모델 Herpesvirus의 Lytic 복제의 해부 호스트 바이러스 상호 작용

다음 실험의 전반적인 목표는 다양한 바이러스학적 및 생화학적 접근 방식을 사용하여 모델 헤르페스 바이러스의 용해 복제에서 숙주 신호 경로의 역할을 해부하는 것입니다. 예를 들어, 헤르페스 바이러스 감마 HV 68에 감염되는 동안 미토콘드리아 항바이러스 신호 단백질인 Mavs의 역할을 조사합니다. 먼저 급성 감염 중 Mavs의 역할을 조사하기 위해 야생형 및 Mavs 녹아웃 마우스는 급성 바이러스 감염 후 감마 HV 68에 감염됩니다.

마우스 폐를 채취하고 바이러스 부하를 플라크 분석으로 측정하며, 여기서 샘플을 연속적으로 희석하고 플레이팅합니다. 단층에서는 플라크의 수가 계산됩니다. 녹아웃 마우스에서 증가된 바이러스 부하(viral load)는 관심 유전자가 항바이러스 역할을 한다는 것을 시사합니다.

대조적으로, 녹아웃 마우스에서 감소된 바이러스 부하는 이러한 발견을 검증하기 위해 유전자가 바이러스 감염에 필요하다는 것을 나타냅니다. 생쥐 배아 섬유아세포, 야생형 및 mavs 녹아웃 마우스 배아 섬유아세포에서 시험관 내 바이러스 다단계 성장 동역학을 검사하고 감마 HV 68에 감염시키고 다양한 시간 동안 배양합니다. 그런 다음 세포를 수집하고 플라크 분석을 수행하여 야생형 세포와 mavs 결핍 세포 간의 다단계 성장 역학을 비교합니다.

이러한 발견을 추가로 검증하기 위해 야생형 및 mavs 녹아웃 마우스 배아 섬유아세포 세포가 감마 HV 68에 감염되었습니다. 그런 다음 감염된 세포에서 DNA와 RNA를 별도로 추출하고 Real-Time PCR로 바이러스 게놈 전사체를 분석합니다. 이 프로토콜에 대한 아이디어는 바이러스 지질 감염 중 숙주 면역 경로의 역할을 연구했을 때 처음 떠올랐습니다.

이 프로토콜은 다른 병원체에 의한 감염 중 숙주 신호 경로의 규칙을 조사하는 데 잠재적으로 적용될 수 있습니다. 6주에서 8주 된 성별이 일치하는 깔짚으로 만든 쥐가 선적 후 4일 동안 적응하도록 하여 이 절차를 시작합니다. 다음 실험은 생물학적 위험 시설에서 수행됩니다.

준비 시에는 실험복, 장갑, 마스크 및 부츠를 포함한 개인 보호 장비를 착용하고 생물 안전 캐비닛에서 작업하십시오. 레벨 2. 감염될 각 마우스에 대해 40-10, 000 PFU의 감마 HV 68 및 30 마이크로리터의 멸균 PBS로 바이러스 현탁액을 준비합니다.

케타민 자일라진(ketamine Xylazine)의 복강 내 주사 후 바이러스 현탁액을 얼음 위에 유지합니다. 발가락 꼬집기를 수행하여 마우스가 진정되었는지 확인합니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 30마이크로리터의 바이러스 현탁액을 왼쪽 또는 오른쪽 콧구멍에 떨어뜨려 전달합니다.

바이러스가 폐로 기도가 잘 전달될 수 있도록 5-10분 동안 마우스를 옆으로 눕힙니다. 그런 다음 쥐를 다시 우리에 넣고 진정제에서 완전히 회복될 때까지 모니터링합니다. 다음으로, 주입된 마우스에서 폐 조직을 채취하여 감염 후 며칠 동안 바이러스 역가를 평가하기 위한 세포 용해물을 준비합니다.

희생된 쥐에서 채취한 폐를 얼음 위에 500마이크로리터의 1.0mm 지르코니아 실리카 비드가 들어 있는 멸균 1.5ml 나사 캡 튜브에 넣습니다. 그렇지 않은 경우 같은 날에 다음 단계로 진행합니다. 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

그렇지 않으면 콜드 세럼이 없는 DMEM 1ml를 추가하십시오. 튜브를 비드 비터에 넣고 시작을 눌러 30초 동안 폐를 균질화합니다. 바이러스를 비활성화할 수 있는 샘플 과열을 방지합니다.

30초 동안 균질화한 후 최소 1분 동안 얼음에서 튜브를 냉각합니다. 그런 다음 이 과정을 반복합니다. 다음으로, 16, 000 RCF에서 1분 동안 섭씨 4도에서 균질화된 조직을 원심분리합니다.

스핀 후 세포 파편은 튜브 바닥에 있고 지질은 표면에 있습니다. 즉시 여기에 표시된 대로 스내트를 취하여 NIH three, T, three 또는 BHK 21 단층을 사용하여 플라크 분석을 수행합니다. 다음으로, 플라크 분석이 수행됩니다.샘플에 존재하는 바이러스 역가를 결정하기 위해 바이러스 상층액을 연속 희석하여 플라크 분석을 시작합니다.

먼저 멀티채널 피펫을 사용하여 270마이크로리터의 매체를 96웰 플레이트에 추가합니다. 첫 번째 행은 비워 둡니다. 그런 다음 200마이크로리터의 상등액을 96웰 플레이트 플레이트의 첫 번째 줄에 추가하고 각 샘플을 세 번 추가합니다.

다음으로, 30마이크로리터의 샘플을 첫 번째 행에서 다음 행으로 옮기고 혼합합니다. 그런 다음 혼합물 30 마이크로 리터를 다음 행으로 옮기고 혼합합니다. 이 단계를 여러 번 반복하여 10배 연속 희석을 만듭니다.

다음으로, 희석된 바이러스 상등액을 세포 단층에 첨가합니다. 24웰 플레이트에서. 플레이트를 인큐베이터에 넣고 배양 후 2시간 배양 중 30분마다 플레이트를 흔들어 세포 파편을 제거하고 플레이트에서 상층액을 흡입합니다.

그런 다음 새로운 배지로 세포를 한 번 씻으십시오. 세척 후 메틸셀룰로오스를 함유한 배지를 세포에 첨가합니다. 세포를 4-6일 동안 배양합니다.

4일에서 6일이 지났습니다. 현미경을 사용하여 각 샘플의 플라크 번호를 읽습니다. 각 희석액에 대한 플라크 수를 기록합니다.

그런 다음 평균과 표준 편차를 계산합니다. 플라크가 너무 많거나 너무 적은 웰은 역가를 정확하게 계산하는 데 사용할 수 없습니다. 따라서 각 샘플에 대해 7-70개의 플라크가 있는 희석액을 사용하십시오.

1000배로 희석된 이 샘플에는 웰당 평균 23개의 플라크가 있습니다. 희석되지 않은 용액의 바이러스 역가를 계산하려면 희석 계수에 플라크 수와 밀리리터 단위의 마이크로리터 수를 곱합니다. 그런 다음 그것을 웰 당 첨가 된 희석 된 상등액의 부피로 나눕니다.

따라서 이 예에서 1000 곱하기 23 플라크 곱하기 1000 밀리리터당 1000 마이크로리터로 나눈 값은 2.3 곱하기 10 밀리리터당 5번째 형성 단위와 같습니다. 다음으로, 알려진 역가를 가진 바이러스 스톡 용액을 사용하여 마우스 배아 섬유아세포에서 감마 HV 68의 성장 동역학을 결정하는 데 사용됩니다.ORM은 야생형 신화와 숙주 유전자가 결핍된 신화를 웰당 10, 000개의 세포에서 24개의 웰 플레이트로 분할하여 시작합니다. 다음 날, 각 웰의 배지를 0.5밀리리터의 낮은 MOI 감마 HV 68 현탁액으로 교체합니다.

플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 놓고 배양 내내 2시간 동안 배양이 진행되도록 합니다. 부화 후 30분마다 접시를 흔듭니다. 피펫을 사용하여 바이러스 현탁액을 제거하고 8%의 소 태아 혈청을 함유한 새로운 완전 DM EM 0.5ml를 바이러스 감염 세포에 첨가합니다.

감염 후 다양한 날에 세포를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 여러 번 위아래로 피펫팅하여 중간 말단 세포를 수확합니다. 멸균 1.5 밀리리터 원심 분리기 튜브로 옮기고 즉시 섭씨 영하 80도에서 튜브를 동결하여 Mets에서 감마 HV 68을 방출합니다.

동결 및 해동을 세 번 수행합니다. 세포를 섭씨 37도에 두어 세포를 해동합니다. 그런 다음 소용돌이를 일으켜 영하 80도의 냉동고에 다시 넣으십시오.

앞서 보여준 바와 같이 NIH three, T three 또는 BHK 21 단층을 사용하여 플라크 분석으로 바이러스 역가를 측정하여 DNA 또는 RNA 복제가 숙주 유전자 또는 바이러스 유전자의 결핍에 의해 영향을 받는지 여부를 조사합니다. 감염 후 여러 날에 감염된 mes로 시작하여 상층액을 버리고 차가운 PBS와 트립신 얼음 세포로 세포를 헹굽니다. 그런 다음 스핀 후 1분 동안 실온에서 1000RCF로 중핵화하여 세포를 펠렛화하고 상등액을 버리고 세포를 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

숙주와 바이러스에서 유래한 총 DNA와 RNA를 추출합니다. 그런 다음 스핀 기둥을 원심 분리합니다. 바이러스 용해 전사체에 특이적인 총 DNA와 프라이머를 사용하여 Real-Time PCR을 수행합니다.

베타 액틴(beta actin)과 같은 숙주 하우스키핑 유전자(host housekeeping gene)와 관련하여 세포 내 감마 HV 68 게놈의 상대적인 양을 결정합니다. total RNA 및 oligo DT primer로 CDNA를 준비합니다. 위와 같이 CD NA 및 프라이머를 사용하여 Real-Time PCR을 수행하여 바이러스 전사체의 상대적 수량을 측정합니다.

숙주 하우스키핑 유전자와 관련하여, Mavs는 다음과 같이 미토콘드리아 항바이러스 신호(mitochondrial antiviral signaling)의 약자입니다. Mavs 어댑터 분자는 수용체와 같은 세포질 리그 눈에서 신호를 전달하여 NF kappa B 및 인터페론 조절 인자 IRF를 활성화하고, 이는 다시 전염증성 사이토카인과 인터페론의 유전자 발현을 상향 조절합니다. 감마 HV에 감염된 야생형 마우스와 Mavs가 결핍된 새끼 짝 마우스의 폐에 있는 바이러스 부하가 여기에 나와 있습니다.

Mavs의 결핍은 감염 후 10일째에 폐의 바이러스 부하를 현저히 감소시켰으며, 이는 Mavs가 효율적인 생체 내 바이러스 감염에 필요하다는 것을 나타냅니다. 이 그림은 야생형 마우스 배아 섬유아세포와 Mavs가 결핍된 Mavs의 다단계 성장 곡선을 보여줍니다. Mavs의 실시간 PCR 결핍에 의해 Mavs가 효율적인 바이러스 복제에 필요하다는 것을 나타내는 마우스 배아 섬유아세포의 현저히 지연된 바이러스 성장을 감마 HV 68 감염된 마우스 배아 섬유아세포에서 바이러스 용해 유전자의 시험관 내 mRNA 수준으로 분석한 결과, 3가지 필수 용해 유전자의 mRNA 수치가 현저히 감소했습니다.

이러한 모든 결과는 Mavs가 감마, HV 68, 전사 활성화 및 용해 복제에 필요하다는 결론을 총체적으로 뒷받침합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 VO 및 Vevo 모두에서 여러 수준에서 숙주 병원체 상호 작용을 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 병원체와 함께 일하는 것은 매우 주저할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.

공연이 진행되는 동안 개인 보호 장비 착용과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.