Imaging and Quantification of Protein Aggregates in Genetically Modified Drosophila Brains (유전자 변형 초파리 뇌에서 단백질 응집체의 이미징 및 정량화)

유전자 변형 초파리 뇌부터 시작하십시오. 이 뇌는 주변 신경교세포로 퍼질 수 있는 뉴런에서 빨간색 형광 태그가 부착된 돌연변이 단백질을 발현하여 노란색 형광 태그가 부착된 정상 단백질을 발현하여 응집을 일으킵니다.

세포 무결성을 보존하는 고정액을 추가합니다.

고정액을 제거하고 완충액으로 세척합니다.

퇴색 방지 시약을 첨가하고 인큐베이팅하여 형광 신호의 퇴색을 방지합니다.

뇌를 슬라이드 위로 옮기고 과도한 액체를 제거합니다.

뇌가 슬라이드에 달라붙도록 하십시오.

커버슬립의 작은 조각을 스페이서로 사용하여 그 위에 커버슬립을 놓습니다. 퇴색 방지 시약을 넣고 밀봉합니다.

공초점 현미경에서 적색 및 황색 형광에 대해 서로 다른 여기 파장을 사용하여 이미지를 캡처합니다.

이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 단백질 응집체를 정량화합니다.

적색과 노란색 형광의 공동 국소화는 돌연변이 단백질의 확산을 나타냅니다.

모든 뇌를 해부한 후 수집 튜브를 실온의 장동으로 옮기고 약 5분 동안 흔듭니다. 고정 기간이 지나면 P1000 피펫을 사용하여 고정액의 대부분을 제거하고 뇌를 튜브에 남겨두도록 매우 주의하면서 폐기합니다. 이를 위해서는 부드러운 흡입과 주의 깊은 관찰이 필요합니다.

다음으로, 신선한 PBST 1밀리리터를 뇌에 추가합니다. 튜브를 덮고 약 1분 동안 장동 위에서 흔들어 남은 고정액을 씻어냅니다. 그런 다음 용액을 제거하고 이 짧은 세척 단계를 반복합니다.

짧은 세탁 2회 후 5분 세척 1회, 20분 세척 3회, 마지막으로 1시간 세척 1회 진행합니다. 마지막 세척 후 대부분의 PBST를 조심스럽게 제거하고 뇌를 30마이크로리터의 글리세롤 기반 퇴색 방지 시약에 담급니다. 그런 다음 뇌를 암울한 곳에서 1-24시간 동안 움직이지 않고 섭씨 4도에서 배양합니다.

나중에 무딘 피펫 팁을 사용하여 수집 튜브에서 뇌를 제거하고 현미경 슬라이드로 옮깁니다. 그런 다음 겸자를 사용하여 이미징을 위해 필요에 따라 뇌의 방향을 부드럽게 조정합니다. 여러 샘플을 동일한 슬라이드에 별도의 행으로 장착할 수 있습니다.

다음으로, 접힌 실험실 조직의 모서리를 사용하여 슬라이드에서 과도한 퇴색 방지 시약을 제거합니다. 조직이 뇌에 닿지 않도록 하십시오. 그런 다음 샘플을 어둠 속에 5-10분 동안 두어 뇌가 슬라이드에 부착되도록 합니다.

다음으로, 깨진 덮개 유리의 작은 조각을 가져다가 뇌 주위에 배치하여 약 19제곱밀리미터의 영역을 덮습니다. 그런 다음 22제곱밀리미터 커버 유리를 뇌와 유리의 모자이크 위로 부드럽게 내려 브릿지 마운트를 만듭니다. 그런 다음 커버슬립 아래에 새로운 퇴색 방지 시약을 천천히 분배하여 빈 공간을 채웁니다. 뇌와 유리가 제자리에 유지되도록 매우 조심스럽게 수행하십시오. 그런 다음 매니큐어로 커버슬립을 밀봉합니다. 먼저 모서리에 바르기만 하면 됩니다. 모서리를 가볍게 두드린 후 가장자리를 따라 밀봉을 완료하기 전에 5-10분 동안 말리십시오. 뇌는 가능한 한 빨리 이미지화되어야 합니다.

40x 또는 63x 오일 대물렌즈가 장착된 공초점 현미경을 사용하여 장착된 뇌를 이미지화하여 이식유전자가 발현되는 뇌 영역에서 z-슬라이스를 수집합니다. 그런 다음 개별 z-슬라이스에서 누점을 정량화하거나 슬라이스를 3차원으로 렌더링한 후 데이터를 분석합니다.

잘 분리되고 배경 신호가 거의 없는 돌연변이 헌팅턴 응집체를 정량화하려면 3D 보기 모드에서 공초점 z-시리즈를 엽니다. 그런 다음 분석 마법사를 사용하여 선택한 채널의 개별 스폿을 식별합니다.

설정에서 임계값 및 필터를 조정하여 이기종 크기의 모든 집계를 이미지의 개별 개체로 정확하게 표현합니다. 그런 다음 Binary Processing Pre-Filter에서 Split Objects를 활성화하여 밀접하게 연결된 애그리게이트를 분리합니다. 소프트웨어에 의해 식별된 개체에 대한 정량적 정보는 측정 아래에 보고됩니다.

점점을 계산한 후 이미지 분석 소프트웨어에서 추가로 특성화합니다. 예를 들어, 스폿 또는 표면에 대한 관련 측정을 수행하여 골재 직경, 부피 또는 강도 정보를 얻습니다. 일부 야생형 헌팅턴 응집체는 z-스택을 통해 수동으로 이동하고 주변 확산 신호와 구별할 수 있는 녹색 점점을 계산하여 정량화할 수 있습니다.

단일 집계가 둘 이상의 슬라이스에 나타날 때 두 번 계산하지 않도록 주의하십시오. 또 다른 관심 분석은 Huntington Q25-YFP와 Huntington Q91-mCherry 응집체 간의 공동 국소화 빈도를 결정하는 것입니다. 공초점 z-스택을 통해 슬라이스별로 이동하여 수동 계산을 사용하여 이 작업을 수행합니다.