형광에 의한 신경 조직의 영구 DNA 바이러스의 게놈 및 성적 증명서의 검출 현장에서 하이브리드 면역 염색과 결합
2014년 1월 23일
우리는 동물 모델의 조직 섹션 내의 영속 DNA 바이러스 게놈의 검출을 위해 현장 하이브리드 프로토콜에 형광등을 설치했다. 이 프로토콜은 바이러스 게놈의 codetection, 자사의 RNA 제품, 단일 세포 내에서 바이러스 또는 세포 단백질에 의해 감염 과정을 연구 할 수 있습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 형광 제자리 교잡에 의해 잠복 감염된 마우스의 삼차신경절 절편에서 1형인 단순 헤르페스 바이러스의 게놈을 검출하는 것입니다. 이는 먼저 동물의 입술에 바이러스를 접종한 다음 바이러스가 삼차신경절에 자리 잡는 28일의 잠복기를 통해 이루어집니다. 다음으로, 삼차신경절(trigeminal ganglia)을 적출하고, 매립하고, 동결 절편합니다.
섹션은 구연산나트륨 완충액에서 가열하는 핵심 단계를 포함하여 몇 가지 준비 처리를 받습니다. 마지막으로, 형광 in situ hybridization은 헤르페스 특이적 형광 로브를 사용하여 수행됩니다. 궁극적으로, 결과는 컨포칼 현미경을 사용하여 개별적으로 감염된 뉴런의 핵 내에서 바이러스 게놈의 위치를 보여줄 수 있습니다.
많은 경우, 다양한 수명 주기에 대한 연구에는 동물 모델의 사용이 필요합니다. 여기에 표시된 기술의 주요 이점은 Institute Fluent ization 접근 방식을 사용하여 단일 세포 수준에서 데이터를 제공한다는 것입니다. HS 감염의 왕실 살인자 모델은 인간에서 HSV 1 감염의 자연사의 대부분의 측면을 재현합니다.
그것이 바이러스의 자연 숙주입니다. 1차 감염은 구강 조직에서 이루어지고, 그 후 바이러스는 입술에서 두 개의 신경절로 진행됩니다. 이것이 인간의 HS V 잠복기의 주요 측면입니다 : 두 가지 면역과 염색을 결합했습니다.
이 방법은 바이러스가 핵 구성 요소와 어떻게 상호 작용하는지, 이러한 상호 작용이 잠복 유지 및 궁극적으로 바이러스의 재활성화에 어떤 영향을 미치는지와 같은 헤르페스 바이러스 잠복기에 관한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 시작하려면 마취된 마우스와 HSV one 바이러스 원액을 준비하십시오. 페놀 레드 유리 배지에 재현탁액.
양안 입체경을 사용하여 점막 경계에 있는 왼쪽 윗입술의 상피하층에 바늘을 삽입합니다. 5 초에 걸쳐 0.5 마이크로리터의 바이러스 용액을 주입한 다음 동일한 부위에 바이러스를 두 번째 주입합니다. 마우스가 깨어날 때까지 섭씨 37도의 인큐베이터 또는 가열 패드로 마우스를 옮깁니다.
그런 다음 필요한 복구 시간 동안 홈 케이지에 넣고 perfu가 텍스트 프로토콜에 따라 수정하기 전에 넣습니다. 아래턱의 양쪽을 자릅니다. 그런 다음 앞니 바로 뒤의 코 끝을 잘라 코강을 드러냅니다.
가위로 입천장을 반으로 자른 다음 옆에 놓습니다. 삼차신경절(trigeminal ganglia)은 입천장 아래에 있습니다. 그들은 길이가 2-3mm인 흰색 직사각형 덩어리이며 삼차 신경과 연결되어 있습니다.
신경절의 양쪽에 있는 삼차신경(trigeminal nerve) 가지를 잘라 뇌간에서 분리한다. 수술용 플라이어를 사용하여 신경절을 제거하고 PBS의 20% 자당으로 옮겨 24시간 동안 배양할 수 있도록 합니다. 다음날 실온에서 두 삼차신경절을 단일 동결절편 블록에 삽입하십시오.
매립 매체를 삽입하고 저온 유지 장치에서 절단될 때까지 블록을 섭씨 영하 80도에서 동결합니다. 삼차신경절을 세로로 10미크론 절편으로 자르고 섭씨 30도로 예열된 슈퍼 프로스트 슬라이드에 수집합니다. 단일 슬라이드에 4-5개의 섹션이 들어갈 수 있습니다.
슬라이드에 여러 계열 레이블을 지정하는 것이 유용할 수 있습니다. 여러 다운스트림 적용을 계획하고 있는 경우 섭씨 영하 80도에서 보관하기 전에 슬라이스를 5-10분 동안 건조시키십시오. 이 프로토콜의 경우, 프로브는 NIC 번역에 의해 SI 3D CTP로 HSV one 게놈의 30킬로베이스 부분을 포함하는 cosms를 라벨링하여 준비합니다.
그것은 침전되고 탈 이온화 된 형태의 아미드로 현탁되며 1 일째에 S SI 3 혼입으로 인해 분홍색으로 나타나야합니다. 슬라이드를 실온의 슬라이드 홀더에 놓고 섹션을 10분 동안 건조시킵니다. 그런 다음 10분 동안 하나의 XPBS에서 섹션을 재수화합니다.
다음으로, 0.5% Triton X 100의 조직을 XPBS 1개에 20분 동안 투여합니다. 그런 다음 두 번의 XSS로 세탁할 때마다 10분 동안 슬라이드를 세 번 세척하고 마스킹 해제 버퍼가 가열될 때까지 두 개의 XSSC로 보관합니다. 마스킹을 해제하려면 버퍼가 끓을 때까지 전자레인지에서 구연산염 버퍼를 예열합니다.
이것은 유리 슬라이드 트레이에 200ml의 버퍼를 채워서 수행됩니다. 500ml의 증류수를 채운 더 큰 용기에 트레이를 넣고 끓을 때까지 버퍼를 예열합니다. 그런 다음 슬라이드를 트레이로 옮깁니다.
전자레인지에서 버퍼로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 버퍼가 끓을 때까지 약 20초 동안 버퍼의 슬라이드를 가열합니다. 버퍼가 끓지 않도록 하십시오.
그런 다음 슬라이드를 실온에서 2분 동안 식히고 가열 주기를 6회 더 반복합니다. 마스킹 해제 단계의 재현성을 위해 섭식 주기의 수와 기간을 경험적으로 결정하는 것이 중요합니다. 전자 레인지, 트레이, 용기, 트레이의 버퍼 부피.
용기의 물의 양은 가열이 완료되면 동일하게 유지되어야 합니다. 흄 후드 아래에서 5분 동안 두 개의 XSSC로 슬라이드를 옮기고 15분 동안 메탄올, 아세트산 및 PBS의 3-1-4 용액에서 슬라이드를 배양합니다. 그런 다음 새로 준비된 3:1 메탄올-아세트산 혼합물에 슬라이드를 15분 동안 배양합니다.
이제 70% 에탄올에서 10분 동안 연속적으로 배양한 다음 순수 에탄올에서 10분 배양 두 번을 통해 섹션을 탈수합니다. 슬라이드를 실온에서 10분 동안 건조시켜 프로브를 준비합니다. 건조된 부분에 80마이크로리터의 프로빙 용액을 적방울로 바르고 커버 슬립으로 덮습니다.
프로빙 용액이 커버 슬립의 전체 표면에 퍼져 있고 기포가 없는지 확인하십시오. 그런 다음 고무 시멘트로 커버 슬립을 밀봉하고 건조시킵니다. 슬라이드를 섭씨 80도에서 5분 동안 배양하여 변성을 진행합니다.
그런 다음 얼음 위의 금속 트레이에 슬라이드를 5분 동안 빠르게 옮깁니다. 다음날 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 교잡이 이어집니다. 섭씨 37도의 열 블록에서 슬라이드를 사용하여 집게로 고무 시멘트를 제거합니다.
덮개를 제거하고 메스 칼날 끝으로 부드럽게 미끄러집니다. 그런 다음 SSC로 섹션을 반복적으로 세척합니다. 이제 DAPI 또는 후크 3 3 3 4 2와 같은 적절한 염료로 10 분 동안 샘플을 1 XPBS에서 밀리리터당 0.5 마이크로 그램으로 염색합니다.
그런 다음 한 번의 XPBS로 슬라이드를 세탁당 10분 동안 세 번 세탁합니다. 세 번째 세척 후에는 슬라이드에서 가능한 한 많은 액체를 배출하십시오. 그런 다음 각 슬라이드의 끝에 80마이크로리터의 장착 매체에 변색 방지제를 적용합니다.
기포 형성을 피하면서 높은 광학 품질의 커버 슬립으로 매체를 천천히 덮습니다. 그런 다음 매니큐어로 슬라이드를 밀봉하고 섭씨 4도의 어둠 속에 보관하십시오. 이 프로토콜을 개발할 때 마스킹 해제를 위해 여러 염 버퍼를 테스트했습니다.
EDTA 완충액은 조직을 손상시키는 경향이 있었습니다. 구연산나트륨 트리스, HCL 및 증류수는 프로토콜이 상용 프로브와 함께 작동하는지 확인하기 위해 HSV 1 검출에 적합했습니다. Enzo Biochem에서 얻은 PAN HSV one biotinylated probe를 사용하여 HSV one 잠재 게놈 검출을 수행했으며, HSV one 게놈에 대한 단일 및 다중 스폿 패턴을 모두 검출할 수 있었습니다.
또한, DNA 물고기 프로토콜은 일반적으로 사용되는 3가지 HSV 1균주에 감염된 마우스와 토끼에서 테스트되었습니다. 모든 경우에서 HSV one 게놈은 밝기와 강도가 가변적인 스폿 신호를 보여주었습니다. 또한, 프로토콜의 적용 가능성은 일반적인 헤르페스 감염을 겪고 있는 마우스의 조직에 DNA 물고기를 수행하여 HSV one의 복제 주기에서 테스트되었습니다.
이 동물에서 DRG 눈과 뇌를 포함한 다양한 조직에서 HSV one 게놈의 크고 밝은 응집체가 검출되었습니다. DNA 물고기 프로토콜은 매우 다양합니다. 이를 통해 HSV one 게놈과 바이러스 또는 세포 RNA 및 단백질을 공동으로 검출할 수 있습니다.
예를 들어, HSV one 게놈과 HSV one lat RNA의 co-검출은 HSV one 게놈의 co-검출이 가능하며, Centro MERIC 단백질 CE NPA A와 같은 세포 단백질과 HSV one 게놈의 co-검출이 가능하고, 염색질 및 PML 핵체와 HSV one의 co-검출이 활용되었습니다. 관련 단백질 A TRX는 HSV 1D NA를 빨간색으로 보여주는 삼중 염색으로 시각화되었습니다. RNA 산물은 파란색, TRX는 녹색입니다.
마스킹 해제가 설정되면 DNA 물고기 절차는 매우 강력합니다. 24개 이상의 슬라이드 배치로 20시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 기술의 개발을 통해 헤르페스 바이러스 및 기타 잔류 바이러스를 조사하는 연구원들은 단일 세포 수준에서 세포 구성 요소와 핵 구조가 이러한 바이러스의 생물학에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 탐구할 수 있습니다.
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개요
이 기사는 잠복 감염된 마우스의 삼차신경절 섹션에서 단순포진바이러스 제1형 게놈을 검출하기 위해 설계된 형광 in situ 하이브리다이제이션 프로토콜을 소개합니다. 이 방법은 개별 뉴런 내에서 바이러스 게놈과 그 RNA 산물을 시각화할 수 있게 해 감염 과정에 대한 통찰력을 제공합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 바이러스학
- 세포 생물학
배경
- 단순포진바이러스 제1형은 삼차신경절에서 잠복을 설정할 수 있습니다.
- 바이러스 게놈의 위치를 이해하는 것은 감염 메커니즘을 연구하는 데 중요합니다.
- 형광 in situ 하이브리다이제이션은 조직 섹션에서 핵산을 시각화하는 강력한 도구입니다.
- 공존 현미경은 개별 세포의 상세한 이미지를 가능하게 합니다.
연구 목적
- 조직 섹션에서 단순포진바이러스 게놈을 검출하는 프로토콜을 개발하는 것.
- 감염된 뉴런에서 바이러스 게놈과 그 RNA 산물을 시각화하는 것.
- 세포 수준에서 감염 과정에 대한 이해를 향상시키는 것.
사용된 방법
- 동물 입술에 바이러스 접종.
- 바이러스가 삼차신경절에서 설정되기 위한 28일의 잠복 기간.
- 삼차신경절의 수확, 임베딩 및 냉동 섹션화.
- 포진바이러스 특이적 형광 프로브를 사용한 형광 in situ 하이브리다이제이션.
주요 결과
- 조직 섹션에서 단순포진바이러스 게놈의 성공적인 검출.
- 감염된 뉴런의 핵 내 바이러스 게놈의 위치 시각화.
- 공존 현미경을 통한 방법의 효과성 시연.
- 단일 세포 수준에서의 감염 과정에 대한 통찰력.
결론
- 개발된 프로토콜은 단순포진바이러스 잠복 연구에 효과적입니다.
- 형광 in situ 하이브리다이제이션은 바이러스 감염 역학에 대한 귀중한 정보를 제공합니다.
- 이 방법은 신경과학의 다른 바이러스 연구에 적용될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This method enables single-cell detection of persistent viral genomes in neuronal tissues, addressing a critical gap in virology research where low-copy viral reservoirs are difficult to visualize. By combining DNA-FISH with RNA-FISH and immunostaining, it provides mechanistic insights into virus-host interactions that inform target validation and antiviral screening strategies. The approach supports preclinical de-risking by clarifying viral latency mechanisms in relevant animal models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of viral genome positioning relative to nuclear components to assess mechanisms of latency maintenance.
- Scientific Value: Supports functional validation of viral and host targets by co-detecting genomes, transcripts, and proteins in individual neurons.
- Scientific Value: Facilitates hypothesis testing about viral reactivation triggers through spatial correlation of viral and cellular signals.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Produces low-background, high-resolution signals compatible with confocal and wide-field microscopy for reliable readouts.
- Operational Value: Works with both custom and commercially available probes, enabling assay flexibility and reagent standardization.
- Operational Value: Accommodates a wide range of antibodies, supporting multiplexed screening of viral and cellular markers.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Uses a clinically relevant HSV-1 latency model in mice that mirrors human neuronal infection patterns.
- Translational Value: Enables longitudinal assessment of viral reservoir dynamics in tissues, informing predictive confidence in reactivation risk.
- Translational Value: Supports biomarker discovery by linking viral genome localization to cellular regulatory proteins.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation, particularly for neurotropic viruses where tissue-specific reservoir analysis is essential.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by revealing how viral genomes interact with nuclear architecture during latency.
- Screening: Generates quantitative spatial data on viral genome copies per cell, enabling compound effect assessment in infection models.
- Analytics: Delivers multiplexed readouts (DNA, RNA, protein) that allow correlation of viral gene expression with host responses.
- Translational Research: Connects findings in rodent ganglia to human-relevant neuropathogenesis, supporting cross-species extrapolation.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to other persistent DNA viruses and tissue types, promoting platform reuse across virology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in viral persistence studies through direct visualization of viral nucleic acids.
- Operational Value: Enables reproducible tissue processing with heat-based unmasking that works across antibody and probe types.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying reservoir biology that influences reactivation-driven pathogenesis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antiviral candidates based on latency-relevant mechanism data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, tissue sectioning, and nucleic acid hybridization techniques.
- Dependent on access to cryostat, hybridization oven, and confocal or wide-field fluorescence imaging systems.
- Necessitates standardization of unmasking cycles and probe concentration across labs for consistent signal-to-noise ratios.
- Adaptation to new tissue types may require optimization of permeabilization and antigen retrieval steps.
- Protocol duration of 2.5 days necessitates batch processing planning for high-throughput applications.
