형광에 의한 신경 조직의 영구 DNA 바이러스의 게놈 및 성적 증명서의 검출 현장에서 하이브리드 면역 염색과 결합

이 실험 절차의 전반적인 목표는 형광 인시튜 하이브리다이제이션(fluorescent in situ hybridization)을 통해 잠복 감염된 마우스의 삼차신경절 절편에서 1형 단순포진 바이러스(herpes simplex virus, type one)의 게놈을 검출하는 것입니다. 이를 위해 먼저 동물의 입술에 바이러스를 접종한 후 28일간의 배양 기간을 거쳐 바이러스가 삼차신경절에 정착하도록 합니다. 그다음, 삼차신경절을 적출하여 포매한 뒤 동결 절편을 제작합니다.

절편은 소듐 시트레이트 완충액에서 가열하는 핵심 단계를 포함하여 여러 전처리 과정을 거칩니다. 마지막으로, 헤르페스 특이적 형광 프로브를 사용하여 형광 인시튜 하이브리다이제이션(fluorescent in situ hybridization)을 수행합니다. 최종적으로, 공초점 현미경을 통해 개별적으로 감염된 뉴런의 핵 내에서 바이러스 게놈의 위치를 확인할 수 있습니다.

많은 경우, 다양한 생애 주기를 연구하기 위해서는 동물 모델의 사용이 필요합니다. 여기에 소개된 기술의 주요 장점은 체내 유동화 접근법을 사용하여 단일 세포 수준에서 데이터를 제공한다는 점입니다. HS 감염의 토끼 모델은 인간의 HSV 1 감염의 자연사와 관련된 대부분의 양상을 재현합니다.

이것은 해당 바이러스의 자연 숙주입니다. 1차 감염은 구강 조직에서 일어나며, 이후 바이러스는 입술에서 삼차신경절로 진행됩니다. 이곳이 인간에게서 HSV 잠복 감염이 일어나는 주요 부위이며, 두 가지 면역 염색법을 결합하여 확인하였습니다.

이 방법은 바이러스가 핵 구성 요소와 어떻게 상호작용하는지, 그리고 이러한 상호작용이 잠복 상태의 유지와 궁극적인 바이러스 재활성화에 어떻게 영향을 미치는지와 같은 헤르페스 바이러스 잠복과 관련된 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 시작하기 위해, 마취된 마우스와 페놀 레드 프리 배지에 재현탁된 HSV one 바이러스 스톡 용액을 준비하십시오.

쌍안 실체 현미경을 사용하여 왼쪽 윗입술의 점막피부 경계부 상피하층에 바늘을 삽입합니다. 5초에 걸쳐 바이러스 용액 0.5 µL를 주입한 다음, 동일한 부위에 바이러스를 두 번째로 주입합니다. 마우스가 깨어날 때까지 37 °C 인큐베이터 또는 가열 패드로 옮깁니다.

그 후, 텍스트 프로토콜에 따라 관류 고정(perfu fixing)을 하기 전까지 필요한 회복 시간 동안 홈 케이지에 넣어 둡니다. 하악의 양측을 절개합니다. 그런 다음, 비강이 드러나도록 절치 바로 뒤쪽의 코 끝부분을 절개합니다.

가위로 입천장을 절반으로 자른 후 옆으로 치워둡니다. 삼차신경절은 입천장 아래에 위치합니다. 이는 길이 2~3 mm의 흰색 타원형 덩어리이며 삼차신경에 연결되어 있습니다.

신경절 양측의 삼차신경 분지를 절단하여 뇌간에서 분리합니다. 수술용 집게를 사용하여 신경절을 제거한 후, PBS 내 20% Sucrose 용액으로 옮겨 24시간 동안 배양합니다. 다음 날 상온에서 두 삼차신경절을 하나의 동결 절편 블록에 포매합니다.

매립제에 넣은 블록을 크라이오스탯으로 절편을 만들 때까지 -80 °C에서 냉동합니다. 삼차신경절을 길이 방향으로 10 µm 두께의 절편으로 자르고, 30 °C로 가온한 SuperFrost 슬라이드 위에 수집합니다. 슬라이드 한 장에 4~5개의 절편을 올릴 수 있습니다.

슬라이드에 여러 개의 시리즈 라벨을 지정하는 것이 유용할 수 있습니다. 여러 단계의 후속 응용 분석이 계획되어 있다면, 슬라이스를 -80 °C에서 보관하기 전에 5~10분 동안 건조시키십시오. 본 프로토콜에서는 NIC 번역을 통해 HSV 1 게놈의 30 kb 부분을 포함하는 cosmid를 SI 3D CTP로 라벨링하여 프로브를 준비합니다.

이는 탈이온 형태아미드(form amide) 내에서 침전 및 현탁되며, 1일 차에 S SI three가 통합되어 분홍색으로 나타나야 합니다. 슬라이드를 상온의 슬라이드 홀더에 놓고 절편을 10분 동안 건조시킵니다. 그런 다음 1X PBS에서 절편을 10분 동안 재수화합니다.

다음으로, 0.5% Triton X 100이 포함된 1X PBS에서 조직을 20분 동안 투과화합니다. 그 후, 슬라이드를 2X XSS로 각 10분씩 3회 세척하고, 언마스킹 버퍼가 가열될 때까지 2X XSSC에 보관합니다. 언마스킹을 위해, 시트르산 버퍼가 끓을 때까지 전자레인지로 예열합니다.

유리 슬라이드 트레이에 버퍼 200 milliliters를 채워 준비합니다. 증류수 500 milliliters가 담긴 더 큰 용기에 트레이를 넣고 버퍼가 끓을 때까지 예열합니다. 그 다음 슬라이드를 트레이로 옮깁니다.

마이크로웨이브 안에서 슬라이드가 완충액으로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 완충액이 끓을 때까지 약 20초 동안 완충액 속에서 슬라이드를 가열하십시오. 완충액이 넘치지 않도록 주의하십시오.

그 다음 슬라이드를 상온에서 2분 동안 냉각시키고 가열 사이클을 6회 더 반복합니다. 언마스킹 단계의 재현성을 위해서는 가열 사이클의 횟수와 지속 시간을 경험적으로 결정하는 것이 중요합니다. 전자레인지, 트레이, 용기, 트레이 내 완충액의 부피 등이 이에 영향을 미칩니다.

가열이 끝났을 때 용기 내의 수분 부피가 동일하게 유지되어야 합니다. 슬라이드를 흄 후드 내에서 두 개의 XSSC에 5분 동안 옮겨 두고, 메탄올, 아세트산 및 PBS가 3:1:4 비율로 혼합된 용액에서 15분 동안 슬라이드를 배양합니다. 그 다음, 새로 조제한 메탄올과 아세트산의 3:1 혼합액에서 슬라이드를 15분 동안 배양합니다.

이제 70% ethanol에서 10분간 연속으로 배양한 후, 순수 ethanol에서 10분씩 두 번 배양하여 절편을 탈수합니다. 슬라이드를 실온에서 10분 동안 건조시켜 프로브 처리 준비를 합니다. 건조된 절편에 프로빙 용액 80 µL를 한 방울씩 가한 다음 커버슬립으로 덮어줍니다.

프로빙 용액이 커버슬립 표면 전체에 고르게 퍼졌는지, 기포는 없는지 확인하십시오. 그 다음, 고무 시멘트로 커버슬립을 밀봉하고 건조시킵니다. 슬라이드를 80 °C에서 5분 동안 배양하여 변성을 진행하십시오.

그런 다음 슬라이드를 얼음 위에 놓인 금속 트레이로 빠르게 옮겨 5분 동안 둡니다. 이어서 다음 날 37 °C에서 하룻밤 동안 하이브리드화를 진행합니다. 슬라이드를 37 °C 히팅 블록 위에 둔 상태에서 핀셋으로 고무 시멘트를 제거합니다.

메스 날 끝을 이용하여 커버 슬립을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 절편을 SSC로 반복해서 세척합니다. 이제 1 XPBS에 0.5 µg/mL 농도로 희석한 DAPI 또는 Hoechst 33342와 같은 적절한 염색약으로 샘플을 10분 동안 염색합니다.

그 후 슬라이드를 1X PBS로 10분씩 3회 세척합니다. 세 번째 세척 후, 슬라이드에서 액체를 최대한 제거합니다. 그런 다음 각 슬라이드의 끝부분에 항퇴색제가 포함된 마운팅 용액 80 µL를 도포합니다.

기포가 생기지 않도록 주의하며 광학적 품질이 높은 커버슬립으로 배지를 천천히 덮습니다. 그 후 매니큐어로 슬라이드를 밀봉하고 4 °C의 암소에 보관합니다. 본 프로토콜을 개발하는 과정에서 항원 차폐 해제를 위해 여러 가지 염 버퍼를 테스트하였습니다.

EDTA 완충액은 조직을 손상시키는 경향이 있었습니다. 상용 프로브로 해당 프로토콜이 작동하는지 확인하기 위해 Sodium citrate tris, HCL 및 증류수가 HSV one 검출에 적합한 것으로 나타났습니다. Enzo Biochem에서 구입한 PAN HSV one biotinylated 프로브를 사용하여 HSV one 잠복 게놈 검출을 수행하였으며, HSV one 게놈의 단일 및 다중 스팟 패턴을 모두 검출할 수 있었습니다.

또한, DNA FISH 프로토콜을 세 가지의 흔히 사용되는 HSV-1 균주에 감염된 마우스와 토끼를 대상으로 테스트하였습니다. 모든 경우에서 HSV-1 게놈은 밝기와 강도가 다양한 점상의 신호를 나타냈습니다. 아울러, 전신 헤르페스 감염이 진행 중인 마우스의 조직에 DNA FISH를 수행함으로써 HSV-1의 복제 주기에서의 프로토콜 적용 가능성을 테스트하였습니다.

이 동물들의 DRG, 눈, 뇌를 포함한 다양한 조직에서 HSV 1 게놈의 크고 밝은 응집체가 검출되었습니다. DNA FISH 프로토콜은 매우 다재다능합니다. 이 방법은 HSV 1 게놈과 바이러스 또는 세포의 RNA 및 단백질을 동시에 검출할 수 있게 해줍니다.

예를 들어, HSV 1 게놈과 HSV 1 lat RNA의 공동 검출이 가능합니다. HSV 1 게놈과 Centro MERIC 단백질인 CE NPA A와 같은 세포 단백질의 공동 검출이 활용되었으며, 염색질 및 PML 핵체와 HSV 1의 공동 검출이 이루어졌습니다. 관련 단백질인 A TRX는 삼중 염색으로 시각화되었으며, HSV 1D NA는 빨간색으로, 그 RNA 산물인 lat은 파란색으로, A TRX는 초록색으로 나타났습니다.

언마스킹(unmasking) 설정이 완료되면, DNA fish 절차는 매우 견고하게 진행됩니다. 이 과정은 20장 이상의 슬라이드를 한 배치로 하여 24시간 이내에 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발을 통해 헤르페스 바이러스 및 기타 지속성 바이러스를 연구하는 연구자들은 세포 구성 요소와 핵 구조가 이러한 바이러스의 생물학적 특성에 어떻게 영향을 미치는지 단일 세포 수준에서 탐구할 수 있게 될 것입니다.