Name: 피더가 없고 화학적으로 정의된 배양 조건 하에서 인간 다능성 줄기 세포를 사용하여 후갱이온 교감 뉴런의 효율적인 분화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 배우세요 인간 다능성 줄기 세포에서 후갱이온 교감 뉴런을 분화시키는 피더가 없는 고효율 프로토콜을. 20일 내에 전기 활성 뉴런을 생성하여 자율 신경 장애 연구와 질병 모델링에 활용할 수 있습니다.

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우리는 원고의 비판적 독서와 편집에 대한 하이디 울리히스에게 감사드립니다.

<ol><li>Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Familial+dysautonomia%3A+History%2C+genotype%2C+phenotype+and+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research.</a> Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).</li>
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<li>Kam, M. K., Lui, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Hoxb5+in+the+development+of+vagal+and+trunk+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Growth%2C+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells.</a> Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).</li>
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<li>Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insm1+%28IA-1%29+is+a+crucial+component+of+the+transcriptional+network+that+controls+differentiation+of+the+sympatho-adrenal+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage.</a> Development. 135 (3), Cambridge, England. 473-481 (2008).</li>
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<li>Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+sympathetic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells+with+a+defined+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12865(2018).</li>
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<li>Zeltner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+biology+of+disease+severity+in+a+PSC-based+model+of+familial+dysautonomia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia.</a> Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).</li>
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<li>Clements, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+multiwell+MEA+plates+for+neural+and+cardiac+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Neurophotonics%3B+Neural+Imaging+and+Sensing%3B+and+Optogenetics+and+Optical+Manipulation%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications.</a> Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

우리는 최근에 2개의 리뷰를 간행했습니다, 하나는 질병 모델링을 위한 hPSC 파생된 symn의 사용을토론하는 31 뿐만 아니라 유효한 분화 프로토콜22의심층적인 비교. 따라서 여기서는 관심 있는 연구원이 symN을 만드는 데 성공할 수 있도록 현재 프로토콜 문제 해결에 중점을 둡니다. 전체 분화 과정에서 건강한 분화 세포뿐만 아니라 일관된 데이터를 얻기 위해 모든 단계에서의 오염을 신중하게 제어해야합니다. 일상적인 hPSC 유지 보수에서, 마이코 플라즈마 테스트는 격주 또는 매월 수행해야합니다. 세포 선별이 10 일째에 수행되면 모든 배지에 항생제를 첨가하는 것이 매우 좋습니다. 분화를 시작하기 전과 후에 세포 형태를 확인하는 것도 중요합니다. 여기서는 몇 가지 중요한 체크포인트(그림 6A)를제안합니다. 첫째, 분화를 위한 이상적인 hPSC 콜로니는 작은 스파이크가 있는 밝고 매끄러운 가장...

포스트 갱글리오닉 교감 뉴런 (symN)은 자율 신경계 (ANS)에 속하며 의식과 무관하게 신체의 항상성을 반응하고 조절하는 데 여러 가지 중요한 역할을합니다. 예를 들어, 스트레스는 심박수를 자극하고 심박수, 혈압 및 발한의 증가로 이어지는 전투 또는 비행 반응을 불러일으킵니다. SymN은 유전학, 독성/상해 또는 다른 질병의 동반자로 인해 여러 인간 장애에 영향을 받습니다. 유전 신경병증의 예로는 심민의 심한 dysregulation이 호흡 곤란을 일으키는 유년기 무질서 가족 성 Dysautonomia (FD)가 있습니다, 땀나기, 피부의 얼룩, 구토 발작, 고혈압 및불안에의해 명백한 dysautonomic 위기. 독성의 예는 화학요법 치료이며, 이는 자율 신경세포에 독성 부작용이 있는 것으로 보고되었다2. 자율적 변성 및 하이퍼-내심성 모두 파킨슨병 또는 고혈압 신장 질환과 같은 질병을 유발하거나 동반할 수 있는 것으로 알려져있다3,4. 따라서, 연구를 수행하고 질병의 맥락에서 symN 생물학 및 결함의 메커니즘을 이해할 수있는 것은 신규하고 효과적인 치료의 검색에 도움이됩니다.
해부학 말초 신경계는 감각 및 자율 분열로 나뉩니다. 감각 신경계의 구심성 신경은 고통과 접촉의 감각에 책임 있는 반면, ANS는 두뇌에 모든 기관에서 정보를 중계하는 책임이 있습니다. ANS는 장신경계로 나뉘어져 있으며, 위장관, 이완에 중요한 부교감 신경계, 장기의 활성화/조절에 중요한 교감신경계(SNS)로 나뉩니다. SNS는 2개의 뉴런시스템을5. 척수에 있는 Preganglionic 교감 신경 축은 교감 신경절에 첫번째 프로젝트, 포스트 ganglionic symN 세포 바디가 있는 곳에. 이 뉴런은 바디에 있는 각 기관의 표적 조직을 안쪽에 긴 투영을 보냅니다. preganglionic 뉴런에 의해 전송 되는 신호는 해, 반면 preganglionic symN은 아드레날린 이며 따라서 표현 노르 (NE) 그들의 주요 신경 전달 물질으로. 혈관을 자극하는 것을 포함하여 해인 포스트 갱글리오닉, 교감 신경의 몇몇 주목할 만한 예외가 있습니다. 아드레날린 성 후 신경 세포는 효소 티로신 하이드록실라제 (TH), 방향족 L 아미노산 데카르박실라제 (AAAD), 도파민 β-하이드록실라제 (DBH), 모노 아민 산화효소 (MAO-A)를 발현하며, 모두 NE를 생성하고 대사하는 역할을합니다. 또한, 그들은 NE 재활용 수송기 및 / 또는 수용체 α-아드레날린 수용체 (ADRA2), β-아드레날린 수용체 (ADR2B), 노르 에피네프린 수송기 (NET1) 및 부식모아민 수송기 (VMAT1/2)를 발현합니다.
개발 배아 발달 시 심멘은 신경관과 오버레이 ectoderm6사이에 나타나는 신경 문장(NC)으로부터 유래되며, 멜라닌세포, 조골세포, 지방세포, 글리아, 장뉴런, 감각 뉴런 및 자율 신경 7을 포함하는 다중 세포 계보로 분화할 수있다. 신경 문장 세포 (NCC)는 배아를 통해서 몇몇 경로를 취하는 높게 철새 세포입니다. NC 개발의 이 초기 단계에서, 세포는 마커 SNAIL1/2, FOXD3 및 SOX108,9,,10,11을표현한다.9, 그들이 채택하는 축 위치와 함께 마이그레이션 경로는 개발할 NC 하위 유형을 결정합니다. 이러한 NC 아류형은 그들의 특이적 HOX 유전자 발현에 의해 구별될 수 있다: 두개골 NCC는 HOX 유전자를 발현하지 않으며, vagal NCC는 HOX 1-5를 발현하고, 트렁크 NCC는 HOX 6-9를 발현하고, 성례 NCC는 HOX 10-1112를발현한다. 그 중, 트렁크 NcC는 symN의 주요 소스로 인식된다. SymN 전구체는 PHOX2B14 및 INSM115의발현을 촉진하는 전사 인자 MASH1/ASCL113을발현한다. 전사 요인의 GATA 가족은 늦은 동정 발달 도중 표현됩니다. GATA2 및 GATA3는 SymN으로 표현되며, 이 시공은 DBH16을활성화합니다. 전사 계수 HAND2는 DBH 및 TH17의발현 및 유지에도 중요하다.
HPSCs(예를 들어, 배아 및 유도 만능 줄기 세포)는 발달 패러다임을 재현하고 다양한 인간 장애의 질병 모델링에 사용될 수 있는 symN을 생성하는 강력한 도구18입니다. 따라서 hPSC에서 symN을 생성하는 동안 개발 지침을 따르고 분화 과정을 따라 적절한 마커의 발현을 평가하는 것이 중요합니다.
이전 symN 프로토콜 몇몇 연구 단은 이전에 hPSCs19,,20,,21에서symN의 생성을 보고했습니다. 이러한 프로토콜을 서로 직접 비교하고 최근22일검토했습니다. 2016년23년,우리는 symN 문자를 가진 자율 뉴런의 생성을 위한 분화프로토콜을 발표했다(도 1A). 이 프로토콜은 미분화 hPSCs 및 세포 분화의 유지보수에 사용된 KSR 기반 배지를 사용하였다. 더욱이, hPSCs는 마우스 배아 섬유아세포(MEF 피더 세포)에서 유지되었다. 우리는 무질서23를모델링하기 위하여 FD를 가진 환자에게서 이 프로토콜 및 PSCs를 이용했습니다. 2019년에는 이 이전 프로토콜24의보다 자세한 버전을 설명했습니다. 요약하면, 신경 운명은 TGF-β 및 BMP 신호화를 처음 2일 동안 차단하기 위해 이중 SMAD억제(25)에 의해 유도되었다. CHIR99021을 이용한 WNT 활성화는 신경 전구를 NC 세포로 승진시켰다. 11일째에, 세포는 CD49D+ 또는+ SOX10+ 인구26,,23에대한 FACS에 의해 분류되었고, 이는 약 40%의 NC 생성 효율을 산출하였다. 따라서, 다음 분화 단계에 대한 효율 및 순도를 보장하기 위해 선별이 필요했다. NFC는 FGF2 및 CHIR의 결합된 처리와 함께 스페로이드로서 유지 및 증폭되었다. 4일 후, NC 스페로이드를 도금하고 BDNF, GDNF 및 NGF를 부여하여 symN 성숙을 완료하였습니다. 이러한 symN은 ASCL1, TH, DBH 및 PHOX2A와 같은 강한 symN 마커를 발현했지만, 니코틴 아세틸콜린 수용체(CHRNA3/CHRNB4) 및 소포 수송기(VMAT1/2)의 발현을 포함하여 보다 성숙한 symn에 대한 마커는 70일 후에도 분화의 일후에도 낮았다. 이 프로토콜에서 HOX 유전자는 공식적으로 시험되지 않았고, 세포의 전기 생리활성을 포함한 성숙한 신경 특성은 확인되지 않았다.
여기서는 symN(그림1B)을생성하기 위해 최적화된 프로토콜을 제시합니다. HPSC는 에센셜 8(E8)미디어(27)를사용하여 비트로넥틴(VTN) 코팅 접시상에서 피더가 없는 조건에서 유지된다. 분화 매체의 공식은 각 단계에서 수정되어 NC인구(28)의비율을 증가시킨다. symN 성숙은 CD49D+/SOX10+ 정렬되거나 정렬되지 않은 대량 NCC 모집단에서 수행할 수 있습니다. 둘 다 30일까지 높은 수준의 symN 마커 식을 보여줍니다. 더욱이, 이 프로토콜로 생성된 symN은 전기 생리학적 기록 및 symN 활성제 및 억제제 화합물을 사용한 치료에 반응한다.

<table><tbody><tr><td>100mm 세포 배양 접시</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>15mL 원뿔형 조직 배양 튜브</td><td>VWR/Corning</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>24웰 조직 배양 플레이트</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>24웰 초저 부착 플레이트</td><td>Corning</td><td>07 200 601 및 07 200 602</td><td></td></tr><tr><td>5% CO2/20% O2 조직 배양 인큐베이터</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>Heracell VIOS 160i</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원뿔형 조직 배양 튜브</td><td>VWR/Corning</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>6웰 조직 배양 플레이트</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovation Cell Technologies</td><td>AT104500</td><td>세포 해리 솔루션</td></tr><tr><td>Anti-AP2a 항체</td><td>Abcam</td><td>ab108311</td><td>숙주: 토끼;1:400 희석</td></tr><tr><td>항-Ascl1 항체</td><td>BD Pharmingen 556604</td><td></td><td>숙주: 마우스 IgG1; 1:200 희석</td></tr><tr><td>항-CD49D 항체</td><td>BioLegend</td><td>304313</td><td>숙주: 마우스 IgG1; 5 &mu; 100 &mu에 있는 l/백만 개의 세포; l 볼륨</td></tr><tr><td>안티 CD49D 항체 (isotype)</td> <td>BioLegend</td><td>400125</td><td>숙주 : 마우스 IgG1; 5 & 100 &mu에 있는 l/백만 개의 세포; l volume</td></tr><tr><td>DAPI dye</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1:1000 희석</td></tr><tr><td>Anti-DBH 항체</td><td>Immunostar</td><td>22806</td><td>숙주: 토끼; 1:500 희석</td></tr><tr><td>Anti-GFP 항체</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>숙주: Chicken; 1:1000 희석</td></tr><tr><td>Anti-HOXC9 항체</td><td>Abcam</td><td>ab50839</td><td>숙주: 마우스; 1:100 희석</td></tr><tr><td>Anti-NET1 항체</td><td>Mab</td><td>NET17-1</td><td>호스트: 마우스; 1:1000 희석</td></tr><tr><td>Anti-PRPH 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-377093/H0112</td><td>호스트: 마우스 IgG2a; 1:200 희석</td></tr><tr><td>Anti-SOX10 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-365692</td><td>호스트: 마우스 IgG1; 1:100 희석</td></tr><tr><td>Anti-TH 항체</td><td>Pel-Freez</td><td>P40101- 150</td><td>호스트: 토끼; 1:500 희석</td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma</td><td>A8960-5G</td><td>재고 농도: 100 mM</td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>12587-010</td><td>재고 농도: 50x</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R& D 시스템</td><td>248-BD</td><td>재고 농도 : 10 & g/mL</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP</td><td>재고 농도: 6 mM</td></tr><tr><td>세포 계수기</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>Countess II</td><td></td></tr><tr><td>세포 계수 챔버 슬라이드</td><td>Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>57021& 5424R</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>R& D Systems</td><td>4423</td><td>재고 농도: 6mM</td></tr><tr><td>Cryo-vial</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>375353</td><td></td></tr><tr><td>dbcAMP</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>재고 농도: 100mM</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>10829-018</td><td>재고 농도: 1x</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>재고 농도: 1x</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>E6 매체</td><td>gibco</td><td>A15165-01</td><td></td></tr><tr><td>E8 매체</td><td>gibco</td><td>A15169-01</td><td>재고 농도: 1x</td></tr><tr><td>E8 supplement</td><td>gibco</td><td>A15171-01</td><td>재고 농도: 50x</td></tr><tr><td>EDTA</td><td></td><td>Sigma ED2SS</td><td>재고 농도: 0.5 M</td></tr><tr><td>전기생리학 플레이트(AXION cytoview MEA96)</td><td>Axion BioSystems</td><td>M768-tMEA-96W</td><td></td></tr><tr><td>FACS 기계</td><td>, Beckman Coulter</td><td>CytoFLEX(FACS용)</td><td></td></tr><tr><td>FACS 기계</td><td>, Beckman Coulter</td><td>MoFlo Astrios EQ(분류용)</td><td></td></tr><tr><td>FACS 튜브(파란색 필터 캡)</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FACS 튜브(흰색 캡)</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청 (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PeproTech</td><td>450</td><td>재고 농도: 10 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Invitrogen</td><td>A1413202</td><td>기저막 매트릭스; 재고 농도: 100x</td></tr><tr><td>hPSCs</td><td>Thomson et al., (1998)</td><td>WA09</td><td></td></tr><tr><td>hPSCs</td><td>Oh et al. (2016)</td><td>H9-PHOX2B::eGFP</td><td></td></tr><tr><td>Human fibronectin (FN)</td><td>VWR/Corning</td><td>47743-654</td><td>재고 농도: 1 mg/mL</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Thermo Fisher/Gibco</td><td>25030-081</td><td>재고 농도: 200 mM</td></tr><tr><td>LN 탱크</td><td>맞춤형 바이오 제닉 시스템</td><td>V-1500AB</td><td></td></tr><tr><td>MEA 리더</td><td>Axion BioSystems</td><td>Maestro Pro</td><td></td></tr><tr><td>마우스 라미닌 I (LM)</td><td>R& D Systems</td><td>3400-010-01</td><td>재고 농도: 1 mg/mL</td></tr><tr><td>N2 보충제</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>재고 농도: 100x</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>gibco</td><td>21103-049</td><td>재고 농도: 1x</td></tr><tr><td>NGF</td><td>PeproTech</td><td>450-01</td><td>재고 농도: 25 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td>재고 농도: 1x</td></tr><tr><td>폴리-L-오르니틴 브롬화 수소화물(PO)</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td>재고 농도: 15mg/mL</td></tr><tr><td>프리모신(항생제)</td><td>InvivoGen</td><td>ANTPM1</td><td>재고 농도: 50mg/mL</td></tr><tr><td>qPCR 기계</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>C1000 Touch</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 플레이트</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>재조합 FGF2</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB / CF</td><td>재고 농도 : 10 & g/mL</td></tr><tr><td>레티노산</td><td>시그마</td><td>R2625</td><td>재고 농도: 1mM</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris/R& D Systems</td><td>1614</td><td>재고 농도: 10mM</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Corning</td><td>MT-25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin (VTN)</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>A14700</td><td>재고 농도: 0.5mg/mL</td></tr><tr><td>수조</td><td>VWR/Corning</td><td>706308</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>R& D Systems</td><td>1254</td><td>재고 농도: 10 mM</td></tr></tbody></table>

피더가 없고 화학적으로 정의된 배양 조건 하에서 인간 다능성 줄기 세포를 사용하여 후갱이온 교감 뉴런의 효율적인 분화

Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)는 시험관 내에서 인간 배아 발달의 질병 모델링 및 연구를위한 강력한 도구가되었습니다. 우리는 이전에 자율 신경 병증을 가진 환자에 적용된 교감 특성을 가진 자율 신경의 파생을 위한 분화 프로토콜을 제시했습니다. 그러나, 프로토콜은 녹아웃 세럼 교체(KSR) 및 피더 기반 배양 조건에 기초하여 구축되었으며, 높은 분화 효율을 보장하기 위해, 세포 선별이 필요하였다. 이러한 요인으로 인해 가변성이 높고 비용이 높으며 재현성이 낮습니다. 또한 전기 활성을 포함한 성숙한 교감 특성은 확인되지 않았습니다. 여기서는 피더가 없고 화학적으로 정의된 배양 조건에서 PSC 배양 및 분화를 수행하는 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 트렁크 신경 문장을 식별하는 유전 마커가 식별됩니다. 세포 선별없이 20 일 후에 후 신경절 교감 뉴런으로의 추가 분화가 달성됩니다. 전기 생리학적 기록은 기능적 뉴런 정체성을 더 나타낸다. 우리의 분화 된 뉴런에서 검출 된 발사니코틴에 의해 강화 될 수 있으며 아드레날린 수용체 길항제 프로프라놀롤에 의해 억제 될 수있다. 이 프로토콜의 중간 교감 신경 전구체는 최대 2주 동안 신경 구형으로서 유지될 수 있으며, 이는 배양을 확장할 수 있게 한다. 요약하면, 우리의 업데이트 된 교감 신경 분화 프로토콜은 이전 버전에 비해 높은 분화 효율, 더 나은 재현성, 더 많은 유연성 및 더 나은 신경 성숙을 보여줍니다. 이 프로토콜은 자율 신경계에 영향을 미치는 인간의 장애를 연구하는 데 필요한 세포를 연구원에게 제공 할 것입니다.

이 프로토콜에서는 hPSC에서 symN을 생성하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 여기서 입증된 배양 조건은 이전에 발표된 프로토콜23,,24(도 1A)로부터피더프리 및 화학적으로 정의된 조건으로 개선되었다(도1B). 2개의 옵션이 제공되며, 하나는 20일 이내에 심즈를 만들고 다른 하나는 NCC를 확장하여 더 많은 셀을 생성한 다음 symN으로 분화할 수있습니다(그림 1B,옵션 1 및 2).
분화 된 세포의 symN 특성을 적절하게 모니터링하기 위해, PHOX2B-eGFP WA09 리포터 라인과 부모 WA09 PSCs 라인19. 모든 분화는 적어도 3개의 생물학적 반복에서 ...

이 프로토콜에서, 우리는 인간 만능 줄기 세포에서 포스트 갱글리오닉 교감 뉴런의 생성을위한 안정적이고 매우 효율적인 분화 전략을 설명합니다. 이 모델은 여러 자율 장애의 연구의 사용을 위해 뉴런을 사용할 수 있게 합니다.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously ...

이 프로토콜은 인간의 다능성 줄기 세포에서 동정 신경의 파생을 허용합니다. 이 세포는 교감 신경계에 영향을 미치는 인간 적인 무질서를 공부하는 과학자를 가능하게 할 것입니다. 이 기술은 높은 확장 가능한 효율성에 분할 된 피더없는 회의 조건에서 공감 뉴런의 파생을 할 수 있습니다.그것은 20 일에서 전기 활성 뉴런을 초래한다. 이 기술은 기능 장애 교감 신경계에 의한 질병에 적용될 수 있고, 또한 질병 모델링, 재생 의학 및 약물 검열에 사용될 수 있다. 이 세포는 공동 배양 시스템 내의 모든 조직을 혁신하기 위해 시험관에서 사용될 수 있습니다, 예를 들어, 심장 조직 조절의 연구를 위해.인간 만능 줄기 세포 배양이 80 ~90%에 도달하면 매끄러운 밝은 가장자리를 가진 큰 식민지를 관찰해야 합니다. 분할을 위해, PBS로 배양을 씻는 것은 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 0.25 의 4밀리리터 EDTA로 세포를 치료하기 전에 세척합니다. 2 분 후, 10 밀리리터의 E8 배지로 플레이트를 플러시하고 분리 된 세포 현탁액을 15 밀리리터 원내 튜브로 옮기십시오.그런 다음 500 마이크로리터의 세포를 신선한 E8 배지의 9.5 밀리리터 알리쿼트로 옮킨다. 그리고 줄기 세포를 새로운 vitronectin에 100 밀리미터 접시를 코팅접시에 접시. 분화 유도 하루 전에, 잘 당 지하 막 매트릭스의 두 밀리리터와 여섯 우물 플레이트의 적절한 수를 코팅.그리고 하룻밤 사이에 접시를 섭씨 4도에 보관하십시오. 다음 아침, 접시를 실온으로 데우고 세척당 신선한 PBS로 인간의 다능줄기 세포 배양을 두 번 나눌 준비를 씻으시다. 두 번째 세척 후, 부동 인간 만능 줄기 세포를 심도및 수확 된 세포를 50 밀리리터 튜브로 옮기기 전에 세포 배양 인큐베이터에서 15 분 동안 0.5 밀리리터EDTA의 7 밀리리터로 세포를 치료하십시오.EDTA를 희석하고 원심 분리에 의해 세포를 수집하기 위해 튜브에 PBS의 동일한 볼륨을 추가합니다. 회계에 대한 적절한 양의 매체를 추가하기 전에 01 분화 매체의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 세포를 1.25배 10번, 제곱센티미터 농도당 제5세포로 잘 분화 배지의 밀리리터로 희석한다.이전에 준비된 각 웰에서 6개의 웰 플레이트로 지하 막 매트릭스 용액을 모두 흡인시킵니다. 그런 다음 세포의 2 밀리리터를 각각 우물로 씨앗을 넣고 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 다음 날 아침, 잘 당 하루 01 분화 매체의 3 밀리리터로 세포를 공급합니다.분화의 둘째 날에, 잘 당 2 일 ~ 10 분화 매체의 3 밀리리터로 세포를 공급한 다음 10 일까지 세포를 매일 공급하십시오. 신경 문장 세포를 스페로이드로 집계하려면 10 일째에 PBS로 세포를 씻으세요. 그리고 각 우물에 해리 배지의 두 밀리리터를 추가합니다.세포 배양 인큐베이터에서 20분 후, 부동 세포를 50밀리리터 원물 튜브로 옮기고 튜브내 서스펜션의 부피를 신선한 PBS로 50밀리리터로 가져온다. 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다. 그리고 계산을 위해 10 일 10 에서 14 스페로이드 배지의 충분한 부피로 펠릿을 다시 중단합니다.계산 후, 세포를 500 마이크로리터 농도당 5배 10~5세포로 희석하여 10일에서 14일 스페로이드 배지를 사용한다. 그리고 초저 부착 24웰 플레이트의 각 우물에 셀 의 500 마이크로 리터를 플레이트. 그런 다음 세포를 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 보입니다.최소한의 스페로이드 배양을 유도하기 위해, 문화의 11일째에, 신경 문장 스페로이드를 웰당 10~14일 의 마이크로리터 500마이크로리터로 공급한다. 12일째에 접시를 기울여 접시의 한쪽에 스페로이드를 축적합니다. 그리고 조심스럽게 스페로이드를 흡입하지 않고 각 우물에서 가능한 한 많은 매체를 흡인.그런 다음 스페로이드를 1밀리리터로 10~14개의 스페로이드 배지로 잘 공급한다. 확장된 스페로이드 배양을 유도하기 위해, 15일째에, 10~14일의 1.5밀리리터로 스페로이드를 웰당 0.5 마이크로몰라 레티노산으로 보충한다. 그런 다음 세포 배양 인큐베이터에 스페로이드를 반환합니다.공감 하는 뉴런 분화를 위해, 14 일 또는 28일에, 플레이트의 한쪽에 스페로이드를 축적하고 가능한 한 많은 매체를 신중하게 흡인하기 위해 접시를 기울입니다. 동정 신경 매체의 1 밀리 리터와 세포를 공급. 큰 스페로이드 응집체를 더 작은 스페로이드로 분해하려면 우물당 1밀리리터를 추가하고 스페로이드를 5~10회 피펫으로 분리합니다.그리고 이전에 준비된 24웰 플레이트로부터 과도한 라미닌 섬유네크틴을 제거한다. 24웰 스페로이드 배양 플레이트의 각 우물에서 각각 의 1밀리리터의 스페로이드 플레이트를 새로운 코팅 된 24 웰 플레이트의 4 개의 별도 우물사이에 분할합니다. 각각의 우물에 신선한 공감 신경 매체의 250 마이크로 리터를 추가합니다.및 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 다음 날 아침, 0.125 마이크로몰라 망토산으로 보충된 교감 신경 매체의 1밀리리터로 각각의 배지를 교체하고 판을 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 놓는다. 35일 후, 기존 배지의 절반만 신선한 배지로 조심스럽게 교체하여 뉴런을 먹이게 한다.분화 하기 전에, 인간의 만능 줄기 세포 식민지 반짝, 부드러운 가장자리와 거의 또는 전혀 차별화와 둥근 해야 합니다. 세포는 4일부터 10일까지 신경 문장 마커 Sox10을 발현한다. 신경 문장 세포는 6 일째부터 볼 수있는 조밀 한 어두운 능선에서 나타납니다.이 능선은 또한 Sox10을 표현합니다. 신경 문장 세포 단계에서 Sox10은 신경 문장 세포를 정렬하는 데 사용할 수있는 세포 표면 마커 CD49D와 상관 관계가 있습니다. 긍정적인 정렬 및 분류되지 않은 인구는 유사한 방식으로 신경 문장 스페로이드를 생산했습니다.음의 정렬 된 세포가 제대로 집계되지 않지만, 둥글고 매끄러운 건강한 스페로이드를 생성하지 않고 3 ~ 4 일 이내에 죽습니다. 더욱이, 신경 문장 스페로이드를 14일째에 비교하면, 신경 문장및 교감 신경 전구 마커를 위한 정량적 역전사 PCR, 정렬된 세포와 분류되지 않은 세포 사이의 유의한 차이를 검출할 수 없다. 20 일 또는 35일, 각각의 최소 또는 확장 프로토콜, 신경증은 부착된 스페로이드로부터 방사형 패턴으로 성장하는 것을 관찰할 수 있다.노르피네프린 합성 및 수송과 관련된 마커는 9개의 트렁크 신경 문장 유전자를 통해 Hox6뿐만 아니라 이 단계에서 발현됩니다. 전기 생리학적 기록은 또한 20일째부터 신경 활동을 감지합니다. 이러한 활동은 분화 된 뉴런의 기능을 조정 하는 공감 뉴런의 자동 수용체를 대상으로 하는 약물에 의해 강화 되거나 억제 될 수 있다.인간 지지자 자신은 차별화의 제로 날에 시작 건강해야합니다, 그렇지 않으면, 실험은 가능성이 실패합니다. 약리학적 억제제 또는 활성화제는 그들의 정상 또는 병리학적 행동을 이해하기 위하여 뉴런에 추가할 수 있습니다. 이 방법은 인간에게서 동정하는 뉴런의 생검을 쉽게 얻는 것이 지금 가능하기 때문에 공감생물학과 병리학을 공부하기 위한 새로운 길을 엽니다.

efficient-differentiation-postganglionic-sympathetic-neurons-using

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 인간의 연결을 progenitors 및 신경 수리 개발 CNS에의 연결을 세포 유형의 대형 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 neuroblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

만능 인간 줄기 세포의 neuronal 차별화 (hPSCs)에 대한 프로토콜은 종종 시간이 소요되어 있으며 상당한 세포 배양 기술을 필요로합니다. 여기, 우리는 통제 된 방식으로 인간의 뉴런의 간단 신속하고 효율적인 생성을 허용하는 multititre 판 형식으로 작은 분자 기반의 차별화 절차를 적응하고 있습니다.

Multititre 판 형식으로 인간 만능의 줄기 세포에서 뉴런의 신속하고 효율적인 생성

이 비디오는 인간 만능 줄기 세포(hPSC)에서 신경절 후 교감신경 뉴런을 생성하는 시험관 내 방법을 보여줍니다. hPSC는 분화 배지를 사용하여 기저막 매트릭스 지지체에서 신경능선 세포(NCC)로 분화됩니다. 그런 다음 NCC는 해리되고 다른 분화 매체를 사용하여 스페로이드로 형성됩니다. 마지막으로, 스페로이드는 교감신경 매질을 사용하여 신경절 후 교감신경 뉴런으로 변형됩니다.

인간 만능 줄기 세포에서 신경절 후 교감신경 뉴런 생성

이 비디오는 비형질전환 및 형질전환 인간 만능 줄기세포(hPSC)에서 신경전구세포의 생성을 보여줍니다. hPSC는 신경세포 분화 배지를 사용하여 신경전구세포로 분화됩니다. 분화는 작은 분자를 사용하여 비형질전환 세포에서 유도되는 반면, 형질전환 hPSC는 뉴런 분화 특이적 전사 인자를 위해 프로모터를 유도하는 항생제를 첨가하여 분화됩니다.

Non-Transgenic 및 Transgenic Human Pluripotent Stem Cells into Neural Progenitor Cells (비유전자 변형 및 형질전환 인간 만능 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화)

이 비디오는 인간의 iPSC를 운동 뉴런으로 분화하는 과정을 보여줍니다. 그 이유는 특정 전사 인자를 발현하기 위해 유전적으로 변형된 iPSC를 활용하는 것입니다. 독시사이클린을 함유한 배지에서 배양하면 이 항생제는 전사 인자의 발현을 유발하여 운동 뉴런 전구체로의 iPSC 분화를 촉진합니다. 궁극적으로, 전구 세포는 성숙하고 기능적인 운동 뉴런을 생성하기 위해 뉴런 배지에서 배양됩니다.

공학적 인간 유도 만능 줄기세포를 기능적 운동 뉴런으로 분화시키기

우리는 발달 생물학의 지식과 발표된 연구를 바탕으로 인간 배아 줄기 세포와 인간 유도 만능 줄기 세포 모두에서 A9 중뇌 도파민 뉴런을 효율적으로 생성할 수 있는 최적화된 프로토콜을 개발했으며, 이는 파킨슨병에 대한 질병 모델링 및 세포 대체 요법에 유용할 것입니다.

인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

분화된 인간 신경 줄기세포(hNSCs)에서 miRNA의 변화를 특성화하기 위한 목적으로 3차원 시스템에서의 hNSC 분화, miRNA PCR 어레이에 의한 microRNA 발현 변화 평가, miRNA 표적 예측을 위한 컴퓨터 분석 및 이중 루시페라제 분석에 의한 검증에 대해 설명합니다.

3 차원 문화, 마이크로 RNA의 분석 및 추정 적 표적 유전자에 인간의 신경 줄기 세포 라인의 차별화

이 프로토콜은 이전에 여러 주 동안 시험관 내 신경 전구체로부터 분화 된 인간 줄기 세포 유래 뉴런을 재중단하고 배양하기위한 상세한 절차를 설명합니다. 이 절차는 경질 현미경 검사법 및 고함량 스크리닝과 호환되는 형식으로 neurites, 시냅스 및 늦게 발현되는 뉴런 마커의 이미징 기반 검술을 용이하게 합니다.

신형성 및 시냅스 성숙의 고함량 스크리닝을 위한 인간 다능성 줄기 세포 유래 뉴런의 분화 후 리포팅

여기서 제시된 것은 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 배양및 이들의 후속 분화를 신경 전구 세포로 의하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 간단하고 견고하며 확장 가능하며 약물 스크리닝 및 재생 의학 응용 분야에 적합합니다.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

우리는 척수 인간 유도 만능 유래 성상 세포와 뉴런을 구별하는 방법과 전기 생리 학적 기록을위한 이들의 공동 배양을 설명합니다.

지역별 인간 만능줄기세포 유래 성상세포 및 뉴런을 이용한 ALS 모델링을 위한 전기생리학적 플랫폼 구축

인간 만능 줄기 세포(hPSC)에서 장 신경계(ENS) 계통을 추출하면 ENS 발병 및 질병을 연구하고 재생 의학에 사용할 수 있는 확장 가능한 세포 소스를 얻을 수 있습니다. 여기에서는 화학적으로 정의된 배양 조건을 사용하여 hPSC에서 장 뉴런을 유도하기 위한 자세한 in vitro 프로토콜이 제시됩니다.

Differentiation of Enteric Nervous System Lineages from Human Pluripotent Stem Cells(인간 만능줄기세포와 장 신경계 계통의 분화)

배우세요 인간 다능성 줄기 세포에서 후갱이온 교감 뉴런을 분화시키는 피더가 없는 고효율 프로토콜을. 20일 내에 전기 활성 뉴런을 생성하여 자율 신경 장애 연구와 질병 모델링에 활용할 수 있습니다.

피더가 없고 화학적으로 정의된 배양 조건 하에서 인간 다능성 줄기 세포를 사용하여 후갱이온 교감 뉴런의 효율적인 분화

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