쥐 뇌의 다양한 세포 내 구획에서 프로테아솜 활동 측정

조군 쥐와 공포 조건 쥐의 뇌 외측 편도체에서 수집된 세포내 핵 및 시냅스 분획으로 시작합니다.

각 세포 내 분획에는 원치 않는 세포 단백질을 분해하는 프로테아좀 복합체의 촉매 핵심인 다양한 농도의 20S 프로테아좀이 포함되어 있습니다.

ATP와 형광 펩타이드 기질을 포함하는 분석 완충액을 샘플에 추가하고 배양합니다.

ATP가 있는 상태에서 프로테아좀은 불소 펩타이드를 절단하여 유리 불광 분자를 방출합니다.

플레이트 리더를 사용하여 일정한 간격으로 형광 강도를 측정합니다.

형광을 형광 분자의 알려진 표준 농도와 비교하여 형광을 정량화합니다.

형광 강도는 샘플의 프로테아좀 활성에 비례합니다.

공포 조건 쥐의 핵 분획에서 증가된 프로테아좀 활성은 기억 관련 유전자 발현의 변화를 시사하는 반면, 시냅스 분획의 활성 감소는 장기 기억 유지에 필요한 시냅스 단백질 발현의 변화를 나타냅니다.

분석을 설정하려면 플레이트 리더를 섭씨 37도로 예열하고 실행 내내 유지합니다. 여기를 360나노미터로 설정하고 방출을 460나노미터로 설정합니다. 사용된 96웰 플레이트가 깨끗하면 광학 위치를 하단으로 설정합니다. 어두운 96웰 플레이트를 사용하는 경우 광학 위치를 상단으로 설정합니다. 2시간의 시간으로 키네틱 런을 프로그래밍하고 30분마다 스캔합니다.

키트에 제공된 20s 10x 분석 완충액을 13.5밀리리터의 초순수로 재구성합니다. 100밀리몰 ATP 14마이크로리터를 현재 1x 완충액에 추가합니다. 이는 샘플의 프로테아좀 활성을 크게 향상시키고 분석 신뢰성을 향상시킵니다. 키트에 제공된 AMC 표준을 100마이크로리터의 DMSO로 재구성합니다. 표준은 빛에 민감하므로 어두운 곳이나 저조도 조건에서 AMC 표준을 사용하여 단계를 수행합니다.

일련의 높음에서 낮은 AMC 농도에서 AMC의 표준 곡선을 만듭니다. 이 곡선은 플레이트 리더 보정 및 균질화된 샘플에서 프로테아좀 활성 분석에 사용됩니다. 키트에 제공된 프로테아좀 기질을 65마이크로리터의 DMSO로 재구성합니다. 또한 기판이 빛에 민감하므로 어두운 곳이나 저조도 조건에서 이 단계를 수행합니다.

그런 다음 20 S 분석 완충액을 사용하여 새로운 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브에서 프로테아좀 기질의 1-20 희석액을 만듭니다. 원하는 샘플의 정규화된 양을 96웰 플레이트에 추가합니다. 각 샘플을 중복하여 실행합니다. 필요한 샘플의 양은 조직 준비에 따라 다릅니다. 일반적으로 10-20마이크로그램이면 모든 세포 내 분획에 충분합니다.

초순수로 샘플 웰 부피를 80마이크로리터로 가져옵니다. 추가되는 양은 추가된 샘플의 양에 따라 다릅니다. 두 개의 별도 우물에 80마이크로리터의 물만 추가합니다. 이것들은 분석 블랭크가 될 것입니다. 분석 블랭크를 포함하여 각 웰에 10마이크로리터의 20 S 분석 완충액을 추가합니다. 리피터 또는 자동 피펫을 사용하여 웰 전체에서 일관된 분석 볼륨을 보장합니다.

불을 끄거나 어두운 방으로 들어가십시오. 각 표준물질에 대해 단일 웰을 사용하여 희석된 AMC 표준물질 100마이크로리터를 모두 새 웰에 추가합니다. 어둠 속에서 중계기 또는 자동 피펫을 사용하여 10마이크로리터의 희석된 프로테아좀 기질을 샘플 및 분석 블랭크가 포함된 웰에 추가하되 AMC 표준은 첨가하지 않습니다. 플레이트를 플레이트 리더에 넣고 키네틱 런을 시작합니다.