피더가 없고 화학적으로 정의된 배양 조건 하에서 인간 다능성 줄기 세포를 사용하여 후갱이온 교감 뉴런의 효율적인 분화

이 프로토콜에서, 우리는 인간 만능 줄기 세포에서 포스트 갱글리오닉 교감 뉴런의 생성을위한 안정적이고 매우 효율적인 분화 전략을 설명합니다. 이 모델은 여러 자율 장애의 연구의 사용을 위해 뉴런을 사용할 수 있게 합니다.

이 프로토콜은 인간의 다능성 줄기 세포에서 동정 신경의 파생을 허용합니다. 이 세포는 교감 신경계에 영향을 미치는 인간 적인 무질서를 공부하는 과학자를 가능하게 할 것입니다. 이 기술은 높은 확장 가능한 효율성에 분할 된 피더없는 회의 조건에서 공감 뉴런의 파생을 할 수 있습니다.

그것은 20 일에서 전기 활성 뉴런을 초래한다. 이 기술은 기능 장애 교감 신경계에 의한 질병에 적용될 수 있고, 또한 질병 모델링, 재생 의학 및 약물 검열에 사용될 수 있다. 이 세포는 공동 배양 시스템 내의 모든 조직을 혁신하기 위해 시험관에서 사용될 수 있습니다, 예를 들어, 심장 조직 조절의 연구를 위해.

인간 만능 줄기 세포 배양이 80 ~90%에 도달하면 매끄러운 밝은 가장자리를 가진 큰 식민지를 관찰해야 합니다. 분할을 위해, PBS로 배양을 씻는 것은 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 0.25 의 4밀리리터 EDTA로 세포를 치료하기 전에 세척합니다. 2 분 후, 10 밀리리터의 E8 배지로 플레이트를 플러시하고 분리 된 세포 현탁액을 15 밀리리터 원내 튜브로 옮기십시오.

그런 다음 500 마이크로리터의 세포를 신선한 E8 배지의 9.5 밀리리터 알리쿼트로 옮킨다. 그리고 줄기 세포를 새로운 vitronectin에 100 밀리미터 접시를 코팅접시에 접시. 분화 유도 하루 전에, 잘 당 지하 막 매트릭스의 두 밀리리터와 여섯 우물 플레이트의 적절한 수를 코팅.

그리고 하룻밤 사이에 접시를 섭씨 4도에 보관하십시오. 다음 아침, 접시를 실온으로 데우고 세척당 신선한 PBS로 인간의 다능줄기 세포 배양을 두 번 나눌 준비를 씻으시다. 두 번째 세척 후, 부동 인간 만능 줄기 세포를 심도및 수확 된 세포를 50 밀리리터 튜브로 옮기기 전에 세포 배양 인큐베이터에서 15 분 동안 0.5 밀리리터EDTA의 7 밀리리터로 세포를 치료하십시오.

EDTA를 희석하고 원심 분리에 의해 세포를 수집하기 위해 튜브에 PBS의 동일한 볼륨을 추가합니다. 회계에 대한 적절한 양의 매체를 추가하기 전에 01 분화 매체의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 세포를 1.25배 10번, 제곱센티미터 농도당 제5세포로 잘 분화 배지의 밀리리터로 희석한다.

이전에 준비된 각 웰에서 6개의 웰 플레이트로 지하 막 매트릭스 용액을 모두 흡인시킵니다. 그런 다음 세포의 2 밀리리터를 각각 우물로 씨앗을 넣고 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 다음 날 아침, 잘 당 하루 01 분화 매체의 3 밀리리터로 세포를 공급합니다.

분화의 둘째 날에, 잘 당 2 일 ~ 10 분화 매체의 3 밀리리터로 세포를 공급한 다음 10 일까지 세포를 매일 공급하십시오. 신경 문장 세포를 스페로이드로 집계하려면 10 일째에 PBS로 세포를 씻으세요. 그리고 각 우물에 해리 배지의 두 밀리리터를 추가합니다.

세포 배양 인큐베이터에서 20분 후, 부동 세포를 50밀리리터 원물 튜브로 옮기고 튜브내 서스펜션의 부피를 신선한 PBS로 50밀리리터로 가져온다. 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다. 그리고 계산을 위해 10 일 10 에서 14 스페로이드 배지의 충분한 부피로 펠릿을 다시 중단합니다.

계산 후, 세포를 500 마이크로리터 농도당 5배 10~5세포로 희석하여 10일에서 14일 스페로이드 배지를 사용한다. 그리고 초저 부착 24웰 플레이트의 각 우물에 셀 의 500 마이크로 리터를 플레이트. 그런 다음 세포를 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 보입니다.

최소한의 스페로이드 배양을 유도하기 위해, 문화의 11일째에, 신경 문장 스페로이드를 웰당 10~14일 의 마이크로리터 500마이크로리터로 공급한다. 12일째에 접시를 기울여 접시의 한쪽에 스페로이드를 축적합니다. 그리고 조심스럽게 스페로이드를 흡입하지 않고 각 우물에서 가능한 한 많은 매체를 흡인.

그런 다음 스페로이드를 1밀리리터로 10~14개의 스페로이드 배지로 잘 공급한다. 확장된 스페로이드 배양을 유도하기 위해, 15일째에, 10~14일의 1.5밀리리터로 스페로이드를 웰당 0.5 마이크로몰라 레티노산으로 보충한다. 그런 다음 세포 배양 인큐베이터에 스페로이드를 반환합니다.

공감 하는 뉴런 분화를 위해, 14 일 또는 28일에, 플레이트의 한쪽에 스페로이드를 축적하고 가능한 한 많은 매체를 신중하게 흡인하기 위해 접시를 기울입니다. 동정 신경 매체의 1 밀리 리터와 세포를 공급. 큰 스페로이드 응집체를 더 작은 스페로이드로 분해하려면 우물당 1밀리리터를 추가하고 스페로이드를 5~10회 피펫으로 분리합니다.

그리고 이전에 준비된 24웰 플레이트로부터 과도한 라미닌 섬유네크틴을 제거한다. 24웰 스페로이드 배양 플레이트의 각 우물에서 각각 의 1밀리리터의 스페로이드 플레이트를 새로운 코팅 된 24 웰 플레이트의 4 개의 별도 우물사이에 분할합니다. 각각의 우물에 신선한 공감 신경 매체의 250 마이크로 리터를 추가합니다.

및 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 다음 날 아침, 0.125 마이크로몰라 망토산으로 보충된 교감 신경 매체의 1밀리리터로 각각의 배지를 교체하고 판을 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 놓는다. 35일 후, 기존 배지의 절반만 신선한 배지로 조심스럽게 교체하여 뉴런을 먹이게 한다.

분화 하기 전에, 인간의 만능 줄기 세포 식민지 반짝, 부드러운 가장자리와 거의 또는 전혀 차별화와 둥근 해야 합니다. 세포는 4일부터 10일까지 신경 문장 마커 Sox10을 발현한다. 신경 문장 세포는 6 일째부터 볼 수있는 조밀 한 어두운 능선에서 나타납니다.

이 능선은 또한 Sox10을 표현합니다. 신경 문장 세포 단계에서 Sox10은 신경 문장 세포를 정렬하는 데 사용할 수있는 세포 표면 마커 CD49D와 상관 관계가 있습니다. 긍정적인 정렬 및 분류되지 않은 인구는 유사한 방식으로 신경 문장 스페로이드를 생산했습니다.

음의 정렬 된 세포가 제대로 집계되지 않지만, 둥글고 매끄러운 건강한 스페로이드를 생성하지 않고 3 ~ 4 일 이내에 죽습니다. 더욱이, 신경 문장 스페로이드를 14일째에 비교하면, 신경 문장및 교감 신경 전구 마커를 위한 정량적 역전사 PCR, 정렬된 세포와 분류되지 않은 세포 사이의 유의한 차이를 검출할 수 없다. 20 일 또는 35일, 각각의 최소 또는 확장 프로토콜, 신경증은 부착된 스페로이드로부터 방사형 패턴으로 성장하는 것을 관찰할 수 있다.

노르피네프린 합성 및 수송과 관련된 마커는 9개의 트렁크 신경 문장 유전자를 통해 Hox6뿐만 아니라 이 단계에서 발현됩니다. 전기 생리학적 기록은 또한 20일째부터 신경 활동을 감지합니다. 이러한 활동은 분화 된 뉴런의 기능을 조정 하는 공감 뉴런의 자동 수용체를 대상으로 하는 약물에 의해 강화 되거나 억제 될 수 있다.

인간 지지자 자신은 차별화의 제로 날에 시작 건강해야합니다, 그렇지 않으면, 실험은 가능성이 실패합니다. 약리학적 억제제 또는 활성화제는 그들의 정상 또는 병리학적 행동을 이해하기 위하여 뉴런에 추가할 수 있습니다. 이 방법은 인간에게서 동정하는 뉴런의 생검을 쉽게 얻는 것이 지금 가능하기 때문에 공감생물학과 병리학을 공부하기 위한 새로운 길을 엽니다.