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신경과학
0 조회수 • 7:00 분 • July 8th, 2025
세포외 매트릭스 코팅 마이크로플레이트를 가져와 분화 배지에 현탁된 인간 만능 줄기 세포를 추가합니다.
배지에는 세포 신호 전달 경로에 영향을 미쳐 신경 전구 세포로의 분화를 지시하는 신호 분자가 포함되어 있습니다.
신경 및 비신경 세포의 전구체인 신경능선 세포(NCC)로의 분화를 유도하는 신호 분자를 포함하는 또 다른 분화 배지를 도입합니다.
효소를 첨가하여 기질을 파괴하여 세포를 해리시킵니다.
효소를 중화시키기 위해 세척한 다음 원심분리하여 상청액을 버립니다. NCC를 스페로이드 배지에 재현탁하고 마이크로플레이트로 옮깁니다.
배지의 성장 인자와 소분자는 스페로이드 형성을 유도합니다.
교감 신경 전구 뉴런으로의 분화를 촉진하는 레티노산을 보충합니다.
스페로이드를 교감 신경 성숙 배지의 접착 단백질로 코팅된 마이크로플레이트로 옮겨 스페로이드 부착을 유발합니다.
배지의 신경 성장 인자와 레티노산은 말초 신경계의 일부이고 비자발적 과정을 조절하는 신경절 후 교감 신경 뉴런으로의 성숙을 촉진합니다.
분화 유도 하루 전, 적절한 수의 6웰 플레이트를 웰당 2밀리리터의 기저막 매트릭스로 코팅하고 플레이트를 섭씨 4도에서 밤새 보관합니다. 다음날 아침, 플레이트를 실온으로 데우고 세척할 때마다 신선한 PBS로 즉시 분할할 수 있는 인간 만능 줄기 세포 배양물을 두 번 세척합니다.
두 번째 세척 후, 부유 인간 만능 줄기 세포를 흡인하고 수확된 세포를 50밀리리터 튜브로 옮기기 전에 세포 배양 인큐베이터에서 15분 동안 0.5밀리몰 EDTA 7밀리리터로 세포를 처리합니다.
튜브에 같은 부피의 PBS를 첨가하여 EDTA를 희석하고 원심분리로 세포를 수집합니다. 펠릿을 1밀리리터의 01일 분화 배지에 재현탁합니다. 계수를 위해 적절한 부피의 배지를 추가하기 전에, 웰당 2밀리리터의 분화 배지에서 세포를 평방 센티미터당 1.25 x 105 세포 농도로 희석합니다.
이전에 준비된 6웰 플레이트의 각 웰에서 모든 기저막 매트릭스 용액을 흡인합니다. 그런 다음 각 웰에 2밀리리터의 세포를 시드하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 다음날 아침, 웰당 3밀리리터의 01일 분화 배지를 세포에 공급합니다.
분화 2일째에 웰당 2일차 내지 10일차 분화 배지 3밀리리터를 세포에 공급합니다. 그런 다음 10일째까지 격일로 세포에 먹이를 줍니다. 신경능선 세포를 스페로이드로 응집시키기 위해, 10일째에 PBS로 세포를 세척하고, 각 웰
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