마우스 망막에서 얻은 Müller Glial 세포 배양 확립

뮐러 글리알 또는 MG 세포와 뉴런을 포함하는 마우스 망막을 취하십시오.

소화 효소가 있는 해리 용액에 넣고 효소가 균일하게 분포되도록 부드럽게 흔들면서 배양합니다.

이 효소는 세포외 기질을 분해하여 개별 세포를 분리합니다.

망막을 위아래로 여러 번 피펫팅하여 세포를 방출합니다.

소 활성을 멈추기 위해 억제제를 첨가한 다음 원심분리합니다.

상청액을 버리십시오.

MG 세포에 특이적인 성장 인자를 포함하는 배지에 세포를 재현탁합니다.

세포를 웰로 옮기고 배양합니다.

시간이 지남에 따라 배지의 성장 인자는 MG 세포의 성장과 증식을 촉진하는 반면 분열하지 않는 신경 세포는 소멸합니다.

미디어를 제거합니다. 소금 완충액으로 씻으십시오.

소화 효소와 함께 배양하여 웰에서 세포를 분리합니다.

튜브에 세포를 모은 다음 원심분리합니다.

죽은 신경 세포가 포함된 상청액을 버립니다.

추가 분석을 위해 MG 세포를 배지에 재현탁합니다.

원고에 설명된 대로 파파인 DNase I 해리 혼합물을 준비합니다. 이제 팁이 확대된 이송 피펫을 사용하여 망막을 집어 들습니다. 망막이 팁 바닥에 가라앉을 때까지 기다렸다가 과도한 HBSS 없이 망막을 파파인 DNase I 혼합물이 들어 있는 튜브에 방출합니다.

그런 다음 튜브를 인큐베이터의 장식물에 놓고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 1밀리리터 피펫으로 위아래로 조심스럽게 피펫팅하여 세포를 해리합니다. 세포가 해리된 후 파파인 해리 키트에서 275마이크로리터의 오보무코이드 프로테아제 억제제를 첨가하여 파파인을 중화시키고 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.

튜브를 원심분리기에 넣고 상대 원심력 300에서 섭씨 4도에서 8분 동안 회전시킵니다. 섭씨 37도에서 예열된 성장 배지의 계산된 부피에 표피 성장 인자를 추가합니다. 원심분리기에서 튜브를 조심스럽게 제거합니다.

튜브 바닥의 펠릿을 만지지 않고 상청액을 조심스럽게 완전히 제거합니다. 이제 세포 펠릿을 500마이크로리터의 표피 성장 인자 보충 성장 배지로 재현탁합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 표지된 12웰 플레이트의 한 웰로 옮깁니다. 표피 성장 인자가 보충된 성장 배지 500마이크로리터로 튜브를 헹구고 웰에 추가합니다.

웰 플레이트를 조심스럽게 흔듭니다. 그런 다음 플레이트를 이산화탄소와 함께 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다. 90%에서 100%의 세포 융합성을 확인하는 것부터 시작합니다. 다음으로 배지를 제거하고 차가운 HBSS 1밀리리터를 넣어 우물을 씻습니다. 플레이트를 부드럽게 흔들고 흔적이 남지 않고 HBSS를 제거합니다.

나중에 예열된 트립신 함유 용액 500마이크로리터를 첨가하여 웰에서 세포를 분리합니다. 부드럽게 흔들어 섭씨 37도 인큐베이터에서 2분 동안 배양합니다. 플레이트를 인큐베이터에서 생물안전 캐비닛으로 옮긴 후 기울인 상태에서 트립신 함유 용액을 흡인합니다. 세포가 완전히 분리될 때까지 우물 위에 여러 번 조심스럽게 천천히 분산시킵니다.

그런 다음 이 세포 현탁액을 멸균 1.5밀리리터 튜브로 옮기고 튜브를 원심분리기에 넣습니다. 섭씨 4도에서 8분 동안 300g으로 회전한 다음 튜브를 생물 안전 캐비닛으로 다시 가져옵니다. 펠릿을 건드리지 않고 상청액을 제거합니다. 이제 600마이크로리터의 예열된 성장 배지를 추가하고 약 30-40회 위아래로 피펫팅하여 세포 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다.