마우스 Monocyte 파생 된 모 수석 세포 및 종양 면역 단지와 활성화 후속 생체 외에서 그들의 격리 프로토콜

이 방법은 과학자들이 면역 자극 특성을 연구하기 위해 종양을 가진 쥐의 혈액과 종양에서 단핵구 유래 DC를 분리하는 데 도움이 되도록 설계되었습니다. 다른 방법과 비교했을 때 이 절차의 가장 큰 장점은 얻어진 단핵구 유래 DC가 종양과 혈액에서 활성화 상태를 더 잘 반영한다는 것입니다. 가장 어려운 것은 아마도 모든 시약과 도구가 멸균 상태이고 이 절차 중에 오염이 발생하지 않는지 확인하는 것입니다.

저는 지금까지 15년 넘게 종양에서 골수성 세포와 수지상 세포를 분리해 왔으며, 서로 다른 분리 프로토콜로 인해 세포 활성화 패턴이 달라진다는 것을 알게 되었을 때 이 방법에 대한 아이디어를 떠올렸습니다. 시연을 하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Santana-Magal 여

층류 후드 내부의 이산화탄소를 사용하여 마우스를 안락사시킨 후 종양을 추출하고 소 태아 혈청이 없는 RPMI 배지에 놓습니다. 그런 다음 수술용 가위를 사용하여 종양을 작은 조각으로 자른다. 단일 마우스의 모든 종양 조각을 마그네틱 교반 막대와 함께 콜라겐분해효소 IV 및 DNase I이 보충된 HBSS 완충액이 들어 있는 30ml 평평한 바닥 튜브로 옮깁니다.

종양 조각이 담긴 튜브를 섭씨 37도의 셰이커에 넣고 내부에 자기 교반기를 넣고 20-30분 동안 분당 200-400회 회전으로 배양합니다. 다음으로, 70마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 세포를 여과합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 5-10분 동안 400배 g으로 세포를 원심분리합니다.

원심분리 후 1.5ml의 밀도 구배 중간 원액을 8.5ml의 HBSS에 첨가합니다. 그런 다음 밀도 구배 매체를 격렬하게 혼합합니다. 다음으로, 혼합물을 펠릿에 피펫으로 넣는다.

세포 현탁액을 실온에서 400 회 g으로 20 분 동안 원심 분리한다. 원심분리가 끝난 후 상층액을 디캔팅합니다. 펠릿화된 세포를 두 번 세척한 후 1ml의 분리 완충액에 재현탁합니다.

30마이크로리터의 CD11b 접합 자성 비드에 세포 현탁액을 추가합니다. 다음으로, 혼합물을 섭씨 4도에서 15분 동안 배양합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 펠릿을 1ml의 분리 완충액에 다시 현탁시킵니다.

세포 현탁액을 미리 세척된 마그네틱 컬럼에 적용합니다. 다음으로, 3ml의 분리 버퍼를 사용하여 컬럼을 두 번 세척합니다. 그런 다음 자석에서 컬럼을 제거합니다.

다음으로, 컬럼에 6ml의 분리 버퍼를 추가합니다. 플런저로 밀어 멸균 수집 튜브에서 자기 라벨링된 세포를 씻어냅니다. 다시 한 번, 섭씨 4도에서 5-10분 동안 400배 g으로 세포를 원심분리합니다.

세포를 재현 유탁시키고 염색 한 후, 작은 쪽과 작은 전방 산란을 사용하여 작은 세포를 게이팅하여 세포를 분류합니다. 마우스를 안락사 한 후 70 % 에탄올을 뿌립니다. 그런 다음 수술용 가위를 사용하여 층판 후드 아래의 심장을 덮고 있는 피부를 제거합니다.

다음으로 에탄올로 가위를 청소합니다. 20밀리몰 EDTA HBSS로 충치를 세척하고 가위를 사용하여 심장의 우심방을 자릅니다. 그런 다음 25게이지 바늘이 달린 10ml 주사기를 사용하여 20밀리몰 EDTA HBSS로 심장의 우심실을 천천히 씻어냅니다.

그런 다음 멸균 주사기를 사용하여 흉강에서 혈액을 채취합니다. 헤파란 설페이트와 EDTA가 들어 있는 튜브에 혈액을 전달합니다. 다음으로, 밀도 구배 매질에 혈액을 피펫팅합니다.

혈액 세포를 400배의 g으로 실온에서 15분 동안 낮은 브레이크로 원심분리합니다. 원심분리 후 튜브에 단핵 세포를 수집합니다. 세포를 10ml의 분리 완충액에 용해시켜 세포를 세척합니다.

다시 말하지만, 섭씨 4도에서 5-10분 동안 400배 g으로 세포를 원심분리합니다. CD11b 세포를 선택하려면, 세포 펠릿을 1ml의 분리 완충액에 재현탁합니다. 섭씨 4도에서 50마이크로리터의 CD11b 공액 자성 비드를 15분 동안 배양합니다.

섭씨 4도에서 5-10분 동안 400회 g으로 원심분리기합니다. 그런 다음 상층액을 제거합니다. 펠릿을 1ml의 분리 버퍼에 재현탁시킵니다.

다음으로, 미리 세척된 마그네틱 컬럼에 셀 현탁액을 적용합니다. 분리 버퍼로 컬럼을 두 번 세척합니다. 자석에서 컬럼을 제거하고 컬럼에 6ml의 분리 버퍼를 추가합니다.

다음으로, 플런저를 눌러 멸균 수집 튜브에 있는 자기 라벨링된 세포를 씻어냅니다. 세포를 400배 g으로 섭씨 4도에서 5-10분 동안 원심분리합니다. 세포를 분리 완충액에 재현탁시키고 형광단 접합 항체로 염색합니다.

small side 및 small forward scatter를 사용하여 small cells를 게이팅하여 셀을 정렬합니다. 먼저 실온에서 10분 동안 1.8% 완충된 파라포름알데히드에 세포를 고정합니다. U자형 96웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액을 파종합니다.

다음으로, 각 웰에 다양한 희석된 종양 결합 항체를 추가합니다. 그 후, 15-20분 동안 얼음 위에서 세포를 배양합니다. 배양 후 150마이크로리터의 인산염 완충 식염수로 세포를 세척합니다.

그런 다음 섭씨 4도에서 5-10분 동안 400배 g으로 원심분리합니다. 원심 분리 후, 상층액을 배출하고 세포를 두 번 세척합니다. 형광단 접합 2차 항체를 포함하는 100마이크로리터의 FACS 완충액에 세포를 용해시킵니다.

다음으로, 얼음 위에서 15-20분 동안 접시를 배양합니다. 15-20분 후 200마이크로리터의 FACS 완충액을 추가하여 세포를 세척합니다. 플레이트를 400회 g으로 5-10분 동안 원심분리합니다.

상층액을 디캔팅합니다. 종양 결합을 분석하고 세포를 코팅하는 데 필요한 면역글로불린 G의 최소 농도를 결정하기 위해 유세포 분석을 수행합니다. 세포가 최소 면역글로불린 G 농도로 코팅되면 CFSE 표지 종양 면역 복합체를 단핵구 유래 수지상 세포에 1:5 비율로 첨가합니다.

그런 다음 완전한 배지에서 하룻밤 동안 혼합물을 12-16시간 동안 배양합니다. 단핵구 유래 수지상 세포 활성화에 대한 FACS 분석을 수행합니다. 평균 형광 강도는 유세포 분석 후 계산되어 생체 외 LMP 종양 세포에 결합하는 IgG 및 M 항체의 존재를 연구합니다.

결과는 C57-Black/6 동종 마우스의 IgG 항체가 129S1 syngeneic 마우스의 항체보다 훨씬 더 강력하게 종양 세포에 결합하는 것을 보여줍니다. 그런 다음 B16F10 종양 세포와 IgG의 결합 능력의 평균 형광 강도를 계산합니다. 129S1 동종 마우스에서 얻은 IgG는 C57-Black/6 마우스의 syngeneic IgG에 비해 B16F10 종양에서 10배 더 높은 염색 강도를 보여줍니다.

다음으로, DIC 현미경 이미지를 캡처하여 B16F10 종양에서 종양과 관련된 단핵구 유래 수지상 세포를 보여줍니다. 여기에서 DIC 이미지는 B16F10 종양 보유 마우스의 혈액에서 분리된 염증성 및 순찰 단핵구 유래 수지상 세포를 보여주기 위해 캡처된 것입니다. 또한 유세포 분석은 비장과 골수에서 단핵구 유래 수지상 세포의 활성화 패턴을 면역 복합체와 함께 배양 시 종양 및 혈액의 활성화 패턴과 비교하기 위해 수행됩니다.

그 결과 면역 복합체가 있는 골수 및 비장 수지상 세포에 의한 CD86 및 MHC II 발현이 증가한 것으로 나타났습니다. 그런 다음 수지상 세포가 CFSE 표지된 종양 면역 복합체와 함께 배양될 때 종양 흡수 및 MHC II 발현을 보여주는 공초점 면역조직화학을 수행합니다. 일단 마스터하면 이 절차는 사용하는 마우스의 수에 따라 몇 시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 모든 시약과 도구를 항상 멸균 상태로 유지해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 쥐의 털은 오염의 주요 원인입니다. 머리카락이 조직에 닿지 않는지 확인하십시오.

이 동영상을 시청한 후 생쥐의 혈액 및 종양에서 단핵구 유래 DC를 분리하는 방법과 조기 활성화를 피하면서 면역 복합 세포로 단핵구 유래 DC를 활성화하는 방법을 잘 이해하게 되기를 바랍니다.