Name: 마우스 Monocyte 파생 된 모 수석 세포 및 종양 면역 단지와 활성화 후속 생체 외에서 그들의 격리 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 배우세요 종양을 가진 마우스의 혈액과 종양에서 단핵구 유래 수지상 세포(MoDC)를 분리하는 방법을. 면역 복합체로 활성화하여 면역 자극 특성을 연구할 수 있습니다.

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프로토콜 아래 마우스 MoDC의 격리를 참조 하십시오 아직 전반적인 원리 다른 DC 하위 집합 셀에도 적용 될 수 있습니다. 12-16 주 된 C57Bl/6j 생쥐 실험 동물 관리 인증-공인 동물 시설에 대 한 미국 협회에서 유지 되었다. 모든 프로토콜은 스탠포드 대학 및-텔아비브 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 종양의 절연 관련 Monocyte 파생 된 DC
<ol><li>층 류 두건에서 CO2 안락사 마우스에서 종양을 제거 하 고 소 태아 혈 청 (FBS) 없이 RPMI 매체에 종양을 배치 합니다. 참고: 그것은 좋습니다 쥐를 면도 하는 모피에서 잠재적인 오염을 최소화 하기 위해 종양을 제거 하기 전에 그들을 70% 에탄올 스프레이. 더 큰 종양 때문에 허약 하 고 세포 죽음을 받아야 하는 경향이 경향이 적은 DC 종양 25-40 m m2 를 초과 하지 않는 수 있습니다. DC의 큰 숫자는 필요한 경우 각 마우스는 여러 사이트에서 종양 세포 주입 수 있습니다.</li>
	<li>후드 무 균 층 류, 수술이 위를 사용 하 여 작은 조각 (대략 1 x 1 m m2)으로 종양을 잘라.<ol>
<li>30 mL 메 마른 플랫 바닥 관으로 자기 저 어 바, 행 크의의 5 mL를 포함 하는 하나의 마우스에서 모든 종양 조각을 소금물 (HBSS), 2 mg/mL 콜라 4, 및 0.01 mg/mL DNase 균형 추가 나. 주의: 골수성 세포 정상 상태 에서도 glycosylation 통해 에너지를 생산. 따라서, 10-15 분 만큼 적은 위해 포도 당 부족으로 포도 당 (HBSS, RPMI, 및 DMEM)를 포함 하는 유일한 사용 미디어 귀 착될 것 이다 세포 죽음 및 apoptosis 24 h.만 낮은 내 콜라 4, 콜라로 그람 양성 하 여 생산 사용 내 박테리아 (Clostridium histolyticum).</li>
	</ol>
</li>
	<li>37 oC 인큐베이터에 약 200-400 rpm에서 20-30 분 자력으로 저 어.</li>
	<li>완전 한 미디어의 5 mL을 추가 하 고 다시 적극적으로 일시 중단.</li>
	<li>70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 셀을 필터링 합니다. 작은 셀을 5-10 분 4 oC 400 rcf에 원심. 주의: 직접 다음 효소 소화, 일부 종양 괴 고 상대적으로 많은 양의 세포 파편 또는 세포 외 기질을 포함 하는 셀을 분리 하지 마십시오. 셀 셀만을 얻기 위해 15% 밀도 그라데이션 매체에 적용 됩니다.</li>
	<li>10 x PBS osmolality, 조정 하 고 100 %Percoll 재고 솔루션을 1 mL와 밀도 그라데이션 매체의 9 mL를 일시 중단 합니다. 믹스 1.5 mL 밀도 그라데이션 매체 8.5 mL HBSS 솔루션 재고와 종양에서 파생 된 셀 펠 릿으로 적극적으로 섞는다. 부드럽게 계층 15% 밀도 그라데이션 매체와 실 온에서 20 분 400 rcf에 원심 분리기의 정상 DMEM의 2 mL. 폐기 supernatants, 셀 튜브의 하단에 펠 릿을 형성 됩니다.<ol>
<li>두 번 다시 10 ml HBSS 2 %FBS, 1% 페니실린/스, 그리고 10 mM EDTA (절연 버퍼), 그리고 원심 분리기 4 oC 400 rcf 5-10 분에 작은 셀을 그들을 일시 중단 하 여 수송과 세포를 씻어.</li>
		<li>Hemocytometer trypan 블루 가벼운 현미경을 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다시 일시 중단 1 x 108 셀 1 mL 절연 버퍼 및 4 oC CD11b의 30 μ와에서 그들을 품 어+ 활용 자석 구슬 15 분. 주의:이 DC를 활성화 하 고 세포 죽음을 유도 것 이다 CD11c 활용 된 구슬, 사용을 하지 않습니다. 안티-CD16/32 항 체와 FcγRII 및 FcγRIII를 차단 하지 마십시오. 항 체를 차단 FcγR 선 지도 kinases의 강한 인 산화를 유도 하 고 DC 프라임.<ol>
<li>4oc.에 5-10 분 동안 400 rcf에 절연 버퍼 및 원심 분리기 세포의 9 mL를 추가 하 여 초과 언바운드 비즈를 제거</li>
	</ol>
</li>
	<li>상쾌한 발음 하 고 다시 1 mL 절연 버퍼에 셀을 일시 중단. 셀 prewashed 자석 열에 적용 됩니다. 두 번의 열 절연 버퍼의 3 mL 씻으십시오.<ol>
<li>자석에서 열을 제거 합니다. 플라스틱 절연 버퍼 열에 6 mL 그리고 플런저를 밀어 여 살 균 컬렉션 튜브로 자석으로 표시 된 셀 밖으로 플러시. 원심 분리기 셀 400 rcf 4 oc.에 5-10 분에서</li>
		<li>다시 1 x 107 셀 당 100 μ에서 세포를 일시 중단 하 고 다음 fluorophore 활용 된 항 체와 얼룩: 비재귀 부정적인 (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI 및 Ly6G), MHCII, Ly-6 C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>게이팅 측면 살포 (SSC)를 사용 하 여 작은 셀으로 셀을 정렬 하 고 산포 (FSC) 및 5 ng/mL GM-CSF를 보완 하는 완전 한 매체에서 문화 전달. 3 7 1 시간 동안 세포를 품 어 대 접시를 준수 할 수 있도록 oC. 그런 다음 전송에 느슨하게 및 새로운 문화 접시에 비 부착 한 세포. 참고: 마우스 MoDC CD11b로 정의 된+/CD11c+/MHCII안녕하세요/Ly6Clo/int 7,,2627. Ly6C의 표현 다를 수 있습니다 극적으로 종양 모델 사이 및 일부 모델 (예: LMP)에 MoDCs 완전히 Ly6C 식 부족. 전반적으로, 100 m m3 B16F10 종양은 일반적으로 약 4-5 배 106 총 셀에에서 발생 하는 DC의 5 x 104 포함 한. 이러한 세포의 10-15%는 면역 세포 하 고 8-10%는 MoDC. DC 숫자를 증가 하는 것은 여러 사이트에서 종양 쥐를 주입 하 여 얻을 수 있습니다. 정렬만 작은 SSC/FCS 셀 다른 골수성 세포로 CD11c 및 Ly6C와 같은 마커 표현할 수 있습니다. 선택 사항: MHCII에 대 한 부정적 표현 Ly6C안녕하세요 작은 SSC/FSC 셀으로 종양 침투 monocyte 정렬. 그 후, monocytes에서 생체 외에서 DC를 50 ng/mL GM-CSF와 문화.</li>
</ol>2. 말 초 혈액에서 DC Monocyte 파생의 격리
참고: 성숙 MoDCs 마우스 혈액에 비교적 드문 때문에, 아래의 프로토콜은 그들의 파생에서 체 외에서 정렬된 monocytes에서 합니다.
<ol><li>혈액에 monocytes의 수준을 증가, 4 %isoflurane 쥐를 anesthetize 하 고 그들을 피하 주사 (사우스 캐롤라이나) 50 μ PBS에 GM-CSF의 1 μ g으로.</li>
	<li>후 1-2 h, CO2를 사용 하 여 쥐를 희생. 주의: 자 궁 경부 전위에 의해 한 생쥐 희생 하지이 내부 출혈이 발생할 것입니다.</li>
	<li>Euthanization, 직후 70% 에탄올으로 마우스를 살포 하 고 피부 심장 수술가 위, 살 균 층 흐름 후드를 사용 하 여 커버를 제거 합니다. 에탄올과가 위를 청소 하 고 심 혼의 오른쪽 아 트리 움 잘라. 천천히, 20 mm EDTA HBSS 10 mL 주사기와 25 G 바늘을 사용 하 여 우 심 실을 통해 마음을 플러시.<ol>
<li>Heparan 황산 염, EDTA를 포함 하는 살 균 관으로 흉 막 캐비티에서 무 균 주사기 혈액을 수집 합니다. 간 및 폐 되 핑크 나 화이트까지 중심부를 계속 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>15 분 동안 실 온에서 400 rcf에 밀도 그라데이션 mediumand 분리기에 혈액 낮은 브레이크 적용. 주의: 사용도 무료 밀도 그라데이션 매체 (보통 미만 0.12 mL 당 유럽 연합).<ol>
<li>새로운 관으로 단 세포를 수집 합니다. 다시 10 ml 2 %FBS, 1% 페니실린/스와 10 mM EDTA (절연 버퍼), 그리고 4 o에서 다음 centrifuging HBSS C 400 rcf 작은 셀을 5-10 분에 대 한 일시 중단 하 여 세포를 씻어. 주의: 적어도 1 g/L 포도 당을 포함 하는 미디어에만 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CD11b 긍정적인 선택, 다시 1 mL 절연 버퍼에 1 x 108 셀을 일시 중단 하 고 4 oc.에 CD11b 활용 자석 구슬의 50 μ와 15 분 동안 그들을 품 어<ol>
<li>절연 버퍼의 9 mL을 추가 하 고 5-10 분 4 oC. Aspirate에서 400 rcf에는 supernatants centrifuging 여 초과 비즈를 세척 하 고 다시 1 mL 절연 버퍼에 셀을 일시 중단. 제조업체의 지침에 따라 prewashed 자기 열에 셀을 적용 합니다.</li>
		<li>자석에서 열을 제거 하 고 플라스틱, 열에 절연 버퍼의 6 mL 플런저를 밀어 여 살 균 컬렉션 튜브로 자석으로 표시 된 셀 밖으로 플러시. 원심 4 oC. 세척에서 5-10 분 동안 400 rcf에 셀 절연 버퍼의 3 mL로 두 번 열.</li>
		<li>1 x 107 셀/100 μ 절연 버퍼와 얼룩 다음 fluorophore 활용 된 항 체와 세포를 다시 중단: 0.1 μ g CD115, 0.25 μ g MHCII, 그리고 0.1 μ g Ly-6 C/1 x 106 셀.</li>
	</ol>
</li>
	<li>게이팅 작은 측면 살포 (SSC)와 작은 앞으로 분산형 (FSC) 셀에 의해 셀을 정렬 합니다. 참고: 마우스 염증 monocytes는 일반적으로 정의 된 CD115로+MHCIIlo/neg/Ly6C안녕하세요및 monocytes 순찰 CD115로 정의 됩니다/+/MHCIIlo/neg/Ly6Cneg 4, 5. 두 하위 집합 사이 분리는 필요 하다는 경우, 총 SSClo/FCSlo/CD115+/MHCIIlo 셀을 정렬할 수 있습니다. 순진한 및 종양 방위 쥐 포함 약 5-8 10 ×4 MoDC 혈액 및 최대 1 mL 당 105 MoDC 다음 x 4-5 GM-CSF의 주입. 그들의 약 70%는 염증 monocytes 고 30%는 monocytes를 순찰 하 고 있다.</li>
	<li>완전 한 미디어 20 ng/mL GM-CSF와 보완에 1 x 106 셀/mL의 농도에서 세포 격판덮개 1 일 후 추가 4-5 일에 대 한 비 점착 및 느슨하게 부착 세포 새로운 플레이트와 문화를 전송. 주의: DC 미디어 pyruvate와 보완 해야 하지.</li>
</ol>3. 종양 IgG 면역성이 있는 복합물의 준비
<ol><li>완전 한 DMEM 미디어에서 70% 합류 하 75 cm2 문화 플라스 크에 문화 종양 세포.<ol>
<li>0.25 %trypsin / EDTA-trypsinization 피하기 위해 가벼운 현미경 문화 플라스 크 및 모니터 셀 형태학에서 세포를 분리 하의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>트립 신 소화를 억제 하 여 4 oC, 5-10 분 작은 셀 400 rcf에 원심 (trypsin의 2 개 mL) 당 완전 한 문화 미디어의 8 mL를 추가 합니다. 참고: Mycoplasma 상업 PCR 키트를 사용 하 여 종양 세포를 확인 해야 합니다. 그램 음성 박테리아와 곰 팡이 독을 사용 하 여 Limulus Amebocyte Lysate (LAL)의 존재에 대 한 시험 분석 결과28). 혈 청 0.22 μ M 통과 하 고 9 연방 규정 코드 바이러스에 대 한 테스트 해야 합니다. 또한, 37 oc. 2 일에 대 한 파운드 agar 또는 국물, 그리고 문화에 100-200 μ를 놓아 문화 미디어와 세럼을 테스트</li>
		<li>워시 세포 다시 다시 10 mL PBS와 5-10 분에 대 한 400 rcf에 원심 분리기에서 그들을 일시 중단 하 여 트립 신 및 혈 청 유적에서 상쾌한 발음 하 고 2 번 더 세척을 반복.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실 온에서 10 분 동안 버퍼링 1.8 %paraformaldehyde 셀을 수정 합니다.<ol>
<li>다시 10 mL PBS와 5-10 분 4 oC 400 rcf에 원심 분리기에서 그들을 일시 중단 하 여 세포를 씻어.</li>
		<li>Aspirate supernatants, 반복 두 번 더 세척. 선택 사항: 종양 이해 분석 실험에 대 한 셀 수 표시 37 oC에서 1 μ M carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르 (CFSE)를 포함 하는 PBS에서 5 분 동안 그들을 배양 하 여. CFSE는 얼음에 10 분에 대 한 완전 한 미디어 다음 침묵 이다. 셀 잔여 염료를 제거 하려면 2% 혈 청을 포함 하는 PBS에 광범위 하 게 세척 되어야 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다시 잠재적인 비 특정 단백질-단백질 상호 작용을 차단 하기 위해 FACS 버퍼 (PBS 보충 fcs가 2% + 5 mM EDTA) 셀 안티-CD16/32의 0.5 μ g/mL를 일시 중단 합니다. 100 μ 당 1 x 105 셀의 농도에 U 자형 96 웰 스/접시 플레이트.<ol>
<li>5 μ g-105 셀 x 5 ng/1에서에서 배열 하는 종양 바인딩 항 체의 다른 희석을 추가 합니다. 15-20 분 동안 얼음에 플레이트를 품 어. 참고: IgG 항 체 기술된24로 단백질 A 열에 순진한 20-24 주 된 여성 쥐의 혈 청에서 고립 되었다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBS의 150 μ를 추가 하 고 5-10 분 4 oC 400 rcf에 접시 centrifuging 여 세포를 씻어.<ol>
<li>supernatants 무시 하 고 두 번 세척을 반복 합니다. 다시 100 μ FACS 버퍼 fluorophore 활용 된 이차 항 체를 포함 하는 셀을 일시 중단 합니다. 20 분 동안 얼음에 플레이트를 품 어.</li>
		<li>FACS 버퍼의 200 μ를 추가 하 여 셀을 세척 하 고 접시 centrifuging 5-10 분에 대 한 400 rcf에 취소는 supernatants 및 세척을 반복.</li>
		<li>Cytometry 종양 바인딩 분석 하 고 셀 코트 하는 데 필요한 최소 농도 결정 합니다. 참고: 항 체를 증가 하지 의미 형광 강도 (MFI)으로 얼룩진된 종양 세포의 이상 요소가 isotype 제어 후속 기능 분석에 사용할 수 없습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 종양 IgG IC와 MoDC의 활성화
<ol><li>3.4.3 통해 3.1 섹션에 설명 된 대로 최소한의 IgG 농도와 종양 세포를 코트<ol>
<li>종양 IC와 함께 MoDC를 활성화 하기 전에 1 일 GM-CSF를 포함 하는 MoDC 문화 미디어를 교체 합니다. 이렇게 하려면 부드럽게 미디어를 발음 하 고 미리 데워 진된 완전 한 문화 미디어와 한 번 세포를 씻어. 참고: 적어도 2-3 h (또는 심지어 하룻밤) 정렬 후 GM-CSF 없이 완전 한 미디어, 그리고 IC와 그들을 활성화 하기 전에 격리 된 성숙한 종양 관련 MoDC 교양 수 한다.</li>
		<li>종양 통풍 관 분석, CFSE 표시 된 종양 IC MoDC 1:5 (IC:MoDC)의 비율로 추가 및 1 x 106 DC 당 완전 한 미디어의 1 mL에 12-16 시간 밤새 품 어.</li>
		<li>FACS MoDC 활성화 실험의 분석, 1:1 (IC:MoDC) 비율에서 종양-IC를 추가 하 고 12-16 시간 밤새 품 어. 참고: 것이 좋습니다 잘, 긍정적인 통제를 포함 하는 MoDC는 LPS 또는 다른 TLR agonists의 1 μ g/mL로 자극.</li>
		<li>supernatants 발음 다음 하룻밤 활성화, 그리고 세척 세포 부드럽게 세 번 절연 버퍼, 또는 10 m m EDTA HBSS.</li>
		<li>접시에서 DC를 분리, 2-3 분 1 ml HBSS 10 mM EDTA를 포함 하는 셀을 품 어 하 고 활기찬 pipetting으로 세포를 분리 합니다.</li>
		<li>400 rcf에 세포를 원심 하 고 다시 1 x 106 DC 90 μ PBS 2 %FCS, 5 mM EDTA (FACS 버퍼)와 0.5 μ g 항 체를 차단의 보충을 중단. 5-10 분 동안 얼음에 품 어.</li>
		<li>얼룩이 지는 세포에 항 체 혼합물의 10 μ를 추가 하 고 15 분 동안 얼음에 품 어.</li>
		<li>셀을 5-10 분 4 oC 400 rcf에 원심 분리기 2 mL FACS 버퍼를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다시 200 μ FACS 버퍼에 셀을 일시 중단 합니다.<ol>
<li>추가 0.5-1 μ g/mL DAPI의 분석에서 죽은 세포를 제외 하는 샘플을 실행 하기 전에 1-2 분. 마십시오 하지-품 어 DAPI로 MoDC 10-15 분 이내에 그것을 걸릴 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

모든 저자 그들은 충돌의 관심을가지고 그들은 공개 없다 선언 합니다.

마우스에 우 두를 접종에 필요한 DC의 많은 수를 감안할 때 (약 2-4 x 106 DC 한 마우스 당), 예방 접종 BM과 비장 뒤에 그들의 비보 전 활성화에서 DC의 격리를 기반으로하는 생쥐에서 전략의 대부분. 그러나, 종양 DC에서 vivo에서, 비장 및 BM DC 활성화에 대 한 동일한 조건을 사용 하 여 활성화, 자주 하지 효과적인 면역 생산에 성공 하려고 합니다. 두 후속 출판물, Carmi 외. 그 혈액과 종양 MoDC 크게 차이가 비장 및 BM DC에서 그들은 자연스럽 게 내장의 상부 티로신 인산 가수분해 효소를 부담 하 고 IC24,25활성화 전에 못쓰게 해야 하는 것을 발견 했다. 또한, 이러한 결과 더 스트레스 더 활성화 상태에서 DC를 유지 하기 위해 추가 조치를 취하에 대 한 필요성 그들의 생리 적 상태를 반영 합니다. 따라서, 현재 ...

그들의 발견부터 수지상 세포 (DC) T 세포 감 별 법1왜곡 그들의 독특한 능력으로 인해 광범위 한 연구의 초점을 했습니다. 지난 몇 년간 광범위 한 연구 노력 종양 진행과 면역 2동안 다양 한 DC 하위 집합 및 그들의 기능을 정의 하기 위해 노력해왔다. Dc는 그들의 패턴 인식 수용 체, 조직 배포에서에서 서로 다른 이기종 세포 인구 구성 및 철새와 항 원 프레 젠 테이 션 기능3,,45. 다른 DC 하위 집합에 비해 monocyte 파생 된 DC (MoDC) 종양에 훨씬 더 풍부 하 고 순환에서 쉽게 생성 될 수 또는 종양 침투 monocytes6,7. 따라서, 그들의 상대 보급을 활용 하고자 하는 많은 임상 실험은 T 세포 면역 8,9를 유도 하기 위해 헌 MoDC의 비보와 비보 전 조작 기반으로 합니다.
마찬가지로, DC 기반으로 예방 접종 실험 종양 모델의 2-3 직렬 주사, 떨어져, 1-2 10 x 5-7 일 필요6 활성화 된 DC 펄스와 종양 항 원. 따라서, DC의이 많은 수를 달성 하기 위해, 대부분 마우스 연구 주로 사용 MoDC 7-9 일 (IL-4 마우스 설정에 필요 하지 않습니다)에 대 한 GM-CSF에 골 수 (BM) 선구자에서 교양10,11. 그럼에도 불구 하 고, 주어진 그 GM-CSF 녹아웃 쥐가 전반적으로 정상적인 DC 구획 12,의13, 그리고 그 문화에서 얻은 혼합된 인구를 주어진14 이러한 DC의 생리 적인 관련성 질문으로 불려 왔다.
또는, DC 비장 세포에서 정기적으로 격리 된 수 있습니다. 그러나, DC 구성 약 0.3-0.8% (약 7 × 105 DC/비장 결과), 총 비장 세포의이 세포, CD103만의+ DC 및 MoDC 림프 기관에 다시 마이그레이션할 수 있습니다. MoDCs 비장 DC 인구15,16의 약 10-15%를 구성, 이후 대부분 격리 프로토콜 약 1 × 105 MoDC 비장 당 양보. MoDC의 확장 GM-CSF, 비장 MoDC17100 증가 결과 분 비 하는 transfected B16 셀을 삽입 하 여 얻을 수 있습니다. 그러나, DC 백신 개발을 위한 MoDC의 사용은 제한 때문에 인간과 취득에이 절차를 수행할 수 없습니다 MoDC 이미 매우 활성화 됩니다.
DC의 적절 한 숫자를 얻는 이외에 헌 암 세포에 대 한 효과적인 DC 백신을 개발 하기 위한 또 다른 도전은 완전히 DC를 활성화 하는 종양에 충분 한 위험 신호의 부족을 포함 한다. Co-stimulatory 신호 유도 패턴 인식 수용 체 (PRR), 또는 c 형 lectin 신호 통로18,19,,2021의 활성화를 통해 일반적으로 달성 된다. DC를 활성화 하기 위한 더 접근 표면 Fcγ 수용 체 (FcγR)와 상호 작용을 통해 항 원까지 자신의 능력을 악용 합니다. 실제로, 중요 한 원고 수 나타났습니다 예방 설정에서 종양의 성장을 막을 수는 BM 선구자 활성화에서 MoDC의 주입 종양-IgG IC 및 설립된 종양22,23 의 박멸을 이어질 수 있습니다 .
2 최근 논문, Carmi 외 는 BMDC 및 비장 DC, 달리 고 혈액 종양에서 MoDC에 응답할 수 없습니다 IgG IC 추가 자극 없이 발견 했다. 이 티로신 인산 가수분해 효소 신호24,25FcγR 통제의 상부 세포내의 존재 때문에 발견 되었다. DC에서 중요 한 검사점을 정의 하 여이 작품 성공 DC 기반 예방 접종에 대 한 요구 사항에 대 한 중요 한 통찰력을 제공 합니다. FcγR 신호, 그리고 아마도 비슷한 인 산화 폭포를 활용 하 여 다른 lectin 수용 체에서 신호 수 있도록 추가 자극에 대 한 요구 따라서 그들의 고립 동안 DC의 애 벌 칠을 피하에 대 한 필요성을 밑줄.
따라서, 현재 프로토콜 혈액 및 종양, BM, 비장 DC에서 현저 하 게 다르다에서 MoDC의 격리를 설명 하 고 과정에서 고려 가치가 주의 강조.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM</td><td>GE-Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep</td><td>StemCell Technologies</td><td>07820</td><td></td></tr><tr><td>CD45 MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 단핵구 분리 키트</td><td>StemCell Technologies</td><td>19861</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Sigma</td><td>C9697-50MG</td><td>각 로트의 내독소 테스트</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25-10MG</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher</td><td>16140071</td> endotoxin <td></td></tr><tr><td>PE-CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117307</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101211</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 650 MHCII</td><td>Biolegend</td><td>107641</td> 대해 각 로트를 테스트합니다.<td></td></tr><tr><td>AF48- CD86</td><td>바이오레전</td>드 <td>105017</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7-Ly-C6</td><td>바이오레전</td><td>드 108423</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7-CD15</td><td>바이오레전</td><td>드 135523</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 monocyte 파생 된 모 수석 세포 및 종양 면역 단지와 활성화 후속 생체 외에서 그들의 격리 프로토콜

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

수지상 세포 (DC)는 이종 세포 인구에 그들의 세포 막 마커, 마이그레이션 패턴 및 유통, 그리고 그들의 프레 젠 테이 션 항 원에 T 세포 활성화 능력을 다른. 실험적 종양 모델의 대부분 예방 접종 필요 DC의 수백만, 그들은 널리 골 수 나 비장 으로부터 격리 됩니다. 그러나, 이러한 DC 크게 다 혈액과 종양 DC에 그들의 응답에서 면역성이 있는 복합물 (IC), 그리고 아마도 다른 lectin Syk 결합 수용 체. 중요 한 것은, 위험 관련 분자에 DC의 감도 감안할 때, 독 또는 crosslink 활성화 수용 체는 격리 중 하나는 항 체의 존재 수 DC의 못쓰게 되며 따라서 매개 변수를 영향을 하거나 적어도 복용량, 그들을 활성화 하는 데 필요한 따라서, 여기 우리가 그들의 조기 활성화를 피하고 있는 동안 혈액과 종양에서 MoDC를 고립 시키기를 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 또한, 프로토콜 종양 IC와 함께 MoDC 활성화 및 그들의 연속적인 분석을 위해 제공 됩니다.

우리는 처음 종양 세포에 바인딩할 순 syngeneic 고 수용자 쥐에서 항 체의 용량 비교. 이 위해, B16F10 LMP 종양 세포 라인 paraformaldehyde에서 고정 되었고 광범위 하 게 씻어. B16F10 흑색 종 세포 선, C57Bl/6 마우스의 폐 전이에서 원래 고립 되었다 이다. LMP는 KrasG12D에서 고립 되었다 췌 장 종양 세포 / +, LSL-Trp53R172H / +, 그리고 Pdx-1-Cre 마우스 129F1 마우스에 꾸준히 성장 하 고. IC를, 종양 세포는 1 x 105 종양 세포 당 syngeneic 또는 수용자 IgG의 2 μ g으로 얼음에 20 분 동안 incubated 했다. IgG 및 IgM 항 체 순의 순환에서 고립 된 단백질 A, 크기 배제 크로마토그래피로 다음에 20-24 주 된 쥐 설명24. 셀에 씻어 했다 그리고 PE 활용 된 쥐 반대로 마우스 IgG ...

Monocyte 파생 된 DC (MoDC) 위험 관련 된 분자의 작은 금액을 느낄 수 및 따라서 쉽게 끝났다. 우리는 혈액과 종양과 그들의 조기 활성화를 피하기 위해 고려해 야 하는 주요 조치를 강조 하면서 면역성이 있는 복합물으로 그들의 활성화에서 MoDC의 격리에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.

마우스 Monocyte 파생 된 모 수석 세포 및 종양 면역 단지와 활성화 후속 생체 외에서 그들의 격리 프로토콜

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

이 방법은 과학자들이 면역 자극 특성을 연구하기 위해 종양을 가진 쥐의 혈액과 종양에서 단핵구 유래 DC를 분리하는 데 도움이 되도록 설계되었습니다. 다른 방법과 비교했을 때 이 절차의 가장 큰 장점은 얻어진 단핵구 유래 DC가 종양과 혈액에서 활성화 상태를 더 잘 반영한다는 것입니다. 가장 어려운 것은 아마도 모든 시약과 도구가 멸균 상태이고 이 절차 중에 오염이 발생하지 않는지 확인하는 것입니다.저는 지금까지 15년 넘게 종양에서 골수성 세포와 수지상 세포를 분리해 왔으며, 서로 다른 분리 프로토콜로 인해 세포 활성화 패턴이 달라진다는 것을 알게 되었을 때 이 방법에 대한 아이디어를 떠올렸습니다. 시연을 하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Santana-Magal 여사입니다.층류 후드 내부의 이산화탄소를 사용하여 마우스를 안락사시킨 후 종양을 추출하고 소 태아 혈청이 없는 RPMI 배지에 놓습니다. 그런 다음 수술용 가위를 사용하여 종양을 작은 조각으로 자른다. 단일 마우스의 모든 종양 조각을 마그네틱 교반 막대와 함께 콜라겐분해효소 IV 및 DNase I이 보충된 HBSS 완충액이 들어 있는 30ml 평평한 바닥 튜브로 옮깁니다.종양 조각이 담긴 튜브를 섭씨 37도의 셰이커에 넣고 내부에 자기 교반기를 넣고 20-30분 동안 분당 200-400회 회전으로 배양합니다. 다음으로, 70마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 세포를 여과합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 5-10분 동안 400배 g으로 세포를 원심분리합니다.원심분리 후 1.5ml의 밀도 구배 중간 원액을 8.5ml의 HBSS에 첨가합니다. 그런 다음 밀도 구배 매체를 격렬하게 혼합합니다. 다음으로, 혼합물을 펠릿에 피펫으로 넣는다.세포 현탁액을 실온에서 400 회 g으로 20 분 동안 원심 분리한다. 원심분리가 끝난 후 상층액을 디캔팅합니다. 펠릿화된 세포를 두 번 세척한 후 1ml의 분리 완충액에 재현탁합니다.30마이크로리터의 CD11b 접합 자성 비드에 세포 현탁액을 추가합니다. 다음으로, 혼합물을 섭씨 4도에서 15분 동안 배양합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 펠릿을 1ml의 분리 완충액에 다시 현탁시킵니다.세포 현탁액을 미리 세척된 마그네틱 컬럼에 적용합니다. 다음으로, 3ml의 분리 버퍼를 사용하여 컬럼을 두 번 세척합니다. 그런 다음 자석에서 컬럼을 제거합니다.다음으로, 컬럼에 6ml의 분리 버퍼를 추가합니다. 플런저로 밀어 멸균 수집 튜브에서 자기 라벨링된 세포를 씻어냅니다. 다시 한 번, 섭씨 4도에서 5-10분 동안 400배 g으로 세포를 원심분리합니다.세포를 재현 유탁시키고 염색 한 후, 작은 쪽과 작은 전방 산란을 사용하여 작은 세포를 게이팅하여 세포를 분류합니다. 마우스를 안락사 한 후 70 % 에탄올을 뿌립니다. 그런 다음 수술용 가위를 사용하여 층판 후드 아래의 심장을 덮고 있는 피부를 제거합니다.다음으로 에탄올로 가위를 청소합니다. 20밀리몰 EDTA HBSS로 충치를 세척하고 가위를 사용하여 심장의 우심방을 자릅니다. 그런 다음 25게이지 바늘이 달린 10ml 주사기를 사용하여 20밀리몰 EDTA HBSS로 심장의 우심실을 천천히 씻어냅니다.그런 다음 멸균 주사기를 사용하여 흉강에서 혈액을 채취합니다. 헤파란 설페이트와 EDTA가 들어 있는 튜브에 혈액을 전달합니다. 다음으로, 밀도 구배 매질에 혈액을 피펫팅합니다.혈액 세포를 400배의 g으로 실온에서 15분 동안 낮은 브레이크로 원심분리합니다. 원심분리 후 튜브에 단핵 세포를 수집합니다. 세포를 10ml의 분리 완충액에 용해시켜 세포를 세척합니다.다시 말하지만, 섭씨 4도에서 5-10분 동안 400배 g으로 세포를 원심분리합니다. CD11b 세포를 선택하려면, 세포 펠릿을 1ml의 분리 완충액에 재현탁합니다. 섭씨 4도에서 50마이크로리터의 CD11b 공액 자성 비드를 15분 동안 배양합니다.섭씨 4도에서 5-10분 동안 400회 g으로 원심분리기합니다. 그런 다음 상층액을 제거합니다. 펠릿을 1ml의 분리 버퍼에 재현탁시킵니다.다음으로, 미리 세척된 마그네틱 컬럼에 셀 현탁액을 적용합니다. 분리 버퍼로 컬럼을 두 번 세척합니다. 자석에서 컬럼을 제거하고 컬럼에 6ml의 분리 버퍼를 추가합니다.다음으로, 플런저를 눌러 멸균 수집 튜브에 있는 자기 라벨링된 세포를 씻어냅니다. 세포를 400배 g으로 섭씨 4도에서 5-10분 동안 원심분리합니다. 세포를 분리 완충액에 재현탁시키고 형광단 접합 항체로 염색합니다.small side 및 small forward scatter를 사용하여 small cells를 게이팅하여 셀을 정렬합니다. 먼저 실온에서 10분 동안 1.8% 완충된 파라포름알데히드에 세포를 고정합니다. U자형 96웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액을 파종합니다.다음으로, 각 웰에 다양한 희석된 종양 결합 항체를 추가합니다. 그 후, 15-20분 동안 얼음 위에서 세포를 배양합니다. 배양 후 150마이크로리터의 인산염 완충 식염수로 세포를 세척합니다.그런 다음 섭씨 4도에서 5-10분 동안 400배 g으로 원심분리합니다. 원심 분리 후, 상층액을 배출하고 세포를 두 번 세척합니다. 형광단 접합 2차 항체를 포함하는 100마이크로리터의 FACS 완충액에 세포를 용해시킵니다.다음으로, 얼음 위에서 15-20분 동안 접시를 배양합니다. 15-20분 후 200마이크로리터의 FACS 완충액을 추가하여 세포를 세척합니다. 플레이트를 400회 g으로 5-10분 동안 원심분리합니다.상층액을 디캔팅합니다. 종양 결합을 분석하고 세포를 코팅하는 데 필요한 면역글로불린 G의 최소 농도를 결정하기 위해 유세포 분석을 수행합니다. 세포가 최소 면역글로불린 G 농도로 코팅되면 CFSE 표지 종양 면역 복합체를 단핵구 유래 수지상 세포에 1:5 비율로 첨가합니다.그런 다음 완전한 배지에서 하룻밤 동안 혼합물을 12-16시간 동안 배양합니다. 단핵구 유래 수지상 세포 활성화에 대한 FACS 분석을 수행합니다. 평균 형광 강도는 유세포 분석 후 계산되어 생체 외 LMP 종양 세포에 결합하는 IgG 및 M 항체의 존재를 연구합니다.결과는 C57-Black/6 동종 마우스의 IgG 항체가 129S1 syngeneic 마우스의 항체보다 훨씬 더 강력하게 종양 세포에 결합하는 것을 보여줍니다. 그런 다음 B16F10 종양 세포와 IgG의 결합 능력의 평균 형광 강도를 계산합니다. 129S1 동종 마우스에서 얻은 IgG는 C57-Black/6 마우스의 syngeneic IgG에 비해 B16F10 종양에서 10배 더 높은 염색 강도를 보여줍니다.다음으로, DIC 현미경 이미지를 캡처하여 B16F10 종양에서 종양과 관련된 단핵구 유래 수지상 세포를 보여줍니다. 여기에서 DIC 이미지는 B16F10 종양 보유 마우스의 혈액에서 분리된 염증성 및 순찰 단핵구 유래 수지상 세포를 보여주기 위해 캡처된 것입니다. 또한 유세포 분석은 비장과 골수에서 단핵구 유래 수지상 세포의 활성화 패턴을 면역 복합체와 함께 배양 시 종양 및 혈액의 활성화 패턴과 비교하기 위해 수행됩니다.그 결과 면역 복합체가 있는 골수 및 비장 수지상 세포에 의한 CD86 및 MHC II 발현이 증가한 것으로 나타났습니다. 그런 다음 수지상 세포가 CFSE 표지된 종양 면역 복합체와 함께 배양될 때 종양 흡수 및 MHC II 발현을 보여주는 공초점 면역조직화학을 수행합니다. 일단 마스터하면 이 절차는 사용하는 마우스의 수에 따라 몇 시간 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 모든 시약과 도구를 항상 멸균 상태로 유지해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 쥐의 털은 오염의 주요 원인입니다. 머리카락이 조직에 닿지 않는지 확인하십시오.이 동영상을 시청한 후 생쥐의 혈액 및 종양에서 단핵구 유래 DC를 분리하는 방법과 조기 활성화를 피하면서 면역 복합 세포로 단핵구 유래 DC를 활성화하는 방법을 잘 이해하게 되기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 절차를 자극시 IL - 17 분비 적극적으로 마우스 TH17의 leukocytes의 탐지 및 격리에 대해 설명합니다.

가능한 마우스 IL - 17 - Secreting의 T 세포 탐지 및 격리

마우스 폐 돌기 세포의 고도 정화 준비가 설명되어 있습니다. 구체적인 중점이 종래의 돌기 세포 집합의 고립에 제공됩니다.

마우스 폐에 돌기 세포의 분리

이 보고서에서는 종양에 침투 leukocytes의 고도 정화 인구를 분리를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 복잡한 종양 조직에서 세포를 분리에 대한 수율과 순도를 향상시키기 위해 Miltenyi 생명 공학 프로토콜에서 적응하고 있습니다.

일차 종양에서 면역 세포의 분리

이 비디오는 면역글로불린 G(IgG)로 코팅된 종양 세포를 사용하여 수지상 세포의 활성화를 평가하는 프로토콜을 보여줍니다. 수지상 세포는 IgG로 코팅된 종양 세포를 내부화하고, 종양 항원을 처리하고, 공동 자극 분자 CD86의 공동 발현과 함께 MHC-II 분자를 통해 표면에 존재합니다. 그런 다음 이러한 수지상 세포는 MHC-II 및 CD86 표적 면역 염색 및 유세포 분석 분석을 거쳐 활성화 상태를 확인합니다.

면역 복합체를 사용한 수지상 세포 활성화에 대한 유세포 분석 기반 분석

뚜렷한 수지상 세포 부분 집합은 림프 기관에서 드문 집단으로 존재하므로 면역학 실험을 위한 충분한 수와 순도로 분리하기가 어렵습니다. 여기에서는 현재 알려진 마우스 비장 수지상 세포의 모든 주요 부분 집합을 분리하기 위한 고효율, 고수율 방법에 대해 설명합니다.

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

림프구는 적응 면역 반응의 주요 플레이어입니다. 여기에서는 in vitro 및 in vivo에서 원하는 분자의 림프구 활성화의 생리학적 기능을 결정하기 위한 림프구 정제 프로토콜을 제시합니다. 설명된 실험 절차는 대조군 림프구와 유전자 변형 림프구 간의 기능적 능력을 비교하는 데 적합합니다.

분리 및 쥐 림프구의 활성화

여기, 우리가 순진한 CD4 T 세포 (T 세포) 활성화, 확산, 그리고 GM-CSF 골 (BM)에 의해 유도 된 Th1 차별화의 비보에 결정에 대 한 프로토콜을 제시-파생 된 모 수석 세포 (DCs). 또한,이 프로토콜 BM 및 T-세포 절연, DC 생성, 및 DC 및 T-세포 입양 전송을 설명합니다.

Vivo에서 마우스 모델을 측정 순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산 및 골 수 유래 수지상 세포에 의해 유도 된 Th1 차별화

체 외 광 화학요법 (ECP)의 핵심 기능을 복제 하기 위해 실험 설정에서 생리 활성, 가변 수지상 생산을 가능 하 게 하는 (TI) 장치 또는 플레이트 및 관련 프로토콜이 개발 되었습니다. 암 면역 요법을 위한 세포 (DCs).

생리 적 면역 원 성 수지상 세포 생성을 위한 새로운 프로토콜

여기에서는 10 ng / mL GM-CSF / IL-4로 7 일 배양 한 후 마우스에서 고순도 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 생성하는 경제적이고 효율적인 방법을 제시합니다.

마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

in vitro 에서 naive monocyte 유래 수지상 세포에서 내성 수지상 세포를 생성하는 약리학적 제제의 능력을 평가하고 자가 조절 T 세포 생성을 통해 그 효능을 검증하는 절차를 설명합니다.

인간 CD14+ 단핵구에서 톨러겐 수지상 세포 생성을 위한 면역조절제를 테스트하는 간단하고 효율적인 방법

배우세요 종양을 가진 마우스의 혈액과 종양에서 단핵구 유래 수지상 세포(MoDC)를 분리하는 방법을. 면역 복합체로 활성화하여 면역 자극 특성을 연구할 수 있습니다.

마우스 Monocyte 파생 된 모 수석 세포 및 종양 면역 단지와 활성화 후속 생체 외에서 그들의 격리 프로토콜

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