모델 Herpesvirus의 Lytic 복제의 해부 호스트 바이러스 상호 작용

다음 실험의 전반적인 목표는 다양한 바이러스학적 및 생화학적 접근법을 사용하여 모델 헤르페스 바이러스의 용균성 복제 과정에서 호스트 신호 전달 경로의 역할을 분석하는 것입니다. 여기서는 예시로, 헤르페스 바이러스 gamma HV 68 감염 중 mitochondrial antiviral signaling protein Mavs의 역할을 조사합니다. 먼저, 급성 감염 동안 Mavs의 역할을 조사하기 위해 야생형 및 Mavs 결핍 마우스에 gamma HV 68을 감염시켜 급성 바이러스 감염을 유도합니다.

마우스 폐를 수집하고, 샘플을 연속 희석하여 도말하는 플라크 분석법을 통해 바이러스 수치를 측정합니다. 이후 단일층 상에서 플라크의 수를 측정합니다. 녹아웃 마우스에서 바이러스 수치가 증가했다면, 이는 해당 표적 유전자가 항바이러스 역할을 한다는 것을 시사합니다.

이와 대조적으로, 녹아웃 마우스에서 바이러스 수치가 감소한 것은 해당 유전자가 바이러스 감염에 필수적임을 나타냅니다. 이러한 결과를 검증하기 위해, 마우스 배아 섬유아세포를 이용해 인비트로(in vitro) 바이러스 다단계 성장 동태를 분석합니다. 야생형 및 mavs 녹아웃 마우스 배아 섬유아세포에 gamma HV 68을 감염시키고 다양한 시간 동안 배양합니다. 그 후 세포를 수집하고 플라크 분석을 수행하여 야생형 세포와 mavs 결핍 세포 간의 다단계 성장 동태를 비교합니다.

이러한 발견을 추가로 검증하기 위해, 야생형 및 mavs 녹아웃 마우스 배아 섬유아세포에 gamma HV 68을 감염시킵니다. 그 후 감염된 세포에서 DNA와 RNA를 각각 추출하고, 실시간 PCR을 통해 바이러스 게놈 전사체를 분석합니다. 저희는 바이러스 용해성 감염 동안의 숙주 면역 경로의 역할을 연구하던 중 처음으로 이 프로토콜에 대한 아이디어를 얻었습니다.

본 프로토콜은 다른 병원체에 의한 감염 중 숙주 신호 전달 경로의 규칙을 조사하는 데 잠재적으로 적용될 수 있습니다. 운송 후 6~8주 된 성별이 일치하는 동일리터 마우스가 4일 동안 적응하도록 하여 이 절차를 시작하십시오. 다음 실험은 생물안전 시설에서 수행될 것입니다.

준비 단계에서 실험복, 장갑, 마스크 및 신발 덮개를 포함한 개인 보호 장구를 착용하고 생물안전 2등급(biosafety level two) 캐비닛 내에서 작업하십시오. 감염시킬 마우스 한 마리당 40~10,000 PFU의 gamma HV 68과 30 µL의 멸균 PBS를 사용하여 바이러스 현탁액을 준비하십시오.

케타민-자일라진(ketamine Xylazine)을 복강 내 주사한 후, 바이러스 현탁액을 얼음 위에 보관하십시오. 발가락 꼬집기 테스트를 통해 마우스가 충분히 진정되었는지 확인하십시오. 그 다음, 피펫을 사용하여 바이러스 현탁액 30 µL를 왼쪽 또는 오른쪽 콧구멍에 한 방울씩 투여하십시오.

바이러스가 폐로 원활하게 전달될 수 있도록 마우스를 옆으로 눕혀 5~10분 동안 유지합니다. 그 후 마우스를 다시 케이지에 넣고 진정 상태에서 완전히 회복될 때까지 관찰합니다. 다음으로, 감염 후 여러 날짜에 걸쳐 바이러스 역가를 평가하기 위해 주입된 마우스로부터 폐 조직을 수집하여 세포 용해물을 준비합니다.

희생된 마우스에서 적출한 폐를 500 µL의 1.0 mm 지르코니아 실리카 비드가 들어 있는 멸균 1.5 mL 스크류 캡 튜브에 넣고 얼음 위에 둡니다. 당일에 다음 단계로 진행하지 않을 경우, 샘플을 -80 °C에서 보관하십시오.

그렇지 않은 경우에는 차가운 무혈청 DMEM 1 mL를 추가합니다. 튜브를 비드 비터(bead beater)에 넣고 시작 버튼을 눌러 폐 조직을 30초 동안 균질화합니다. 이는 샘플의 과열로 인해 바이러스가 불활성화되는 것을 방지하기 위함입니다.

30초간 균질화한 후, 튜브를 얼음 위에서 최소 1분 동안 냉각하십시오. 그런 다음 이 과정을 반복합니다. 이어서, 균질화된 조직을 4°C에서 16,000 RCF로 1분 동안 원심분리하십시오.

원심분리 후, 세포 잔해는 튜브 바닥에 가라앉고 지질은 표면에 형성됩니다. 여기에 표시된 대로 상층액을 즉시 취하여 NIH 3T3 또는 BHK 21 단층 배양 세포를 이용한 플라크 분석을 수행합니다. 다음으로, 시료 내의 바이러스 역가를 결정하기 위해 플라크 분석을 수행하며, 먼저 바이러스 상층액을 단계별로 희석하여 플라크 분석을 시작합니다.

먼저 멀티채널 피펫을 사용하여 96 웰 플레이트에 배지 270 µL를 첨가합니다. 첫 번째 행은 비워 둡니다. 그런 다음 96 웰 플레이트의 첫 번째 행에 상층액 200 µL를 첨가하며, 각 샘플은 3반복으로 분주합니다.

다음으로, 첫 번째 행의 샘플 30 µL를 다음 행으로 옮기고 혼합합니다. 그다음 혼합물 30 µL를 다음 행으로 옮기고 혼합합니다. 이 단계를 여러 번 반복하여 10배 단계 희석을 수행합니다.

다음으로, 희석된 바이러스 상층액을 세포 단층 위에 첨가합니다. 24-웰 플레이트를 사용하십시오. 플레이트를 배양기에 넣고 2시간의 배양 기간 동안 30분마다 플레이트를 흔들어 줍니다. 배양이 끝난 후, 세포 잔해를 제거하기 위해 플레이트에서 상층액을 흡입하여 제거합니다.

그 후 신선한 배지로 세포를 한 번 세척합니다. 세척 후, 메틸셀룰로오스가 포함된 배지를 세포에 첨가합니다. 세포를 4~6일 동안 배양합니다.

4~6일이 지난 후, 현미경을 사용하여 각 샘플의 플라크 수를 측정합니다. 각 희석 배수별 플라크 수를 기록하십시오.

그다음 평균과 표준 편차를 계산합니다. 플라크 수가 너무 많거나 적은 웰은 타이터(titer)를 정확하게 계산하는 데 사용할 수 없습니다. 따라서 각 샘플에 대해 플라크 수가 7개에서 70개 사이인 희석 배수를 사용하십시오.

1,000배 희석된 이 시료는 웰당 평균 23개의 플라크를 형성합니다. 희석되지 않은 용액의 바이러스 역가를 계산하려면, 희석 배수와 플라크 수, 그리고 1mL당 마이크로리터 수를 모두 곱합니다. 그다음, 이를 웰당 첨가된 희석 상층액의 부피로 나눕니다.

따라서 이 예시에서는 1000 × 23 plaques × 1000 µL/mL ÷ 100 µL = 2.3 × 10⁵ forming units/mL이 됩니다. 다음으로, 알려진 역가(titer)를 가진 바이러스 스톡 용액을 사용하여 마우스 배아 섬유아세포에서 γHV68의 성장 역학을 결정합니다. 우선, 야생형(wild type) 및 특정 호스트 유전자가 결핍된 마우스 세포를 24-well 플레이트에 well당 10,000 cells로 분할하여 배양합니다. 다음 날, 각 well의 배지를 0.5 mL의 낮은 MOI γHV68 현탁액으로 교체합니다.

플레이트를 37 °C 인큐베이터에 넣고 2시간 동안 배양합니다. 배양 과정 중 30분마다 플레이트를 흔들어 줍니다. 피펫을 사용하여 바이러스 현탁액을 제거하고, 8% fetal bovine serum이 함유된 신선한 complete DM EM 0.5 mL를 바이러스 감염 세포에 첨가합니다.

감염 후 며칠 간격으로 세포를 다시 인큐베이터에 넣습니다. 피펫팅을 여러 번 반복하여 부유 세포를 수확합니다. 수확한 세포를 멸균된 1.5 milliliter 원심 분리 튜브로 옮긴 후, 즉시 minus 80 degrees Celsius에서 급속 냉동하여 세포로부터 gamma HV 68을 방출시킵니다.

동결-해동 과정을 3회 반복합니다. 세포를 37 °C에 두어 해동합니다. 그 다음 볼텍스(vortex)한 후 다시 -80 °C 냉동고에 보관합니다.

숙주 유전자 또는 바이러스 유전자의 결핍이 DNA 또는 RNA 복제에 영향을 미치는지 확인하기 위해, 앞서 설명한 대로 NIH 3T3 또는 BHK 21 단일층을 이용한 플라크 분석법으로 바이러스 역가를 결정합니다. 감염 후 여러 날짜의 감염된 세포에서 시작하여, 상층액을 제거하고 세포를 차가운 PBS로 헹군 뒤 트립신으로 세포를 분리합니다. 그다음 실온에서 1000 RCF로 1분간 원심분리하여 세포를 펠렛화하고, 원심분리 후 상층액을 제거한 뒤 세포를 -80 °C에서 보관합니다.

숙주 및 바이러스 유래의 총 DNA와 RNA를 추출합니다. 그다음 스핀 컬럼을 원심 분리합니다. 총 DNA와 바이러스 용해 전사체 특이적 프라이머를 사용하여 실시간 PCR을 수행합니다.

베타 액틴(beta actin)과 같은 숙주 하우스키핑 유전자를 기준으로 세포 내 gamma HV 68 게놈의 상대적 양을 측정합니다. 전체 RNA와 oligo DT 프라이머를 사용하여 cDNA를 준비합니다. 상술한 cDNA와 프라이머를 사용하여 실시간 PCR을 수행함으로써 바이러스 전사체의 상대적 양을 결정합니다.

숙주 하우스키핑 유전자와 비교하여, 여기에 표시된 바와 같이 Mavs는 mitochondrial antiviral signaling의 약어입니다. Mavs 어댑터 분자는 세포질의 rig-like 수용체로부터 신호를 전달하여 NF kappa B와 인터페론 조절 인자인 IRFs를 활성화하며, 이는 결과적으로 전염증성 사이토카인과 인터페론의 유전자 발현을 상향 조절합니다. gamma HV에 감염된 야생형 마우스와 Mavs 결핍 litter mate 마우스의 폐 내 바이러스 양이 여기에 나타나 있습니다.

Mavs 결핍은 감염 후 10일째 폐의 바이러스 부하를 현저히 감소시켰으며, 이는 in vivo에서의 효율적인 바이러스 감염을 위해 Mavs가 필수적임을 나타냅니다. 이 그림은 야생형 마우스 배아 섬유아세포와 Mavs 결핍 마우스 배아 섬유아세포에서의 바이러스 다단계 성장 곡선을 보여줍니다. 마우스 배아 섬유아세포에서 바이러스 성장이 현저히 지연되었으며, 이는 in vitro에서의 효율적인 바이러스 복제에 Mavs가 필요함을 시사합니다. $\gamma$HV68이 감염된 마우스 배아 섬유아세포 내 바이러스 용해성 유전자의 mRNA 수준을 실시간 PCR로 분석한 결과, Mavs 결핍 시 세 가지 필수 용해성 유전자의 mRNA 수준이 유의하게 감소했습니다.

이 모든 결과는 종합적으로 Mavs가 gamma HV 68의 전사 활성화와 용해성 복제에 필수적이라는 결론을 뒷받침합니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 VO와 Vevo 모두에서 호스트-병원체 상호작용을 여러 수준에서 조사하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 병원체를 다루는 작업은 매우 주의가 필요하다는 점을 잊지 마십시오.

실험을 진행하는 동안 개인 보호 장구 착용과 같은 주의 사항을 준수해야 합니다.