Name: 형광에 의한 신경 조직의 영구 DNA 바이러스의 게놈 및 성적 증명서의 검출 현장에서 하이브리드 면역 염색과 결합 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: 배우세요 형광 현장 하이브리드화를 이용해 마우스 삼차신경절에서 단순포진바이러스 1형 게놈을 검출하는 방법입니다. 이 기술은 감염된 뉴런 핵 내 바이러스 위치를 시각화하여 잠복 감염 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 HSV-1에서 샘플을 제공 N. 사우 (신시내티 아동 병원 의료 센터, 신시내티, 오하이오, 미국), S. Efstathiou (영국 케임브리지 대학)와 제임스 힐 (LSU 건강 과학 센터, 뉴 올리언스, 미국) 감사 각각 생쥐와 토끼를 감염 및 시약, 도움이 토론 H. 마스 모토 (카즈 사 DNA 연구소, 치바, 일본)와 S. Khochbin (문화원 알버트 Bonniot, 그르노블, 프랑스). 이 작품은 (PL, http://www.cnrs.fr에 ATIP 프로그램) 센터 국립 드 라 공들인 Scientifique (CNRS)에서 교부금, 프랑스의 국립 연구 기관 (ANR) (ANR-05-MIIM -에 의해 투자되었다 008-01, CENTROLAT, <a href="http://www.agencenationale-recherche.fr">http://www.agencenationale-recherche.fr</a> ), FINOVI 재단 ( <a href="http://www.finovi.org/:fr:start">http://www.finovi.org/:fr:start</a> ), LabEX DEVweCAN (ANR-10-LabX에-61 ) Université 드 리옹, 프로그램 내에서 &quot;InvestissemenTS 디 Avenir에서 &quot;(ANR-11-IDEX-0007) ANR에 의해 운영 ( <a href="http://www.agence-nationale-recherche.fr">http://www.agence-nationale-recherche.fr</a> ), L&#39; 협회 라 공들인 contre 르 암 (ARC-7979과 ARC를 부어 4910, <a href="http://www.arc-cancer.net">http://www.arc-cancer.net</a> ), 라 리그 국립 Contre 르 암 (LNCC, <a href="http://www.ligue-cancer.net">http://www.ligue-cancer.net</a> ), 잉카 (EPIPRO 프로그램 <a href="http://www.e-cancer.fr">http://www.e - cancer.fr</a> ). FC와 PL은 CNRS의 연구원입니다.

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 쥐 신경 조직 섹션의 뉴런 사이 HSV-1 잠상 게놈의 검출을 허용한다. 바이러스 유전자 발현을 조절하는 경로에 대한 우리의 이해는 신경 조직 내에서 동일 반응계에서 HSV-1 게놈 DNA를 검출하는 방법의 부족에 의해 제한되었다. 게놈 복사 번호 감염된 신경 세포의 비율에 대한 정보는 해리 신경 세포 (11, 12)에 대한 PCR 분석을 주로했다. HSV-1 대기의 역할에 호스트 세포의 핵 구조를 해명에서, 우리는 잠재적으로 감염된 쥐의 신경 세포의 핵 내에 DNA-FISH에 의한 잠재 HSV-1 게놈의 현지화를 결정하기 위해 설정합니다. 우리는 DNA-FISH 프로토콜 및 조직 치료의 다양한 테스트 및 바이러스 DNA-FISH 검출의 필수 단계로 열 기반 &quot;에피토프 마스크 해제&quot;를 발견했다. 이러한 치료는 정기적으로 면역 조직 화학 염색을 위해 파라핀 섹션 내에서 단백질 항원을 표시하는 데 사용됩니다. 그것은 거의 보편적으로 사용되지만병리, 그...

<html> 단순 포진 바이러스 타입 1 (HSV-1)은 복제하고 확산하기 위해 주기적으로 재 활성화되는 말초 신경계의 삼차 신경절 (TG)의 뉴런에서 장기 잠재 감염을 수립, 지속적인 인간의 신경성 바이러스입니다. HSV-1 유전자는 숙주 세포의 게놈 1,2에 통합하지 않는 다중 사본 chromatinized 플라스미드를 유지 호스트 신경 세포의 핵에있는 1백50킬로바이트 dsDNA의 지역화입니다. 대기 시간 동안, HSV-1 증식하는주기 유전 프로그램은 강력하게 억제하고, 유전자 발현이 지연 설립에서 재 활성화 3 개시의 지연에 관련된 성적 증명서 (LAT) 현장에 제한됩니다. LAT는 주요 2킬로바이트 안정 올가미로 처리 긴 8.5 KB 비 암호화 RNA, 그리고 몇 가지의 miRNA 4-7을 생산하고 있습니다. HSV-1 지연 따라서 바이러스 게놈 DNA, LAT의 RNA, 및 검출 증식하는주기 단백질의 부재의 존재에 의해 특징입니다. &quot;ontent&gt; 동물 모델을 주로 쥐와 토끼, 인간의 대기 시간의 몇 가지 기능을 recapitulating 실험 모델입니다. 그 모델의 주요 관심사 중 하나는 그들이 면역 호스트에서 HSV-1 대기의 생리 학적 측면을 연구 할 수 있다는 것입니다. 지난 수십 년 동안 이러한 유전자 변형 바이러스 및 마우스와 같은 많은 실험 도구, 생리학, 유전학, 동물 조직에서 HSV-1 대기의 세포 생물학을 연구하기 위해 개발되었다. 지금까지 바이러스 게놈 DNA가 검출과 정량 남부 오점으로되었다 해리 TGS에서 qPCR에가. 그러나, 현재 조직 섹션 8. 결과적으로, 대기 시간이 정기적으로 현장 하이브리드의 RNA에 의해 LAT RNA의 검출보다는 통해 조직 학적 섹션에 평가됩니다에 현장 하이브리드 화에 의해 HSV-1 유전자를 검출 할 수있는 방법이 없습니다 바이러스 게놈 검출.는 바이러스 게놈의 존재, 생에 근거 감염된 세포를 특성화하는 것이 불가능했기 때문에의 기술적 한계는 바이러스 게놈 세포 및 바이러스 유전자 발현 또는 숙주 세포 - 매개 면역 반응 9,10 사이의 관계와 같은 호스트 바이러스 상호 작용의 많은 양상의 분석에 중요한 결점이다. 가장 중요한 것은, 잠재 감염의 세포 간 이질성이 상대적으로 미개척 남아 있고 마우스와 SCID 마우스에 11-17로 이식 된 인간의 감각 신경절의 신경 세포 지연의 주요 기능이 될 것으로 나타났다. 일반적으로, 그것은 셀 당 HSV-1 유전자의 카피 수는 5에서 수백에 달라 qPCR에 의해 표시되었다. LAT는 대기 시간 및 재 활성화의 중요한 규칙으로 표시되지만, 고립 된 뉴런과 현장 PCR에서의 qPCR 데이터는 잠재적으로 감염된 신경 세포의 서브 세트 만, 낮은 30 %가, LAT 궤적 11,12,18-21을 표현하는 것으로 나타났다. 방법은 숙주 세포와 바이러스 레이턴시 스타일에 티슈 영향 내의 셀룰러 환경바이러스 성 유전자 발현이 불분명하게 남아있다. 여기에서 우리는 동물의 신경 조직 섹션 내에서 낮은 복사 HSV-1 게놈 DNA의 효율적인 검출을위한 현장 하이브리드 화 (물고기) 방식으로 강력한 형광을 설명합니다. 이 방법은 설계 및 숙주 세포 내 핵 부품 (22)과 함께 바이러스 게놈의 상호 작용을 연구하는 데 필요한 고해상도 현미경 이미징에 대한 액세스를 얻기 위해 우리가 사용되었다. 또한, 우리는 바이러스 유전자 발현을 조절 바이러스 호스트 상호 작용을 설명하기위한 유일한 도구이다 RNA 및 단백질과 바이러스 성 DNA의 동시 검출을위한 다수의 염색 방법을 서술. 상기 방법은 또한 다수의 섹션에 감염된 신경 정량화로서 HSV-1 잠상 게놈의 검출을 요구하는 분석의 넓은 범위에 적용될 수있다. 주요 단계는 하이브리드에 바이러스 DNA에 액세스 할 수 있도록 항원 검색 처리를 적용하는 것입니다. 따라서,이 프로토콜은 검출에 효율적입니다동물 조직 내에서 기존의 DNA-FISH 방식에 의해 현재 검출되지 않은 다른 dsDNA 바이러스의.

<table><tbody><tr><td>Balb/c 마우스</td><td>Janvier, France</td><td></td><td>6주 된 암컷</td></tr><tr><td>HSV-1 균주</td><td>SC16 균주(야생형) 참조:</td><td></td> <td>Labetoule, M. et al. Invest. 안과. Vis. Sci 44, 217&ndash; HSV-1 균주 및 바이러스 재고 준비에 대한 자세한 내용은 225 (2003)</td></tr>를 참조하십시오.<tr><td>케타민 염산염</td><td>Sigma</td><td>K2753</td><td>케타민(100mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)을 함유한 용액의 복강 내 주사</td></tr> <tr><td></td><td>Sigma</td><td>X1251</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>시그마</td><td>158127</td><td>물 90ml에 PFA 4g을 현탁합니다. 50 &micro를 더합니다. 1N NaOH의 l, 60 &deg에서 가열; C 교반과 함께 수조에서. PFA는 약 30분 안에 용해됩니다. 10x PBS 10ml를 추가합니다. 이 용액은 미리 준비하고 -20°C로 보관할 수 있습니다. 5ml 튜브에 C. 주의. 흄 후드 아래에서 조작하십시오.</td></tr><tr><td>생리학적 식염</td>수 <td>시그마</td><td>07982-100TAB-F</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS, pH 7.4 (멸균)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-015</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마</td><td>84100</td><td>1x PBS에 20% 자당 용액을 준비합니다.</td></tr><tr><td>냉동 절제 임베딩 매체 - Tissue-Tek OCT Compound</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>대형 벡터 DNA 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>12462</td><td>HSV-1 게놈을 포함하는 Cosmid 또는 BAC 벡터를 정제하고 -20°C에 저장합니다. C</td></tr><tr><td>Nick 번역 키트</td><td>Roche Applied Sciences</td><td>10 976 776 001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cy3-dCTP</td><td>GE 헬스케어</td><td>PA53021</td><td>빛으로부터 보호</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>시그마</td><td>E6758</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>G50 미니 스핀 칼럼</td><td>GE 헬스케어</td><td>27-5330-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>연어 정자 DNA 10 mg/ml</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>15632-011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>에탄올 분자 생물학 등급</td><td>Sigma</td><td>87047</td><td>70% 용액 준비</td></tr><tr><td>연어 정자 DNA</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>15632-011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>포름마미드 분자생물학 등급</td><td>시그마</td><td>F9037</td><td>주의. 흄 후드 아래에서 조작하십시오.</td></tr><tr><td>HSV-1 비오틴화 상업용 프로브&nbsp;</td><td>엔조 생명과학</td><td>ENZ-40838</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ImmEdge 소수성 펜</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>20x 식염수 구연산나트륨(SSC)</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td>ddH20에서 2x SSC 용액을 준비합니다.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>10% 원액을 물에 넣고 +4°C에서 보관합니다. 사용 직전에 1x PBS에 0.5% 용액을 준비합니다.</td></tr><tr><td>10mM 구연산나트륨 pH 6.0</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td>100mM 원액(10x)을 준비합니다. 구연산 10.5g(MW 210.14)의 무게를 잰다. 주의, 자극성 및 독성이 있으므로 적절한 마스크와 장갑을 착용하고 400ml의 물에 녹입니다. 6.0N NaOH로 pH를 1로 조정합니다(주의, 자극성, 장갑 착용). 증류수와 함께 500ml로 조정하십시오. 사용하기 전에 증류수에 10배 희석하십시오.</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>시그마</td><td>320099</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>메탄올, 분자 생물학 등급</td><td>시그마</td><td>322415</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>덱스트란 황산염 - MW 500,000</td><td>Euromedex</td><td>EU0606-A</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Denhardt의 솔루션 (100x)</td><td>Euromedex</td><td>1020-A</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>고무 시멘트 "FixoGum"</td><td>Marabut</td><td>290110000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA 정제 키트&nbsp; - Qiaquick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>T7 in vitro 전사 키트</td><td>Ambion Life Technologies</td><td>AM1314</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>비오틴-16-UTP</td><td>로슈 응용 과학</td><td>11388908910</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RNA 정제 미니컬럼</td><td>Qiagen</td><td>73404</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>리보뉴클레오시드 바나딜 복합체</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>S1402S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma</td><td>H3410</td><td>증류수에 3% 용액을 준비합니다. +4 &deg에 저장하십시오. C는 빛으로부터 보호하십시오.</td></tr><tr><td>효모 tRNA</td><td>Invitrogen</td><td>15401011</td><td>RNAse 무료 물에 10 mg/ml 용액을 준비합니다</td></tr>. <tr><td>일반 염소 세럼</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr>1<td>차 항체</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td>결과 섹션에서 사용된 1차 항체는 다음과 같습니다: anti-mouse CENP-A (rabbit mAb C51A7, Cell Signaling Technologies) 및 anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology)</td></tr><tr><td>2차 형광 항체</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td></td><td>프로토콜에서 일상적으로 사용되는 형광 2차 항체는 Alexa Fluor labeled goat antibodies (IgG H+L)입니다. 결과 섹션에 사용된 항체는 Alexa Fluor 488(참조 A11001)로 분류된 항토끼 염소 항체입니다</td></tr>.<tr><td>티라미드 신호 증폭(TSA) 키트 - Streptavidin + Alexa Fluor 350(파란색 형광)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>#T20937</td><td>TSA 키트는 Perkin Elmer</td></tr><tr><td>Tyramide Signal Amplification(TSA) 키트인 Streptavidin + Alexa Fluor 488(녹색 형광)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td>에서도 사용할 수 있습니다<td>#T20932</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>H3570</td><td>0.5 &마이크로를 준비합니다. 사용 직전에 1x PBS에 있는 g/ml 해결책. 남은 용액을 버리십시오.</td></tr><tr><td>22 mm x 50 mm 커버슬립. N&DEG; 1.5 유리</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72204-04</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>페이딩 방지제가 함유된 마운팅 매체 - VECASHIELD</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>또 다른 일반 제품은 Electron Microscopy Science Superfrost 유리 슬라이드의 Fluoromount G입니다</td></tr>. <tr><td></td><td>FisherScientific</td><td>12-550-15</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>장비 / 재료</td><td>회사</td><td>참조</td><td>참고</td></tr><tr><td>: 감염</td><td></td><td></td> 용 바늘 <td>유리 마이크로 피펫 열간 인발. 맞춤 제작.</td></tr><tr><td>해부 장비</td><td>Moria, France</td><td></td><td>Microsurgical 가위 및 집게</td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Cole Palmer Instruments</td><td></td><td>Easyload Masterflex</td></tr><tr><td>Microsyringe 펌프 장치 (나노 펌프)</td><td>kdScientific</td><td>KDS310</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>크라이오스탯</td><td>라이카 프랑스</td><td>CM 1510-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>-80 > C 냉동고</td><td>산요</td><td></td><td>울트라 로우 -80 &deg; C</td></tr><tr><td>가정용 전자 레인지</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>드라이 블록 히터</td><td>Eppendorf</td><td>022670204</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>인큐베이터 슬라이드 해자</td><td>Boekel Scientific</td><td>240000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>코플린 항아리</td><td>도미니크 더처</td><td>68512</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>스테인링 글라스 용기</td><td>Dominique Dutscher</td><td>68506</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td>결과 섹션에 제시된 이미지는 Zeiss AxioObserver를 사용하여 objective 40X LD NeoFluor N.A 0.6 및 100X PlanApochromat N.A 1.3으로 수집되었습니다. 필터 세트 #38, #43 및 #43. HXP 120 형광 광원. 광도 CoolSNAP HQ2 CCD 카메라. Zeiss AxioImager/AxioObserver 시리즈, Nikon Ti-E/Ni-E 시리즈 또는 Leica DM/DMI6000 시리즈와 같은 최신 고효율 현미경에서 신호를 더 쉽게 관찰할 수 있습니다</td></tr></tbody></table>.

형광에 의한 신경 조직의 영구 dna 바이러스의 게놈 및 성적 증명서의 검출 현장에서 하이브리드 면역 염색과 결합

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

유전자의 단일 세포 codetection, 그 RNA 제품 및 세포 조절 단백질의 유전자 발현 조절을 연구하는 것이 중요합니다. 이 바이러스학 분야의 도전, 특히 핵 복제 지속적인 DNA 바이러스에 대한 자신의 연구를위한 동물 모델을 포함하는. 단순 헤르페스 바이러스 1 형 (HSV-1) 말초 신경에있는 평생 잠복 감염을 확립한다. 잠재 바이러스가 재 활성화하고 새로운 포진 에피소드를 유도있는 저수지 역할을합니다. HSV-1 대기 세포 생물학 의한 동물 모델에서 반응계에서 HSV-1 게놈을 검출하는 방법의 부족 부분에서 제대로 이해 남아있다. 우리는 접근 방식이 효율적으로 감염된 동물 모델에서 신경 조직의 섹션 내에서 낮은 복사 바이러스 게놈을 검출하는 현장 하이브리드 화 (물고기)의 DNA 형광을 설명합니다. 이 방법은 열 기반의 항원 마스크 해제에 의존 직접 표시 집에서 만든 DNA 프로브, 또는 상업적으로 이용 가능한 프로브. 우리는 트리플 스테인레스로 개발닝 방법, 각 염색의 요구 사항을 수용하기 위해 과산화 효소 기반의 신호 증폭을 사용하여, RNA-FISH 및 면역과 DNA-FISH를 결합. 주요 개선은 공 초점 현미경과 넓은 필드 종래의 표면 형광에 의해 고해상도로 영상화 할 수있는 10 μm의 조직 섹션, 낮은 배경 신호 내에서 획득 할 수있는 기능입니다. 또한, 트리플 염색은 세포 및 바이러스 단백질에 대한 항체의 다양한했다. 전체 프로토콜은 조직 내에서 항체 프로브의 침투를 수용하기 위해 2.5 일이 소요된다.

광범위한 테스트의 몇 개월 후, 우리는 열 기반의 화학 마스크 해제는 현장 하이브리드 화에 형광에 대한 잠재 HSV-1 게놈 사용할 것을 발견했다. 프로세스 동안, 우리는 다양한 마스크 제거 절차를 시도하고, 단지 열 기반 치료법 (즉, 전자 레인지에 서브 비등점까지 가열 부) 효율적인 나타났다. 우리는 일상적으로 0.01 M의 pH를 6.0 구연산 버퍼 (우리는 우리의 연구에 사용 된), 1X PBS, 1mM의 EDTA, 0.1 M 등의 항원 결정기 (31, 32)를 검색하기 위해 면역 조직 화학 (IHC)과 전자 현미경에 사용되는 여러 소금 버퍼를 테스트 트리스 - 염산 pH 7.4의 증류수. EDTA 버퍼가 조직을 손상하는 경향이 있지만, 다른 모든 버퍼는 신경 세포의 핵 내에 같은 하나 또는 여러 개의 반점 (그림 2A, 이러한 조직이 고도의 자동 형광 일부에 표시되어 있습니다 나타납니다 HSV-1 검출에 적합한했다 cytop에 균일 한 ...

우리는 동물 모델의 조직 섹션 내의 영속 DNA 바이러스 게놈의 검출을 위해 현장 하이브리드 프로토콜에 형광등을 설치했다. 이 프로토콜은 바이러스 게놈의 codetection, 자사의 RNA 제품, 단일 세포 내에서 바이러스 또는 세포 단백질에 의해 감염 과정을 연구 할 수 있습니다.

형광에 의한 신경 조직의 영구 DNA 바이러스의 게놈 및 성적 증명서의 검출 현장에서 하이브리드 면역 염색과 결합

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 형광 인시튜 하이브리다이제이션(fluorescent in situ hybridization)을 통해 잠복 감염된 마우스의 삼차신경절 절편에서 1형 단순포진 바이러스(herpes simplex virus, type one)의 게놈을 검출하는 것입니다. 이를 위해 먼저 동물의 입술에 바이러스를 접종한 후 28일간의 배양 기간을 거쳐 바이러스가 삼차신경절에 정착하도록 합니다. 그다음, 삼차신경절을 적출하여 포매한 뒤 동결 절편을 제작합니다.절편은 소듐 시트레이트 완충액에서 가열하는 핵심 단계를 포함하여 여러 전처리 과정을 거칩니다. 마지막으로, 헤르페스 특이적 형광 프로브를 사용하여 형광 인시튜 하이브리다이제이션(fluorescent in situ hybridization)을 수행합니다. 최종적으로, 공초점 현미경을 통해 개별적으로 감염된 뉴런의 핵 내에서 바이러스 게놈의 위치를 확인할 수 있습니다.많은 경우, 다양한 생애 주기를 연구하기 위해서는 동물 모델의 사용이 필요합니다. 여기에 소개된 기술의 주요 장점은 체내 유동화 접근법을 사용하여 단일 세포 수준에서 데이터를 제공한다는 점입니다. HS 감염의 토끼 모델은 인간의 HSV 1 감염의 자연사와 관련된 대부분의 양상을 재현합니다.이것은 해당 바이러스의 자연 숙주입니다. 1차 감염은 구강 조직에서 일어나며, 이후 바이러스는 입술에서 삼차신경절로 진행됩니다. 이곳이 인간에게서 HSV 잠복 감염이 일어나는 주요 부위이며, 두 가지 면역 염색법을 결합하여 확인하였습니다.이 방법은 바이러스가 핵 구성 요소와 어떻게 상호작용하는지, 그리고 이러한 상호작용이 잠복 상태의 유지와 궁극적인 바이러스 재활성화에 어떻게 영향을 미치는지와 같은 헤르페스 바이러스 잠복과 관련된 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 시작하기 위해, 마취된 마우스와 페놀 레드 프리 배지에 재현탁된 HSV one 바이러스 스톡 용액을 준비하십시오.쌍안 실체 현미경을 사용하여 왼쪽 윗입술의 점막피부 경계부 상피하층에 바늘을 삽입합니다. 5초에 걸쳐 바이러스 용액 0.5 µL를 주입한 다음, 동일한 부위에 바이러스를 두 번째로 주입합니다. 마우스가 깨어날 때까지 37 °C 인큐베이터 또는 가열 패드로 옮깁니다.그 후, 텍스트 프로토콜에 따라 관류 고정(perfu fixing)을 하기 전까지 필요한 회복 시간 동안 홈 케이지에 넣어 둡니다. 하악의 양측을 절개합니다. 그런 다음, 비강이 드러나도록 절치 바로 뒤쪽의 코 끝부분을 절개합니다.가위로 입천장을 절반으로 자른 후 옆으로 치워둡니다. 삼차신경절은 입천장 아래에 위치합니다. 이는 길이 2~3 mm의 흰색 타원형 덩어리이며 삼차신경에 연결되어 있습니다.신경절 양측의 삼차신경 분지를 절단하여 뇌간에서 분리합니다. 수술용 집게를 사용하여 신경절을 제거한 후, PBS 내 20% Sucrose 용액으로 옮겨 24시간 동안 배양합니다. 다음 날 상온에서 두 삼차신경절을 하나의 동결 절편 블록에 포매합니다.매립제에 넣은 블록을 크라이오스탯으로 절편을 만들 때까지 -80 °C에서 냉동합니다. 삼차신경절을 길이 방향으로 10 µm 두께의 절편으로 자르고, 30 °C로 가온한 SuperFrost 슬라이드 위에 수집합니다. 슬라이드 한 장에 4~5개의 절편을 올릴 수 있습니다.슬라이드에 여러 개의 시리즈 라벨을 지정하는 것이 유용할 수 있습니다. 여러 단계의 후속 응용 분석이 계획되어 있다면, 슬라이스를 -80 °C에서 보관하기 전에 5~10분 동안 건조시키십시오. 본 프로토콜에서는 NIC 번역을 통해 HSV 1 게놈의 30 kb 부분을 포함하는 cosmid를 SI 3D CTP로 라벨링하여 프로브를 준비합니다.이는 탈이온 형태아미드(form amide) 내에서 침전 및 현탁되며, 1일 차에 S SI three가 통합되어 분홍색으로 나타나야 합니다. 슬라이드를 상온의 슬라이드 홀더에 놓고 절편을 10분 동안 건조시킵니다. 그런 다음 1X PBS에서 절편을 10분 동안 재수화합니다.다음으로, 0.5% Triton X 100이 포함된 1X PBS에서 조직을 20분 동안 투과화합니다. 그 후, 슬라이드를 2X XSS로 각 10분씩 3회 세척하고, 언마스킹 버퍼가 가열될 때까지 2X XSSC에 보관합니다. 언마스킹을 위해, 시트르산 버퍼가 끓을 때까지 전자레인지로 예열합니다.유리 슬라이드 트레이에 버퍼 200 milliliters를 채워 준비합니다. 증류수 500 milliliters가 담긴 더 큰 용기에 트레이를 넣고 버퍼가 끓을 때까지 예열합니다. 그 다음 슬라이드를 트레이로 옮깁니다.마이크로웨이브 안에서 슬라이드가 완충액으로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 완충액이 끓을 때까지 약 20초 동안 완충액 속에서 슬라이드를 가열하십시오. 완충액이 넘치지 않도록 주의하십시오.그 다음 슬라이드를 상온에서 2분 동안 냉각시키고 가열 사이클을 6회 더 반복합니다. 언마스킹 단계의 재현성을 위해서는 가열 사이클의 횟수와 지속 시간을 경험적으로 결정하는 것이 중요합니다. 전자레인지, 트레이, 용기, 트레이 내 완충액의 부피 등이 이에 영향을 미칩니다.가열이 끝났을 때 용기 내의 수분 부피가 동일하게 유지되어야 합니다. 슬라이드를 흄 후드 내에서 두 개의 XSSC에 5분 동안 옮겨 두고, 메탄올, 아세트산 및 PBS가 3:1:4 비율로 혼합된 용액에서 15분 동안 슬라이드를 배양합니다. 그 다음, 새로 조제한 메탄올과 아세트산의 3:1 혼합액에서 슬라이드를 15분 동안 배양합니다.이제 70% ethanol에서 10분간 연속으로 배양한 후, 순수 ethanol에서 10분씩 두 번 배양하여 절편을 탈수합니다. 슬라이드를 실온에서 10분 동안 건조시켜 프로브 처리 준비를 합니다. 건조된 절편에 프로빙 용액 80 µL를 한 방울씩 가한 다음 커버슬립으로 덮어줍니다.프로빙 용액이 커버슬립 표면 전체에 고르게 퍼졌는지, 기포는 없는지 확인하십시오. 그 다음, 고무 시멘트로 커버슬립을 밀봉하고 건조시킵니다. 슬라이드를 80 °C에서 5분 동안 배양하여 변성을 진행하십시오.그런 다음 슬라이드를 얼음 위에 놓인 금속 트레이로 빠르게 옮겨 5분 동안 둡니다. 이어서 다음 날 37 °C에서 하룻밤 동안 하이브리드화를 진행합니다. 슬라이드를 37 °C 히팅 블록 위에 둔 상태에서 핀셋으로 고무 시멘트를 제거합니다.메스 날 끝을 이용하여 커버 슬립을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 절편을 SSC로 반복해서 세척합니다. 이제 1 XPBS에 0.5 µg/mL 농도로 희석한 DAPI 또는 Hoechst 33342와 같은 적절한 염색약으로 샘플을 10분 동안 염색합니다.그 후 슬라이드를 1X PBS로 10분씩 3회 세척합니다. 세 번째 세척 후, 슬라이드에서 액체를 최대한 제거합니다. 그런 다음 각 슬라이드의 끝부분에 항퇴색제가 포함된 마운팅 용액 80 µL를 도포합니다.기포가 생기지 않도록 주의하며 광학적 품질이 높은 커버슬립으로 배지를 천천히 덮습니다. 그 후 매니큐어로 슬라이드를 밀봉하고 4 °C의 암소에 보관합니다. 본 프로토콜을 개발하는 과정에서 항원 차폐 해제를 위해 여러 가지 염 버퍼를 테스트하였습니다.EDTA 완충액은 조직을 손상시키는 경향이 있었습니다. 상용 프로브로 해당 프로토콜이 작동하는지 확인하기 위해 Sodium citrate tris, HCL 및 증류수가 HSV one 검출에 적합한 것으로 나타났습니다. Enzo Biochem에서 구입한 PAN HSV one biotinylated 프로브를 사용하여 HSV one 잠복 게놈 검출을 수행하였으며, HSV one 게놈의 단일 및 다중 스팟 패턴을 모두 검출할 수 있었습니다.또한, DNA FISH 프로토콜을 세 가지의 흔히 사용되는 HSV-1 균주에 감염된 마우스와 토끼를 대상으로 테스트하였습니다. 모든 경우에서 HSV-1 게놈은 밝기와 강도가 다양한 점상의 신호를 나타냈습니다. 아울러, 전신 헤르페스 감염이 진행 중인 마우스의 조직에 DNA FISH를 수행함으로써 HSV-1의 복제 주기에서의 프로토콜 적용 가능성을 테스트하였습니다.이 동물들의 DRG, 눈, 뇌를 포함한 다양한 조직에서 HSV 1 게놈의 크고 밝은 응집체가 검출되었습니다. DNA FISH 프로토콜은 매우 다재다능합니다. 이 방법은 HSV 1 게놈과 바이러스 또는 세포의 RNA 및 단백질을 동시에 검출할 수 있게 해줍니다.예를 들어, HSV 1 게놈과 HSV 1 lat RNA의 공동 검출이 가능합니다. HSV 1 게놈과 Centro MERIC 단백질인 CE NPA A와 같은 세포 단백질의 공동 검출이 활용되었으며, 염색질 및 PML 핵체와 HSV 1의 공동 검출이 이루어졌습니다. 관련 단백질인 A TRX는 삼중 염색으로 시각화되었으며, HSV 1D NA는 빨간색으로, 그 RNA 산물인 lat은 파란색으로, A TRX는 초록색으로 나타났습니다.언마스킹(unmasking) 설정이 완료되면, DNA fish 절차는 매우 견고하게 진행됩니다. 이 과정은 20장 이상의 슬라이드를 한 배치로 하여 24시간 이내에 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발을 통해 헤르페스 바이러스 및 기타 지속성 바이러스를 연구하는 연구자들은 세포 구성 요소와 핵 구조가 이러한 바이러스의 생물학적 특성에 어떻게 영향을 미치는지 단일 세포 수준에서 탐구할 수 있게 될 것입니다.

detection-genome-transcripts-persistent-dna-virus-neuronal-tissues

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

현장 tetramer의 얼룩과 현장 하이브리드화 (ISTH)의 결합 기술은 시각화, 매핑 및 분석들은 바이러스에 감염된 대상으로 바이러스에 특정한 CD8 + T 세포의 공간적 근접의 이러한 면역 effectors와 대상 사이의 양적 관계의 결정을 가능하게 감염 결과 수 있습니다.

동시에 바이러스 특정 CD8 + T 세포 바이러스에 감염된 세포를 시각화하는 기술 현장에서</em

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

이 비디오에서는 MCPyV 비리온에 감염된 세포를 현장 혼성화 연쇄 반응을 통해 MCPyV 특이적 게놈을 검출했습니다. 또한 DNA-HCR 기술을 FISH와 결합하여 감염된 인간 피부 세포에서 MCPyV DNA를 시각화했습니다.

HCR-DNA FISH: 감염된 세포에서 바이러스 DNA를 검출하기 위한 형광 현장 혼성화 기술

이 비디오는 단순 포진 바이러스-1 감염에서 감염된 세포 단백질 0, ICP0 이동을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. Post-de novo synthesis, ICP0는 핵으로 전위되었다가 나중에 감염이 진행되는 동안 세포질로 이동합니다. 면역형광 현미경 검사는 단백질의 세포 내 국소화를 밝히고 분석하여 감염 단계 전반에 걸친 단백질의 이동에 대한 통찰력을 제공합니다.

감염된 세포의 바이러스 단백질 국소화를 위한 면역형광 기술

출처: Baleriola, J., et. al., Detection of Axonally localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization(고해상도 현장 혼성화를 사용한 뇌 절편에서 축삭 국소화 mRNA 검출).  J. Vis. Exp. (2015)이 비디오는 형광 현장 혼성화 및 항체 염색을 사용하여 고정 마우스 해마 절편의 콜린성 축삭 내에서 mRNA를 검출하는 방법을 보여줍니다. 형광 현미경 검사는 콜린성 뉴런에서 프로브 태그가 지정된 mRNA와 콜린 아세틸전이효소의 공간적 국소화를 보여줍니다.

Immunostaining of Neurons in Mouse Brain Slices Following Fluorescence In Situ Hybridization

특정 세포 유형에 대한 유전자 발현을 국소화하는 것은 특정 항체가 없기 때문에 어려울 수 있습니다. 여기에서는 이중 형광 RNA in situ hybridization과 immunostaining을 결합하여 유전자 발현을 동시에 삼중 검출하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

더블 형광 결합<em&gt; 현장에서</em&gt; 마우스 뇌 섹션에서 세 가지 유전자의 발현의 검출을위한 Immunolabelling와 하이브리드

바이러스 성 transcriptional 팩터리는 세포질 RNA 중 합 효소 II 다시 활성화 하는 동안 바이러스 성 유전자 전사를 증가 함께 풍성 하 게 이산 구조. 여기, 적극적으로 면역 형광 얼룩이 지 고 제자리에서 RNA 교 잡의 조합에 의해 3D 핵 공간에서 바이러스 성 염색 질을 속기의 사이트를 찾을 하는 방법을 설명 합니다.

기능 이미징 3D 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 바이러스 성 녹음 방송 공장

우리는 현탁액 또는 부착물에서 서정적으로 감염된 인간 세포 내의 다중 헤르페스 바이러스 RNA를 시각화하기 위해 situ 혼성화 (FISH)에서 형광을 활용하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 뉴클레오세포질을 생성하는 형광의 정량화를 포함하고 면역형광(IF)을 가진 숙주 및 바이러스 성 단백질의 동시 시각화를 위해 확장될 수 있다.

KSHV 감염 세포에서 특정 유전자 제품의 시투 혼성화 (FISH) 및 면역 형광 (IF)의 정량형 형광

이 프로토콜은 다중 표지 FISH 및 형광 IHC 신호를 달성하는 것을 목표로 신선 냉동 및 고정 마우스 뇌 절편 모두에서 형광 in situ hybridization(FISH)과 형광 면역조직화학(IHC)을 결합하는 방법을 설명합니다. IHC는 세포질 및 막 부착 단백질을 표적으로 삼았습니다.

Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Section(신선 냉동 또는 고정 마우스 뇌 절편에서 Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization과 형광 면역조직화학의 결합)

여기에 제시된 것은 형광 이미징 접근법, D NA, RNA및 protein (MICDDRP)의 궁극적 인 형광 C ell 기반dtection을위한 프로토콜이며, 이는 바이러스 단백질 및 다양한 유형 및 가닥의 핵산의 동시 형광 단일 세포 시각화가 가능한 방법입니다. 이 접근법은 다양한 범위의 시스템에 적용될 수 있습니다.

바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징

배우세요 형광 현장 하이브리드화를 이용해 마우스 삼차신경절에서 단순포진바이러스 1형 게놈을 검출하는 방법입니다. 이 기술은 감염된 뉴런 핵 내 바이러스 위치를 시각화하여 잠복 감염 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

형광에 의한 신경 조직의 영구 DNA 바이러스의 게놈 및 성적 증명서의 검출 현장에서 하이브리드 면역 염색과 결합

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