이트 13- 아세테이트 (PMA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P8139</td><td>MET 자극</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D5652</td><td>세척 단계</td></tr><tr><td>RPMI-1640 매체</td><td>시그마-알드리치</td><td>R8758</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>SYTOX 그린</td><td>라이프 테크놀로지</td><td>S7020</td><td>MET의 경우 visulaization</td></tr><tr><td>TH4-200 명시야 광원</td><td>올림푸스, 도쿄, 일본</td><td></td><td>x-cite 시리즈</td></tr><tr><td>종양 괴사 인자 알파</td><td>Lonza</td><td>300-01A-50</td><td>MET 자극</td></tr></tbody></table>

분화 한 인간 단핵구 유래 대식세포에서 세포 외 트랩 방출의 시험관 내 자극 및 시각화

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

호중구에 의한 세포외 트랩(ETs)의 방출은 만성 염증과 관련된 질병의 발병에 기여하는 요인으로 확인되었습니다. 호중구 ETs (NETs)는 DNA, 히스톤 단백질 및 다양한 과립 단백질 (즉, 골수 페록시다제, 엘라스타아제 및 카테신 G)의 메쉬로 구성됩니다. 대 식 세포를 포함 하 여 다른 면역 세포, 또한 ETs를 생산할 수 있습니다.; 그러나, 이것이 생체 내에서 어느 정도 발생하고 대식세포 외 트랩(METs)이 병리학적 메커니즘에서 역할을 하는지 여부는 구체적으로 조사되지 않았다. 염증성 병리학에서 MET의 역할을 더 잘 이해하기 위해, 면역 형광 실험에서 악용될 수 있는 시험관 내 1차 인간 대식세포로부터 MET 방출을 시각화하기 위한 프로토콜이 개발되었습니다. 이것은 이 구조물의 추가 특성화 및 호중구에서 풀어 놓인 ETs에 그들의 비교를 허용합니다. 인간 단핵구 유래 대식세포(HMDM)는 M1 프로-염증 표현형에 대한 분화 후 상이한 염증 자극에 노출시 MET를 생성한다. MET의 방출은 살아있는 세포 (예를 들어, SYTOX 녹색)에 불침투되는 녹색 형광 핵산 얼룩을 사용하여 현미경 검사법에 의해 가시화 될 수 있습니다. HMDM과 같은 갓 분리된 1차 대식세포의 사용은 잠재적인 임상 적용과 관련된 생체 내 염증 성 이벤트를 모델링하는 데 유리합니다. 이 프로토콜은 또한 인간 단핵구 세포주(예를 들어, THP-1)로부터의 MET 방출을 연구하기 위해 포르볼 마이리스테이트 아세테이트 또는 다른 대식세포 세포주(예를 들어, 뮤린 대식세포-유사 J774A.1 세포)를 이용한 대식세포로의 분화에 사용될 수 있다.

세포 분화에 대한 자극에 반응하여 HMDM의 형태학적 변화를 보여주는 브라이트필드 이미지는 도 1에나타내고 있다. IFNγ 및 LPS에 노출된 HMDM을 사용하여 실험에서 M1 편광 대식세포는 도 1(중간 패널)의 검은 화살표에 의해 나타난 바와 같이 길쭉하고 스핀들 같은 세포 형상을 보였다. 비교를 위해, 48h에 대한 HMDM에 HMDM을 노출한 후 M2 편광 대식세포의 형태는 도 1(맨 오른쪽 패널)의 검은 화살표에 의해 지시된 바와 같이 전형적으로 둥글고 평평하였다.
MET를 방출하는 분화된 HMDM 표현형의 능력은 그림 2에제시된 바와 같이 SYTOX 녹색을 가진 살아있는 세포 형광 화상 진찰에 의해 구상되었다. 도 2A는...

여기에 제시된 프로토콜은 현미경 및 형광 염색을 사용하여 살아있는 세포 배양에서 대식세포 외 트랩(MET) 생산을 검출하는 프로토콜이다. 이 프로토콜은 면역형광 염색에 의해 특정 MET 단백질 마커를 검사하기 위해 더 확장될 수 있다.

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

호중구 및 기타 면역 세포에 의한 세포 외 트랩의 방출은 타고난 면역에서 중요하지만 염증 성 병리학과 강하게 연결됩니다. 이 세포는 선동적인 반응에 있는 중요한 역할을 하기 때문에 아주 작은 대식세포에 있는 이 프로세스에 관하여 알려져 있습니다. 이 프로토콜은 대식세포 세포 외 트랩 또는 마스트 릴리스의 기본 인간 체외 모델을 제공합니다.그것은 생체 내에서이 구조의 잠재적인 생리적 성장을 연구 하는 우리에 대 한 모델을 제공 합니다. 이 기술의 주요 장점은 이 프로토콜의 세포가 인간 버피 코트 제제로부터 분리된 1차 세포라는 것입니다. 단핵구를 대식세포로 분화하는 데 필요한 프라이밍 단계는 없으며, 이는 THP-1 세포주와 같은 다른 단세포 세포주와 대조된다.이 프로토콜은 분리된 호중구 및 microglia를 포함하여 그밖 면역 세포에 쉽게 적응됩니다. 대식세포에 의해 생성된 세포외 트랩은 매우 깨지기 쉽기 때문에 스테인드 트랩의 무결성을 보존하기 위해 단계 사이에 주의를 기울여야 합니다. 멸균 조건하에서, 완전한 RPMI-1640 배양 배지, 인터페론 감마를 밀리리터당 20 나노그램의 농도로, 밀리리터당 1마이크로그램의 농도에 첨가하여 M1 프라이밍 배지를 준비한다.밀리리터당 20나노그램의 농도에 완전한 RPMI-1640 배양 매체에 인터류신 4를 추가하여 M2 프라이밍 미디어를 준비한다. 멸균 조건하에서, HMDM을 포함하는 종자 및 배양 조직 배양 플레이트 우물에서 흡인 매체. 각 우물에 조심스럽게 추가, 멸균 PBS의 1 밀리리터는 섭씨 37도에 미리 따뜻하게.PBS 버퍼를 제거하고 두 번 더 세척합니다. HMDM을 포함하는 각 웰에 M1 또는 M2 프라이밍 미디어의 밀리리터 1밀리리터를 추가합니다. 세포 인큐베이터에 이산화탄소 5%가 있는 경우 섭씨 37도에서 48시간 동안 세포를 배양합니다.멸균 조건하에서, 완전한 RPMI-1640 미디어에 MET 방출의 다른 자극기를 포함하는 배양 매체를 준비합니다. 저혈당 자극실험을 위해, 37°C까지 예온된 HBSS를 가진 팔콘 튜브에 200개의 미세몰라 저혈당산을 준비하십시오. 편광 처리 후, 각 우물에서 세포 매체를 흡습하고 PMA, TNF 알파, 인터류키인 8 자극 또는 HBSS에 대한 멸균 PBS 중 하나의 밀리리터 알리쿼트로 세포를 세 번 세척하여 고압산 자극을 한다.최종 세척 단계에서 PBS를 제거한 후 PMA, TNF 알파 또는 인터류빈 8을 포함하는 완전한 미디어의 1 밀리리터를 추가합니다. TNF 알파 자극을 위해 6시간 동안 세포 인큐베이터에서 37도 및 5%의 이산화탄소를 배양하고 PMA 또는 인터류키 8 자극을 위해 24시간 동안 세포를 배양합니다. 고염소산을 실험하기 위해, 마지막 세척 단계에서 HBSS를 제거한 후, 갓 준비된 하이포클로산 1밀리리터를 추가합니다.그런 다음 세포 인큐베이터에 5 %의 이산화탄소가있는 경우 섭씨 37도에서 15 분 동안 세포를 배양합니다. 그 후, 조심스럽게 세포의 수퍼 내수를 흡인하고 HBSS의 1 밀리리터 알리쿼트로 세포를 세 번 세척합니다. 최종 세척 단계에서 HBSS를 제거한 후 완전한 RPMI-1640 배양 매체의 밀리리터 1밀리리터를 추가합니다.그런 다음 세포 인큐베이터에서 5 %의 이산화탄소가있는 경우 섭씨 37도에서 24 시간 동안 세포를 배양합니다. 40 마이크로몰러의 농도로 HBSS에서 SYTOX 녹색 염료를 준비합니다. HMDM을 포함하는 각 우물에 25 마이크로리터의 염색기를 직접 추가합니다.어둠 속에서 5 분 동안 실온에서 세포를 배양하십시오. 그런 다음 HMDM을 조직 배양 우물에 배치하여 이미징을 위한 반전형 형광 현미경의 현미경 단계에 놓습니다. 고해상도 컬러 디지털 카메라로 설치된 광스펙트럼 형광원, 밝은 광원 및 반전 현미경을 켭니다.504 나노미터및 치수 523 나노미터에서 발산과 녹색 형광을위한 번호 2 위치로 필터 휠을 회전합니다. 5X 목표를 사용하여 이미지를 거친 초점으로 초점을 맞춘 다음 이미지가 선명하고 선명하며 초점을 맞출 때까지 현미경에 미세 초점 노브를 집중시합니다. 현미경을 카메라 모드로 전환합니다.관련 소프트웨어를 시작합니다. Play 버튼을 클릭하여 이미지를 미리 보고 이미지가 소프트웨어 미리 보기 창에 선명하고 선명하게 표시될 때까지 현미경의 미세 초점 노브를 조정합니다. 캡처 버튼을 클릭합니다.소프트웨어 내에서 파일을 클릭합니다. 필요한 이미지 파일 유형으로 저장합니다. 현미경에서 필터 휠을 밝은 필드 이미징을 위해 5번 위치로 회전하고 캡처 절차를 반복하여 해당 밝은 필드 이미지를 얻습니다.자극에 대한 응답으로 HMDM의 형태학적 변화를 보여주는 밝은 필드 이미지가 여기에 표시됩니다. 인터페론 감마및 리포폴리사카라이드에 노출된 HMDM을 실험한 M1 편광 대식세포는 길쭉하고 스핀들 같은 세포 모양을 보였다. 비교를 위해, 48시간 동안 HMDM을 인터류빈 4에 노출한 후 M2 편광 대식파지의 형태는 전형적으로 둥글고 평평했다.MDM 표현형을 방출하는 차별화된 HMDM 표현형의 능력은 SYTOX 그린을 통한 살아있는 세포 형광 이미징에 의해 시각화되었다. 어떤 프로 염증 자극의 부재에서 24 시간 동안 배양 각 HMDM 표현형에서 얻은 제어는 매우 제한된 녹색 염색을 보였다. 녹색 줄무늬로 표시된 MET에 대한 긍정적 인 염색은 고압산, PMA, 인터류키 8 또는 TNF 알파에 M1-HMDM을 노출하여 달성되었습니다.세포에서 명백한 몇몇 녹색 염색의 존재는 세포 외 함정 방출의 독립적인 세포 죽음에서 유래할 수 있는 막 무결성의 손실을 반영합니다. 인터류빈 4에 노출된 M2-HMDM로 수행된 실험은 세포외 DNA의 가닥이나 줄무늬가 없는 것으로 나타난 세포로부터 DNA의 방출을 보여주지 않았다. 그러나, 저염산 및 TNF 알파를 가진 녹색 형광염염의 몇몇 세포 조리가 있었습니다.이미징 전에 얼룩을 과열시킬 수 있는 직접적인 밝은 빛을 피하는 것이 중요합니다. 세포외 DNA는 세포 상수체에 존재하는 핵 및 미토콘드리아 DNA에 대한 qPCR 분석을 통해 정량화될 수 있다. HMDM을 이용한 만성 염증의 마스 구조 및 그 역할의 추가 특성화는 다른 불멸의 세포주 대식세포 매장에 비해 임상적으로 더 관련이 있을 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 일차 단핵구를 대식세포로 프라이밍하는 방법을 보여줍니다. 1차 인간 단핵구는 과립구-대식세포 집락자극인자(GM-CSF)를 사용하여 M1-like 전염증성 표현형으로 분리 및 분화할 수 있으며, 대식세포 집락자극인자(M-CSF)를 사용하여 M2-like 항염증성 표현형으로 분화할 수 있습니다.

In Vitro Culture and Differentiation of Primary Monocytes into Macrophages

이 동영상에서는 쥐의 폐 조직에서 대식세포 세포외 트랩(MET)의 면역염색 및 컨포칼 현미경 기반 시각화를 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 조직 상주 대식세포는 대식세포 특이적 F4/80 표면 당단백질 마커의 발현을 특징으로 하는 반면, MET는 MET 마커 매트릭스 금속단백분해효소 9, 시트룰린 히스톤 H3 및 세포외 염색질을 라벨링하여 시각화합니다.

Characterization of Macrophage Extracellular Traps in Mouse Lung Tissue Samples

이 비디오는 이분자 형광 보완 리포터 단백질을 사용하여 인간 대식세포에서 카스파아제 단백질의 활성화를 보여줍니다. 카스파제-1의 프로 도메인은 비너스 단백질의 비형광 단편과 융합되며, 이 단백질은 인플라마솜 복합체에 동원됩니다. 인플라마솜의 근접성은 금성 단편의 재접힘과 형광을 유도하여 대식세포에서 카스파아제 활성화를 확인합니다.

Visualization of Caspase Activation in Human Monocyte-Derived Macrophages

이 동영상은 기관지폐포 세척액에서 기관지폐포 대식세포의 대식세포 외 트랩(METs)의 면역 라벨링과 컨포칼 현미경을 사용한 시각화를 보여줍니다.

Visualization of Extracellular Traps in Macrophages from Human Bronchoalveolar Lavage Fluids

이 동영상은 TNF-알파, PMA 및 HOCL과 같은 다양한 염증 자극을 사용하여 인간 단핵구에서 파생된 대식세포의 대식세포 외 트랩(MET)의 체외 자극을 보여줍니다. 이 비디오는 또한 시각화를 위한 MET의 SYTOX 염료 염색 방법을 보여줍니다.

In Vitro Stimulation and Visualization of Macrophage Extracellular Traps

단핵구 유래 대 식세포는 타고난 면역 시스템의 중요한 세포입니다. 여기, 우리는 사용하기 쉬운...

<em&gt; 체외</em인간 대식 세포의 분화와 양극화의 이질성을 연구&gt; 모델

우리는 인간 대 식세포의 세대를위한 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시한다. 버피 코트는 이중 밀도 구배 원심 분리에 의해 처리되고 격리 된 단핵구는 테프론 코팅 된 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화된다. 이 대 식세포의 수율을 극대화하고 다음 실험을 위해 세포 수확을 용이하게한다.

인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리

대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF) 분화된 인간 단핵구 유래 대식세포의 세포 배양을 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 대식세포로의 벌크 분화와 결합된 단핵구의 동결 보존을 활용합니다. 그런 다음 수확된 대식세포를 실험 수행에 필요한 세포 밀도의 배양 웰에 파종할 수 있습니다.

대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

대 식 세포 세포 외 트랩은 새로 설명된 엔터티. 이 기사는 confocal 현미경 검사 법 방법에 집중할 것 이다 그리고 그들은 어떻게 시각 생체 외에서 그리고 vivo에서 폐 샘플에서.

Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 대 식 세포 세포 외 트랩을 시각화

이 프로토콜은 인간 혈액 샘플로부터 단핵구 유래 대식세포 (MDM)를 얻는 워크 플로우, 세포 생존력과 행동을 손상시키지 않고 염증성 카스파제 BiFC (BiFC) 리포터를 인간 MDM에 효율적으로 도입하는 간단한 방법, 살아있는 세포에서 염증성 카스파제 활성화를 측정하기위한 이미징 기반 접근법을 설명합니다.

인간 단핵구 유래 대식세포에서 근접성을 유도한 염증성 카스파제의 시각화

단핵구와 대식세포는 건강과 질병에 중요한 매우 가소성 및 재프로그래밍 가능한 면역 세포입니다. 그들은 특정 분화 프로그램과 표현형을 채택하여 광범위한 자극을 감지하고 반응합니다. 당사는 대식세포 분극 및 재프로그래밍을 연구하기 위해 in-vitro 모델을 표준화하여 연구를 위한 유용한 도구를 제공합니다.

In-vitro assay를 위한 human monocyte-derived Macrophage의 재프로그래밍 모델

배우세요 분화된 인간 단핵구 유래 대식세포에서 세포 외 트랩 방출을 자극하고 형광 현미경으로 시각화하는 방법을. 1차 인간 세포를 사용하여 생리학적 관련성이 높은 염증 반응 연구 모델을 제공합니다.

분화 한 인간 단핵구 유래 대식세포에서 세포 외 트랩 방출의 시험관 내 자극 및 시각화

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