인간 만능 줄기 세포에서 신경절 후 교감신경 뉴런 생성

세포외 매트릭스 코팅 마이크로플레이트를 가져와 분화 배지에 현탁된 인간 만능 줄기 세포를 추가합니다.

배지에는 세포 신호 전달 경로에 영향을 미쳐 신경 전구 세포로의 분화를 지시하는 신호 분자가 포함되어 있습니다.

신경 및 비신경 세포의 전구체인 신경능선 세포(NCC)로의 분화를 유도하는 신호 분자를 포함하는 또 다른 분화 배지를 도입합니다.

효소를 첨가하여 기질을 파괴하여 세포를 해리시킵니다.

효소를 중화시키기 위해 세척한 다음 원심분리하여 상청액을 버립니다. NCC를 스페로이드 배지에 재현탁하고 마이크로플레이트로 옮깁니다.

배지의 성장 인자와 소분자는 스페로이드 형성을 유도합니다.

교감 신경 전구 뉴런으로의 분화를 촉진하는 레티노산을 보충합니다.

스페로이드를 교감 신경 성숙 배지의 접착 단백질로 코팅된 마이크로플레이트로 옮겨 스페로이드 부착을 유발합니다.

배지의 신경 성장 인자와 레티노산은 말초 신경계의 일부이고 비자발적 과정을 조절하는 신경절 후 교감 신경 뉴런으로의 성숙을 촉진합니다.

분화 유도 하루 전, 적절한 수의 6웰 플레이트를 웰당 2밀리리터의 기저막 매트릭스로 코팅하고 플레이트를 섭씨 4도에서 밤새 보관합니다. 다음날 아침, 플레이트를 실온으로 데우고 세척할 때마다 신선한 PBS로 즉시 분할할 수 있는 인간 만능 줄기 세포 배양물을 두 번 세척합니다.

두 번째 세척 후, 부유 인간 만능 줄기 세포를 흡인하고 수확된 세포를 50밀리리터 튜브로 옮기기 전에 세포 배양 인큐베이터에서 15분 동안 0.5밀리몰 EDTA 7밀리리터로 세포를 처리합니다.

튜브에 같은 부피의 PBS를 첨가하여 EDTA를 희석하고 원심분리로 세포를 수집합니다. 펠릿을 1밀리리터의 01일 분화 배지에 재현탁합니다. 계수를 위해 적절한 부피의 배지를 추가하기 전에, 웰당 2밀리리터의 분화 배지에서 세포를 평방 센티미터당 1.25 x 10⁵ 세포 농도로 희석합니다.

이전에 준비된 6웰 플레이트의 각 웰에서 모든 기저막 매트릭스 용액을 흡인합니다. 그런 다음 각 웰에 2밀리리터의 세포를 시드하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 다음날 아침, 웰당 3밀리리터의 01일 분화 배지를 세포에 공급합니다.

분화 2일째에 웰당 2일차 내지 10일차 분화 배지 3밀리리터를 세포에 공급합니다. 그런 다음 10일째까지 격일로 세포에 먹이를 줍니다. 신경능선 세포를 스페로이드로 응집시키기 위해, 10일째에 PBS로 세포를 세척하고, 각 웰에 해리 배지 2밀리리터를 첨가한다. 세포 배양 인큐베이터에서 20분 후, 부유 세포를 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 튜브의 현탁액 부피를 신선한 PBS로 50밀리리터로 가져옵니다.

원심분리에 의해 세포를 수집하고 계수를 위해 10일에서 14일째 스페로이드 배지의 충분한 부피에 펠릿을 재현탁합니다. 계수 후, 10일 내지 14일 스페로이드 배지를 사용하여 세포를 500마이크로리터 농도당 5 x 10⁵ 세포로 희석하고, 500마이크로리터의 세포를 초저부착 24웰 플레이트의 각 웰에 도금합니다. 그런 다음 세포를 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다.

최소한의 스페로이드 배양을 유도하기 위해, 배양 11일째에, 신경능선 스페로이드에 웰당 10일에서 14일째의 스페로이드 배지의 500마이크로리터를 추가로 공급한다. 12일째에 플레이트를 기울여 플레이트의 한쪽에 스페로이드를 축적하고 스페로이드를 흡인하지 않고 각 웰에서 가능한 한 많은 배지를 조심스럽게 흡인합니다. 그런 다음 웰당 10일에서 14일째 스페로이드 배지 1밀리리터를 스페로이드에 공급합니다.

15일째에 확장된 스페로이드 배양을 유도하기 위해, 웰당 0.5마이크로몰 레티노산이 보충된 1.5밀리리터의 10일 내지 14일 스페로이드 배지를 스페로이드에 공급한다. 그런 다음 스페로이드를 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다.

14일 또는 28일에 교감 신경 분화를 위해 플레이트를 기울여 플레이트의 한쪽에 스페로이드를 축적하고 가능한 한 많은 배지를 조심스럽게 흡인합니다. 세포에 1밀리리터의 교감 신경 배지를 공급합니다.

큰 스페로이드 응집체를 더 작은 스페로이드로 분해하려면 웰당 1밀리리터 이하의 배지를 추가하고 분할하기 전에 스페로이드를 5-10회 피펫팅합니다.

그리고 이전에 준비된 24웰 플레이트에서 과도한 라미닌 피브로넥틴을 제거합니다. 24웰 스페로이드 배양 플레이트의 각 웰에서 1밀리리터의 스페로이드를 새로 코팅된 24웰 플레이트의 4개의 개별 웰 사이에 분할합니다. 각 웰에 250마이크로리터의 신선한 교감 신경 신경 배지를 추가하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 다음날 아침, 각 웰의 배지를 0.125마이크로몰 레티노산이 보충된 교감 신경 배지 1밀리리터로 교체하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다. 35일 후, 각 웰에 있는 기존 배지의 절반만 신선한 배지로 조심스럽게 교체하여 뉴런에 영양을 공급합니다.