Name: 모델 Herpesvirus의 Lytic 복제의 해부 호스트 바이러스 상호 작용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 배우세요 Mavs 단백질이 감마헤르페스바이러스 68의 용해성 복제에 미치는 영향을 박리하는 방법을 마우스 모델과 plaque 분석을 통해. 이 연구는 바이러스-숙주 상호작용 메커니즘을 규명하는 데 활용됩니다.

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저자는 박사 제임스 (Zhijian)을 감사드립니다 Mavs 등의 필수 시약, 제공 첸 (UT 남서, 분자 생물학) - / - 마우스, 박사 르네 토 (캘리포니아 로스 앤젤레스 대학, 약학 및 분자 의학 )이 유학 γHV68의 세균 인공 염색체를 제공.

1. γHV68와 마우스 감염 <ol><li> 로 6 년 8 주 오래된, 성별 일치 littermate 마우스 (8-12 마우스 / 그룹)은 바이러스 감염에 사용됩니다. 쥐가 선적 후 사 전체 일 (96 시간) 이상 순응 할 수 있습니다. </li><li> 바이러스를 사용하여 프로토콜 단계는 표준 BSL2주의를 사용하여 바이오 안전성 수준 2 (BSL2)의 캐비닛에서 수행해야합니다. </li><li> 단지 실험하기 전에 마우스를 당 멸균 PBS의 30 μl에 γHV68의 (40 1 개 10 5 상패 - 성형 장치 [PFU는]) 바이러스 정지를 준비합니다. 얼음 바이러스 정지세요. </li><li> 마우스 진정 작용을 위해 케타민 / xylazine 솔루션을 (1.5 MG의 케타민과 0.15 MG xylazine/20 g의 체중, 100 μl / 마우스) 준비합니다. 쥐가 발가락 핀치를 수행하여 회복 될했는지 확인합니다. </li><li> 1.5 MG의 케타민 및 내부 - 복막 주입 20 MG의 체중 (100 μl / 마우스) 당 0.15 밀리그램의 xylazine으로 마취 마우스. </li><li> 드롭 현명한에 intranasally 바이러스 정지 (30 μl / 마우스)를 제공진정제를 마우스 중 하나가 콧 구멍에 패션. </li><li> 5 한쪽에 마우스를 놓는다 - 10 분 폐에 바이러스의기도 전달을 촉진 할 수 있습니다. </li><li> 다시 케이지와 모니터 마우스에서 개최 마우스가 완전히 진정 작용에서 복구 할 때까지. </li><li> 다양한 일 후 감염에서 CO 2 질식과 사망 / 깊은 의식의 손실을 보장 후 수확 폐를하여 마우스를 희생. 장소 폐 1.0 mm의 지르코니아 / 실리카 구슬 500 μl를 포함하는 멸균 1.5 ML 나사 덮힌 튜브에. 얼음에 튜브세요. 스토어 샘플 -80 ° C에서 같은 날에 다음 단계로 진행하지 않을 경우. 비장 또는 간 조직은 실험 기간에 따라 바이러스 대기 시간의 분석을 위해이 시간에 수집 될 수 있습니다. </li><li> 관에 추위 혈청이없는 DMEM의 1 ML을 추가하고 구슬 - 심장이 두근 두근 30초하여 폐를 균질화. 최소 1 분 동안 얼음에 튜브를 죽일거야. 한 번이 과정을 반복합니다. </li><li> 원심 분리기의 폐는 1 분에 대해 4 ° C에서 16,000 rcf에 lysates과 supern를 사용하여NIH3T3 또는 BHK21 monolayer를 (자세한 내용은 섹션 5를 참조)를 사용하여 상패 분석​​하여 바이러스 titer를 확인할 수 atant. </li></ol> 2. 마우스 배아 섬유 아세포에서 γHV68 여러 단계 성장 속도론을 결정 <ol><li> 야생 타입 마우스 배아 섬유 아세포 (MEFs) 및 도금 세포하기 전에 하위 합류 (약 80 %) 밀도 호스트 유전자의 결함 사람들을 성장. </li><li> 10000 세포에서 24 잘 판에 MEFs 분할 / 잘 감염 전날에 (나 역시) multipilicity 수준의 감염 낮은하십시오. 실험은 보통 0.001 사이에 triplicates과 - 나에서 수행됩니다 - 0.05은 일반적으로 사용됩니다. </li><li> 바이러스의 원하는 금액 (0.5 ML 당 잘)를 포함 γHV68 정지를 준비합니다. </li><li> 미디어를 제거하고 잘 당 γHV68 정지의 0.5 ML로 MEFs을 다룹니다. </li><li> 조직 문화 인큐베이터, 바위마다 30 분에 금속판을 배양하고, 배양은 2시에 진행 할 수 있습니다. </li><li> 바이러스 정지를 제거하고, 0.5 ML 신선한 C와 세포를 포함omplete DMEM 매체은 8 % 태아 소 혈청을 포함. </li><li> 다양한 일 후 감염에서 멸균 1.5 ML의 원심 분리기 튜브에 매체와 세포를 수확. 즉시 -80에서 튜브를 고정 ° C. </li><li> -80에서 냉동 MEFs에서 출시 γHV68 ° C, 37 ° C에서 해동 물 욕조, vortexing. 동결 융해의 세 가지 사이클은 보통 샘플에 적용됩니다. </li><li> NIH3T3 또는 BHK21 monolayer를 (자세한 내용은 섹션 5를 참조)를 사용하여 상패 분석​​하여 바이러스 titer를 결정합니다. </li><li> 바이러스 titer 및 MEFs에 플롯 γHV68 여러 단계 성장 곡선을 참조하십시오. </li></ol> 3. 마우스 배아 섬유 아세포에서 γHV68 lytic 복제 분자 해부 <ol><li> 제 2의 2.6 단계 2.1에 설명 된대로 바이러스 감염을 수행합니다. </li><li> 다양한 일 후 감염에서, 표면에 뜨는 폐기하십시오. 차가운 PBS와 trypsinize 세포와 세포를 씻어. 1 분 동안 실온에서 1000 rcf에서 원심 분리기에 의한 펠릿 세포. 표면에 뜨는을 취소하고-80에서 매장 세포 ° C. </li><li> 이전에 다음 ID로 출판 방법 5,6에 따라 총 DNA (호스트 및 바이러스 게놈)과 총 RNA를 추출합니다. </li><li> 총 DNA와 같은 RTA (ORF50), ORF57 및 ORF60 등의 바이러스 lytic 성적에 대한 특정 프리 머를 사용하여 실시간 PCR을 수행합니다. 호스트 하우스 키핑 유전자 (예 : β-고를)에 대한 언급 세포 γHV68 게놈의 상대적인 양을 결정합니다. </li><li> 게놈 DNA 오염을 제거하려면 RNase 무료 DNase 치료는 총 RNA와 oligo (DT) 11-19 프라이머로 cDNA 준비 중요합니다. RNase 무료 DNase 및 RT-PCR 치료를 포함하여 RNA 추출에 대한 자세한 내용은 5 참조를 참조하십시오. 호스트 하우스 키핑 유전자의에 대한 언급 바이러스 성적의 상대적 양을 결정하기 위해 위와 같이 cDNA와 프리 머를 사용 실시간 PCR을 수행합니다. </li></ol> 4. 재조합 γHV68 사용 박테리아 인공 염색체를 생성 method는 호스트 바이러스 상호 작용에 관여하는 유전자에 변이 γHV68을 소개하는 데 사용됩니다 여기에 설명. <ol><li> 야생 형 시퀀스 또는 PCR에 의한 중앙 지역에 원하는 돌연변이를 들고 시퀀스의 DNA 조각을 (1.5 KB) 준비합니다. </li><li> 특히 MIDI 규모의 정화 (OriGene)에 의한 관심의 유전자 유전자를 inactivates 돌연변이 사이트 주위에 transposon 삽입 7이 포함되어 박테리아 인공 염색체 (BAC)를 준비합니다. 4 번 스토어 BAC DNA ° C (BAC DNA의 해동 / 냉동하지 않도록해야합니다.) </li><li> Transfect BAC DNA와 PCR 제품은 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)로, γHV68 lytic 복제에 매우 허용 아르 세포 (예를 들어, NIH3T3 또는 BHK21)로 관심있는 유전자의 변이를 포함하는 원하는. </li><li> cytopathic 효과 (CPE)은 monolayer에 표시 될 때까지 분할 세포세요. 바이러스가 포함 된 표면에 뜨는를 수집하고, 필요한 경우, NIH3T3 또는 BHK21 세포에 바이러스를 증폭. </li><li> 와 NIH3T3 세포를 감염1800 rpm으로 원심 분리하여 재조합 바이러스, 30 분 30 ° C. </li><li> 수확 γHV68에 감염된 NIH3T3 세포와 Hirt의 프로토콜 8,9을 사용하여 circularized 바이러스 게놈을 준비합니다. </li><li> chloramphenicol에 대한 저항 (CM)하지만, kanamycin (관) (칸 방지 유전자가 transposon에있는 동안 CM 방지 유전자가, BAC 백본에에 민감 식민지에 대한 electroporation과 화면에 전기 MAX DH10B 관할 세포 (Invitrogen)을 변환 삽입). </li><li> 중간 포함 chlorophenicol에 CM R 관 S 식민지를 성장 및 미니 또는 MIDI 규모의 정화 (OriGene)와 BAC DNA를 준비합니다. </li><li> 돌연변이 사이트의 지역 측면을 노릴하고, 순서에 맞는 프리 머를 사용하여 PCR하여 대상 유전자에서 원하는 돌연변이를 확인합니다. </li><li> 선택한 제한 효소 및 펄스 - 필드 겔 전기 영동과 소화의 BAC에 염색체 다시 정리하기를 확인하지 않습니다. </li><li> Lipofectamine와 NIH 3T3 또는 BHK21 세포에 재조합 BAC를 Transfect2000 (Invitrogen)은 재조합 γHV68를 준비합니다. </li><li> CPE는 monolayer에 표시 될 때까지 전지를 passaging하세요. 바이러스가 포함 된 표면에 뜨는를 수집하고 NIH3T3 또는 BHK21 세포에 재조합 γHV68을 증폭. </li><li> 재조합 바이러스의 titer를 결정하고 같은 섹션 1과 2에 설명 된 바이러스의 성장 특성 예를 생체 및 생체 내을 특성화한다. </li></ol> 5. 상패 분석​​하여 바이러스 titer를 결정 <ol><li> 도금 세포하기 전에 하위 합류 (약 80 %) 밀도로 NIH3T3 세포를 성장. </li><li> 20000 세포에서 / 잘 감염 전날에 24 잘 판에 NIH3T3을 분할. </li><li> DMEM 매체는 8 %의 신생아 송아지 혈청 (NCS)를 포함에 10 배 순차적으로 희석 된 바이러스 supernatants를 준비합니다. </li><li> 미디어를 제거하고 γHV68 정지의 0.5 ML로 NIH3T3 세포를 다룹니다. </li><li> , 조직 문화 인큐베이터에서 판을 길러 매 30 분 락, 그리고 부화 진행 할 수 있습니다2시에. </li><li> 0.5 ML DMEM의 2% NCS를 포함하는 매체 및 0.75 %의 methylcellulose (시그마)과 바이러스 성 중지 및 표지 세포를 제거합니다. </li><li> 조직 문화 인큐베이터에서 판을 품다. 6 일 후 감염에 액자를 계산합니다. 크리스탈 바이올렛과 ​​함께 예를 들어 monolayer,의 얼룩은 플라크 계산을 용이하게 할 수 있습니다. </li><li> undiluted 조직 lysates에서 바이러스 titer를 계산하는 데, 또는 셀에 다음 수식 사용 lysates : Titer (PFU / ML) = D X N X 1000 μl / ML ÷ V를 μl합니다. N, 적절한 희석에서 상패 번호의 평균, D, 희석 V (μl) (예 : 5, 10 등, 100 .....) 배, 직렬 - 희석 표면​​에 뜨는의 볼륨은 당 잘 추가되었습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 : / - - 마우스 10, 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF)에서 γHV68 lytic 복제 phenotypes, 그리고 recombin 세 대표 수치는 야생 유형과 Mavs의 폐에 γHV68 lytic 복제를 포함하여 여기에 표시됩니다개미 γHV68는 MAVS에 의존 IKKβ에 의해​​ 조절되는 인산화 사이트 내에서 변이를 들고. 이 세 corroborating 실험 생체 및 예 생체 내 γHV68 lytic 복제에 타고난 면역 구성 요소의 역할을 정의 할 수있는 체계를 구성합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3140/3140fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 Mavs + / +와 Mavs의 폐의 γHV68로드 -. / - 마우스. A) 두 가지 타고난 신호는 MAVS의 하류 경로. 결과적으로, 염증성 크린 시토 킨과 interferons의 유전자 발현을 조절 NFκB - 인터페론 규제 요인 (IRFs)를 활성화하기 위해 cytosolic 장비-I와 같은 수용체의 신호 MAVS 어댑터 분자 릴레이. B) Mavs + / +와 Mavs - / - 마우스가 억제 된 지정된 시간 지점에서 40 PFU intranasally γHV68과 폐의 바이러스 부하에 감염되었습니다 NIH3T3 monolayer를 사용하여 상패 분석​​에 의해 채굴. 각 기호는 마우스를 나타냅니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3140/3140fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 마우스 배아 섬유 아세포의 (MEFs)에 γHV68 lytic 복제 속도론. Mavs에 γHV68의 lytic 복제가 + / +와 Mavs - / - MEFs은 여러 단계 성장 곡선 (A) 및 정량 실시간 PCR (B)에 의해 평가되었다. 두 실험 γHV68의 동등한 MEFs의 번호와 금액은 0.01의 다중성 수준의 감염 (나 역시)에서 바이러스 감염에 사용되었다. (A) 세포와 supernatants는 지정된 시간 지점에서 수확 및 바이러스 titers을 결정하는 상패 분석​​의 대상이되었다. (B) 총 RNA는 γHV68에 감염된 MEFs에서 추출되어 선택된 lytic 성적 (RTA, ORF57 및 ORF60)에 대한 특정 프리 머와 정량 실시간 PCR에 의해 분석되었다. ig3.jpg "/&gt; 그림 3. IKKγ에 의해 인산화를 폐지 RTA의 transactivation 도메인 내에서 재조합 γHV68 들고 변이의 lytic 복제 속도론. (A) Mavs의 다중 단계 성장 재조합 야생 형 바이러스의 커브 (γHV68.wt)와 돌연변이 바이러스 (γHV68.mut) + / +와 Mavs - / - MEFs 세포 (- 나 = 0.01). MEFs는 나 역시 0.01의에서 γHV68에 감염되었습니다. 세포와 supernatants는 지정된 시간 지점에서 수확되었고 바이러스 titers는 NIH 3T3 monolayer를 사용하여 상패 분석​​에 의해 결정됩니다. γHV68에 감염된 NIH3T3 세포 (B) γHV68 RTA의 mRNA 수준 (- 나 = 0.01). 30에서 H는 후 감염, 총 RNA는 γHV68에 감염된 NIH 3T3 세포에서 추출 된 및 정량 실시간 PCR에 의해 분석했다.

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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

바이러스 감염에 대응 MAVS에 의존 타고난 면역 신호 경로는 바이러스 염증성 크린 시토 킨 10-14의 생산을 촉진하기 활성화됩니다. 인간의 종양 발생 Kaposi 육종 - 관련 herpesvirus과 엡스타인 - 바 바이러스 3,4의 모델 바이러스로 손쥐 γHV68를 사용하여, 우리는 γHV68 usurps MAVS - IKKβ 경로는 전사 활성화 5를 통해 바이러스 lytic 복제를 홍보 할 것을 발견했습니다. 유전자 변형 MEFs와 분자 바이러스학의 기술을 도입,이 프로토콜은 γHV68 lytic 복제에 대한 중요한 특정 경로의 구성 요소를 신호의 효율적인 식별 할 수 있습니다. 따라서,이 프로토콜은 생체 감염, 예 생체 lytic 복제 및 본래 면역 신호 경로의 해부에 수반. 재조합 헤르페스를 생성하는 세균 인공 염색체를 포함하여 분자 메커니즘을 추가 절차를 윤곽을 그리다하려면바이러스 및 분자 생물학 실험이 필요...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-019 </td></tr><tr><td> 전기 MAX DH10B 능력 세포 </td><td> Invitrogen </td><td> 18290-015 </td></tr><tr><td> Methylcellulose </td><td> 시그마 </td><td> M0512 </td></tr><tr><td> POWERPREP HP 플라스미드 Miniprep 시스템 </td><td> OriGene </td><td> NP100004 </td></tr><tr><td> POWERPREP HP 플라스미드 Midiprep 시스템 </td><td> OriGene </td><td> NP100006 </td></tr></tbody></table>

모델 herpesvirus의 lytic 복제의 해부 호스트 바이러스 상호 작용

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

바이러스 감염에 대한 응답으로, 호스트는 바이러스 시토 킨 생산 1,2로 이어질 타고난 면역 신호 경로를 활성화 등 다양한 방어 반응을 개발하고 있습니다. 호스트를 이식하기 위해서는, 바이러스는 호스트 항 바이러스 반응을 회피하고 신호 경로를 조작 할 고맙게 여기게됩니다. 호스트 바이러스 상호 작용을 이루는 물질은 바이러스 감염에 대한 소설 치료 전략의 개발에 빛을 발산합니다. 손쥐 γHV68은 밀접하게 인간의 종양 발생 Kaposi 육종 - 관련 herpesvirus 및 Epsten - 바 바이러스 3,4에 관한 것입니다. 실험실 쥐 γHV68 감염은 인간 herpesviruses를 사용할 수 없습니다 생체에서 호스트 응답 및 바이러스 감염의 전체 과정을 검토 할 수있는 다루기 쉬운 작은 동물 모델을 제공합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 γHV68 lytic replic에 phenotypic 특성에 대한 방법의 패널 및 호스트 신호 구성 요소의 분자 절개를 제시생체 및 예 생체 내 두 ation. 유전자 변형 마우스 종자의 사용 가능 여부는 생체 내 γHV68 급성 감염시 호스트 신호 경로의 역할의 심문을 할 수 있습니다. 또한 이러한 결함 마우스 종자로부터 격리 마우스 배아 섬유 아세포의 (MEFs는) 추가 γHV68 lytic 복제 예를 생체 동안 이러한 분자의 역할을 해부하는 데 사용할 수 있습니다. virological 및 분자 생물학의 assays 사용하여, 우리는 호스트 바이러스 상호 작용의 분자 메커니즘을 정확히하고 바이러스 lytic 복제에 필수적 호스트 및 바이러스 유전자를 식별 할 수 있습니다. 마지막으로, 세균 인공 염색체 (BAC) 시스템은 특별히 호스트 바이러스 상호 작용을 방해 바이러스 요소 (들)에 변이의 도입을 용이하게한다. 이러한 변이를 들고 재조합 γHV68는 구성 요소를 신호 키 호스트의 결함 MEFs의 γHV68 lytic 복제 phenotypes을 요점을 되풀이하는 데 사용할 수 있습니다.이 프로토콜은 생체 및 예 생체 내 개입의 여러 수준에서 호스트 병원체 상호 작용을 심문 할 수있는 훌륭한 전략을 제공합니다. 최근, 우리는 γHV68 usurps 타고난 면역 신호 경로는 바이러스 lytic 복제 5 증진 것을 발견했습니다. 특히, γHV68 드 노보 감염 면역 키나제 IKKβ를 활성화하고 활성화 IKKβ는 바이러스 전사 활성화를 촉진하기 위해 마스터 바이러스 전사 인자, 복제 및 transactivator (RTA)을 phosphorylates. 그렇게함으로써, γHV68 효율적으로 커플 타고난 면역 활성화를 개최하기위한 전사 활성화함으로써 바이러스 트랜 스크립트 등의 lytic 복제를 촉진. 이 연구는 호스트 바이러스 상호 작용을 조사하기 위해 다른 바이러스에 적용 할 수있는 훌륭한 예를 제공합니다.

우리는 모델 herpesvirus, 감마 herpesvirus 68 (γHV68)의 lytic 복제에 호스트 신호 분자의 핵심 역할을 식별 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 유전자 변형 마우스 긴장과 γHV68 lytic 복제 배아 섬유 아세포를 활용, 프로토콜 phenotypic 특성화 및 바이러스 lytic 복제에서 바이러스 호스트 상호 작용의 분자 심문을 모두 할 수 있습니다.

모델 Herpesvirus의 Lytic 복제의 해부 호스트 바이러스 상호 작용

바이러스 감염에 대응하여, 숙주는 항바이러스 작용으로 이어지는 선천성 면역 신호 전달 경로의 활성화와 같은 다양한 방어 반응을 전개합니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 다양한 바이러스학적 및 생화학적 접근법을 사용하여 모델 헤르페스 바이러스의 용균성 복제 과정에서 호스트 신호 전달 경로의 역할을 분석하는 것입니다. 여기서는 예시로, 헤르페스 바이러스 gamma HV 68 감염 중 mitochondrial antiviral signaling protein Mavs의 역할을 조사합니다. 먼저, 급성 감염 동안 Mavs의 역할을 조사하기 위해 야생형 및 Mavs 결핍 마우스에 gamma HV 68을 감염시켜 급성 바이러스 감염을 유도합니다.마우스 폐를 수집하고, 샘플을 연속 희석하여 도말하는 플라크 분석법을 통해 바이러스 수치를 측정합니다. 이후 단일층 상에서 플라크의 수를 측정합니다. 녹아웃 마우스에서 바이러스 수치가 증가했다면, 이는 해당 표적 유전자가 항바이러스 역할을 한다는 것을 시사합니다.이와 대조적으로, 녹아웃 마우스에서 바이러스 수치가 감소한 것은 해당 유전자가 바이러스 감염에 필수적임을 나타냅니다. 이러한 결과를 검증하기 위해, 마우스 배아 섬유아세포를 이용해 인비트로(in vitro) 바이러스 다단계 성장 동태를 분석합니다. 야생형 및 mavs 녹아웃 마우스 배아 섬유아세포에 gamma HV 68을 감염시키고 다양한 시간 동안 배양합니다. 그 후 세포를 수집하고 플라크 분석을 수행하여 야생형 세포와 mavs 결핍 세포 간의 다단계 성장 동태를 비교합니다.이러한 발견을 추가로 검증하기 위해, 야생형 및 mavs 녹아웃 마우스 배아 섬유아세포에 gamma HV 68을 감염시킵니다. 그 후 감염된 세포에서 DNA와 RNA를 각각 추출하고, 실시간 PCR을 통해 바이러스 게놈 전사체를 분석합니다. 저희는 바이러스 용해성 감염 동안의 숙주 면역 경로의 역할을 연구하던 중 처음으로 이 프로토콜에 대한 아이디어를 얻었습니다.본 프로토콜은 다른 병원체에 의한 감염 중 숙주 신호 전달 경로의 규칙을 조사하는 데 잠재적으로 적용될 수 있습니다. 운송 후 6~8주 된 성별이 일치하는 동일리터 마우스가 4일 동안 적응하도록 하여 이 절차를 시작하십시오. 다음 실험은 생물안전 시설에서 수행될 것입니다.준비 단계에서 실험복, 장갑, 마스크 및 신발 덮개를 포함한 개인 보호 장구를 착용하고 생물안전 2등급(biosafety level two) 캐비닛 내에서 작업하십시오. 감염시킬 마우스 한 마리당 40~10,000 PFU의 gamma HV 68과 30 µL의 멸균 PBS를 사용하여 바이러스 현탁액을 준비하십시오.케타민-자일라진(ketamine Xylazine)을 복강 내 주사한 후, 바이러스 현탁액을 얼음 위에 보관하십시오. 발가락 꼬집기 테스트를 통해 마우스가 충분히 진정되었는지 확인하십시오. 그 다음, 피펫을 사용하여 바이러스 현탁액 30 µL를 왼쪽 또는 오른쪽 콧구멍에 한 방울씩 투여하십시오.바이러스가 폐로 원활하게 전달될 수 있도록 마우스를 옆으로 눕혀 5~10분 동안 유지합니다. 그 후 마우스를 다시 케이지에 넣고 진정 상태에서 완전히 회복될 때까지 관찰합니다. 다음으로, 감염 후 여러 날짜에 걸쳐 바이러스 역가를 평가하기 위해 주입된 마우스로부터 폐 조직을 수집하여 세포 용해물을 준비합니다.희생된 마우스에서 적출한 폐를 500 µL의 1.0 mm 지르코니아 실리카 비드가 들어 있는 멸균 1.5 mL 스크류 캡 튜브에 넣고 얼음 위에 둡니다. 당일에 다음 단계로 진행하지 않을 경우, 샘플을 -80 °C에서 보관하십시오.그렇지 않은 경우에는 차가운 무혈청 DMEM 1 mL를 추가합니다. 튜브를 비드 비터(bead beater)에 넣고 시작 버튼을 눌러 폐 조직을 30초 동안 균질화합니다. 이는 샘플의 과열로 인해 바이러스가 불활성화되는 것을 방지하기 위함입니다.30초간 균질화한 후, 튜브를 얼음 위에서 최소 1분 동안 냉각하십시오. 그런 다음 이 과정을 반복합니다. 이어서, 균질화된 조직을 4°C에서 16,000 RCF로 1분 동안 원심분리하십시오.원심분리 후, 세포 잔해는 튜브 바닥에 가라앉고 지질은 표면에 형성됩니다. 여기에 표시된 대로 상층액을 즉시 취하여 NIH 3T3 또는 BHK 21 단층 배양 세포를 이용한 플라크 분석을 수행합니다. 다음으로, 시료 내의 바이러스 역가를 결정하기 위해 플라크 분석을 수행하며, 먼저 바이러스 상층액을 단계별로 희석하여 플라크 분석을 시작합니다.먼저 멀티채널 피펫을 사용하여 96 웰 플레이트에 배지 270 µL를 첨가합니다. 첫 번째 행은 비워 둡니다. 그런 다음 96 웰 플레이트의 첫 번째 행에 상층액 200 µL를 첨가하며, 각 샘플은 3반복으로 분주합니다.다음으로, 첫 번째 행의 샘플 30 µL를 다음 행으로 옮기고 혼합합니다. 그다음 혼합물 30 µL를 다음 행으로 옮기고 혼합합니다. 이 단계를 여러 번 반복하여 10배 단계 희석을 수행합니다.다음으로, 희석된 바이러스 상층액을 세포 단층 위에 첨가합니다. 24-웰 플레이트를 사용하십시오. 플레이트를 배양기에 넣고 2시간의 배양 기간 동안 30분마다 플레이트를 흔들어 줍니다. 배양이 끝난 후, 세포 잔해를 제거하기 위해 플레이트에서 상층액을 흡입하여 제거합니다.그 후 신선한 배지로 세포를 한 번 세척합니다. 세척 후, 메틸셀룰로오스가 포함된 배지를 세포에 첨가합니다. 세포를 4~6일 동안 배양합니다.4~6일이 지난 후, 현미경을 사용하여 각 샘플의 플라크 수를 측정합니다. 각 희석 배수별 플라크 수를 기록하십시오.그다음 평균과 표준 편차를 계산합니다. 플라크 수가 너무 많거나 적은 웰은 타이터(titer)를 정확하게 계산하는 데 사용할 수 없습니다. 따라서 각 샘플에 대해 플라크 수가 7개에서 70개 사이인 희석 배수를 사용하십시오.1,000배 희석된 이 시료는 웰당 평균 23개의 플라크를 형성합니다. 희석되지 않은 용액의 바이러스 역가를 계산하려면, 희석 배수와 플라크 수, 그리고 1mL당 마이크로리터 수를 모두 곱합니다. 그다음, 이를 웰당 첨가된 희석 상층액의 부피로 나눕니다.따라서 이 예시에서는 1000 × 23 plaques × 1000 µL/mL ÷ 100 µL = 2.3 × 10⁵ forming units/mL이 됩니다. 다음으로, 알려진 역가(titer)를 가진 바이러스 스톡 용액을 사용하여 마우스 배아 섬유아세포에서 γHV68의 성장 역학을 결정합니다. 우선, 야생형(wild type) 및 특정 호스트 유전자가 결핍된 마우스 세포를 24-well 플레이트에 well당 10,000 cells로 분할하여 배양합니다. 다음 날, 각 well의 배지를 0.5 mL의 낮은 MOI γHV68 현탁액으로 교체합니다.플레이트를 37 °C 인큐베이터에 넣고 2시간 동안 배양합니다. 배양 과정 중 30분마다 플레이트를 흔들어 줍니다. 피펫을 사용하여 바이러스 현탁액을 제거하고, 8% fetal bovine serum이 함유된 신선한 complete DM EM 0.5 mL를 바이러스 감염 세포에 첨가합니다.감염 후 며칠 간격으로 세포를 다시 인큐베이터에 넣습니다. 피펫팅을 여러 번 반복하여 부유 세포를 수확합니다. 수확한 세포를 멸균된 1.5 milliliter 원심 분리 튜브로 옮긴 후, 즉시 minus 80 degrees Celsius에서 급속 냉동하여 세포로부터 gamma HV 68을 방출시킵니다.동결-해동 과정을 3회 반복합니다. 세포를 37 °C에 두어 해동합니다. 그 다음 볼텍스(vortex)한 후 다시 -80 °C 냉동고에 보관합니다.숙주 유전자 또는 바이러스 유전자의 결핍이 DNA 또는 RNA 복제에 영향을 미치는지 확인하기 위해, 앞서 설명한 대로 NIH 3T3 또는 BHK 21 단일층을 이용한 플라크 분석법으로 바이러스 역가를 결정합니다. 감염 후 여러 날짜의 감염된 세포에서 시작하여, 상층액을 제거하고 세포를 차가운 PBS로 헹군 뒤 트립신으로 세포를 분리합니다. 그다음 실온에서 1000 RCF로 1분간 원심분리하여 세포를 펠렛화하고, 원심분리 후 상층액을 제거한 뒤 세포를 -80 °C에서 보관합니다.숙주 및 바이러스 유래의 총 DNA와 RNA를 추출합니다. 그다음 스핀 컬럼을 원심 분리합니다. 총 DNA와 바이러스 용해 전사체 특이적 프라이머를 사용하여 실시간 PCR을 수행합니다.베타 액틴(beta actin)과 같은 숙주 하우스키핑 유전자를 기준으로 세포 내 gamma HV 68 게놈의 상대적 양을 측정합니다. 전체 RNA와 oligo DT 프라이머를 사용하여 cDNA를 준비합니다. 상술한 cDNA와 프라이머를 사용하여 실시간 PCR을 수행함으로써 바이러스 전사체의 상대적 양을 결정합니다.숙주 하우스키핑 유전자와 비교하여, 여기에 표시된 바와 같이 Mavs는 mitochondrial antiviral signaling의 약어입니다. Mavs 어댑터 분자는 세포질의 rig-like 수용체로부터 신호를 전달하여 NF kappa B와 인터페론 조절 인자인 IRFs를 활성화하며, 이는 결과적으로 전염증성 사이토카인과 인터페론의 유전자 발현을 상향 조절합니다. gamma HV에 감염된 야생형 마우스와 Mavs 결핍 litter mate 마우스의 폐 내 바이러스 양이 여기에 나타나 있습니다.Mavs 결핍은 감염 후 10일째 폐의 바이러스 부하를 현저히 감소시켰으며, 이는 in vivo에서의 효율적인 바이러스 감염을 위해 Mavs가 필수적임을 나타냅니다. 이 그림은 야생형 마우스 배아 섬유아세포와 Mavs 결핍 마우스 배아 섬유아세포에서의 바이러스 다단계 성장 곡선을 보여줍니다. 마우스 배아 섬유아세포에서 바이러스 성장이 현저히 지연되었으며, 이는 in vitro에서의 효율적인 바이러스 복제에 Mavs가 필요함을 시사합니다. $\gamma$HV68이 감염된 마우스 배아 섬유아세포 내 바이러스 용해성 유전자의 mRNA 수준을 실시간 PCR로 분석한 결과, Mavs 결핍 시 세 가지 필수 용해성 유전자의 mRNA 수준이 유의하게 감소했습니다.이 모든 결과는 종합적으로 Mavs가 gamma HV 68의 전사 활성화와 용해성 복제에 필수적이라는 결론을 뒷받침합니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 VO와 Vevo 모두에서 호스트-병원체 상호작용을 여러 수준에서 조사하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 병원체를 다루는 작업은 매우 주의가 필요하다는 점을 잊지 마십시오.실험을 진행하는 동안 개인 보호 장구 착용과 같은 주의 사항을 준수해야 합니다.

dissecting-host-virus-interaction-lytic-replication-model

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

프로토콜은 헤르페스 바이러스 1 형 (HSV-1) 대기 시간과 재활 성화를 단순 공부하는 효율적이고 재현성 모델 시스템을 설명합니다. 분석은 동질적인 교감 신경 세포 배양을 고용하고 RNA 간섭 및 재조합 단백질의 표현을 포함한 다양한 도구를 사용하여 바이러스 신경 세포 상호 작용의 분자 해부을 허용합니다.

헤르페스의 연구를위한 예비 신경 세포 문화 시스템은 바이러스 지연 및 재가입을 단순

alphaherpes 바이러스 감염의 라이브 셀 이미징 직접 수송 및 간 스프레드의 동적 이벤트 분석을 할 수 있습니다. 여기, 우리는 차 신경의 감염시 바이러스 어셈블리의 시각화를 촉진하기 위해 형광 융합 단백질을 발현하는 재조합 바이러스의 변종을 활용 방법론을 제시한다.

Alphaherpes 바이러스 선행 성 전송 및 확산의 라이브 셀 이미징

우리는 인간 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스 (KSHV)와 엡스타인 - 바 바이러스 (EBV)와 밀접하게 관련되는 모델 헤르페스 바이러스, 뮤린 감마 허피스 바이러스 68 (γ HV68)로 감염된 마우스에서 항 바이러스 사이토 카인 생성을 측정하기 위해 프로토콜을 설명한다. 유전자 변형 마우스 종자와 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)를 활용하여, 우리는 항 바이러스 사이토 카인 생산 생체 내 및 생체 모두를 평가. 렌티 바이러스 전달하여 녹아웃 배아 섬유 아세포에서 선천성 면역 구성 요소의 표현을 "재구성", 우리는 더 특정 선천성 면역 분자를 정확하게 지적하고 차등 항 바이러스 사이토 카인의 생산을 조절하는 중요한 신호 이벤트를 해부하다.

사이토 카인 생산의 바이러스 성 회피에 타고난 면역 신호를 해부

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모델 Herpesvirus의 Lytic 복제의 해부 호스트 바이러스 상호 작용

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