헤르페스의 연구를위한 예비 신경 세포 문화 시스템은 바이러스 지연 및 재가입을 단순

본 실험의 목적은 일차 신경세포 배양 시스템을 활용하여 단순포진바이러스(herpes simplex virus)의 잠복 및 재활성화를 연구하는 방법을 보여주는 것입니다. 이를 위해 먼저 RA 배아에서 상경절 신경절을 분리하고, 비신경세포를 제거한 후 해리된 신경절에서 분리한 신경세포를 배양합니다. 이후 용해성 복제 억제제가 존재하는 환경에서 EGFP 바이러스를 사용하여 신경세포를 감염시킴으로써 잠복성 HSV 감염을 유도합니다.

다음 단계는 잠복 감염된 배양 세포의 재활성화를 유도하는 것입니다. 마지막으로, 시간에 따른 EGFP 발현을 모니터링하여 재활성화 효율을 평가합니다. 최종적으로 화학적 억제제, RNA 간섭 및 유전자 전달을 통해 다양한 신경 신호 경로가 헤르페스 심플렉스 바이러스의 잠복 및 재활성화를 어떻게 조절하는지 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 숙주 뉴런 내에서 단순포진바이러스 잠복을 조절하는 상호작용을 분자 수준에서 세밀하게 연구할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 잠복 게놈을 억제하도록 작용하는 신호는 무엇인지, 그리고 분자 수준에서 재활성화가 어떻게 유도되는지와 같은 단순포진바이러스 잠복 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 뉴런에서 이 방법은 HSV-1 잠복에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

이 방법은 다른 신경영양성 알파 헤르페스 바이러스에도 적용될 수 있습니다. 시연자는 저희 연구실의 대학원생인 marigo, Kochi 및 Julian Kim입니다. 본 프로토콜을 위한 상경신경절(SCG) 뉴런은 임신한 암컷 쥐의 자궁에서 적출한 E 21 쥐 태아로부터 분리합니다. 해부 후드에서 가위로 어깨 바로 위 목 밑부분을 겨냥해 머리를 몸통에서 절단하여 각 태아를 희생시킵니다. 신경절을 노출시키기 위해 23게이지 바늘을 사용하여 목이 위로 오도록 머리의 세 지점을 고정합니다.

먼저 척수를 핀으로 고정합니다. 둘째로, 코 위쪽의 전면 피부를 당겨 핀으로 고정하고, 셋째로 식도와 기관을 목 뒤쪽에서 분리하여 핀으로 고정합니다. 경동맥 분기점을 찾아 SCG를 탐색하십시오.

경동맥은 쌍으로 이루어진 구조입니다. 목의 양측에 각각 분기점이 존재하므로, 개체당 두 개의 SCG가 있습니다. SCG는 해당 분지 바로 아래에 위치합니다.

양 끝을 잡아 분지점을 벌려 동맥에서 SCG를 분리합니다. SCG는 분지점을 둘러싸고 있는 불투명한 황색 지방 조직과 비교하여 반투명하고 무색입니다. 신경절을 12 milliliters의 L 15에 넣습니다.

얼음 위에 놓인 15 milliliter 원추형 튜브에 포도당이 첨가된 배지를 준비합니다. 배아에서 모든 SCG를 수확하고 조심스럽게 끌어올린 후, 신경절을 600 RPM에서 1분 동안 원심 분리합니다. 과량의 배지를 제거합니다.

트립신과 콜라게나제가 포함된 1 mL의 L 15 배지에 신경절을 현탁합니다. 37 °C에서 24분 동안 배양합니다.

8분마다 교반합니다. 다음으로, trypsin을 비활성화하기 위해 10 milliliters의 sea media를 넣고 1분 동안 원심분리합니다. 600 RPM에서 tryin collagenase media를 가능한 한 많이 제거하고, 10 milliliters의 C media로 신경절을 세척한 후 600 RPM에서 1분 동안 원심분리합니다.

이 세척 과정을 한 번 더 반복합니다. 세척액을 제거하고 신경절을 1 mL의 C media에 재현탁한 후, 5 mL 주사기에 장착된 21 gauge 바늘을 사용하여 최대 15회 왕복시켜 분쇄(triturate)합니다. 대부분의 덩어리가 분해될 때까지 23 gauge 바늘을 사용하여 분쇄 과정을 마무리합니다.

분리된 뉴런을 70 micron 나일론 필터로 걸러 50 milliliter 원심 분리 튜브에 담아 남아 있는 세포 덩어리를 제거합니다. 여과된 세포 현탁액에서 10 microliter 분량을 취해 triam blue와 혼합하여 살아 있는 세포 수를 결정합니다. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 염료를 능동적으로 배제하는 세포의 수를 측정합니다.

다음으로, 콜라겐과 라미닌이 미리 코팅된 96-well 조직 배양 플레이트의 각 웰에 NGF 50 ng/mL이 포함된 C media 100 µL와 함께 총 5,000~6,000개의 살아있는 세포를 분주합니다. 37 °C에서 하룻밤 동안 배양한 후, 다음 날 즉, 체외 배양 1일차(DIV 1)에 뉴런이 제대로 부착되었는지와 일부 축삭 돌기의 성장이 있는지 확인합니다.

웰의 C 배지를 50 µL의 neuro basal medium 또는 NGF, Acho, five fluoro two doxy uridine가 포함된 NBM으로 교체합니다. 세포가 건조해지지 않도록 한 번에 한 행씩 배지를 교체하십시오. 배양물을 37 °C에서 5일 동안 배양합니다.

비신경세포의 사멸과 신경세포의 성장을 확인하기 위해 매일 배양 상태를 모니터링하십시오. 체외 배양 6일 차에 이 절차 단계를 시작하려면, 대부분의 비신경 지지 세포가 제거되었는지 확인하십시오. 모든 과정에서 신경세포에 불필요한 물리적 조작을 최소화하는 것이 매우 중요합니다.

배지를 제거하고 교체할 때는 매우 조심스럽고 천천히 수행해야 하며, 그렇지 않으면 발생하는 기계적 스트레스가 뉴런의 생존력에 영향을 줄 수 있습니다. 각 웰의 기존 배지에 aciclovir 또는 대조군 용매(CV)를 최종 농도 100 micromolar가 되도록 첨가하십시오. 다음 날 기계적 힘이 세포에 부정적인 영향을 미치지 않도록 CV를 천천히 그리고 조심스럽게 첨가하십시오.

DIV 7에, 감염 다중도(MOI) 1~2 사이로 바이러스 용해 단백질 US 11에 EGF 리포터가 융합된 재조합 HSV 1을 SCG 배양물에 감염시킵니다. 희석된 바이러스를 웰 내의 기존 배지에 직접 첨가합니다. 가짜 감염(mock infected) 대조군과 용해 감염군을 포함하십시오.

CV가 없는 배지에서의 양성 대조군. 37°C에서 2~3시간 동안 감염을 진행합니다. 그다음, 감염 배지를 NGF와 CV가 포함된 신선한 NBM으로 교체합니다. 감염 배지를 교체할 때는 매우 조심스럽게 다루는 것이 중요합니다. 플레이트를 몸쪽으로 기울여 웰 바닥에서 배지를 천천히 제거하십시오.

그런 다음 피펫 팁을 웰의 바닥이 아닌 벽면으로 향하게 하여 배지가 세포 위로 부드럽게 흘러내리도록 합니다. 세포가 건조해지는 것을 방지하기 위해 한 번에 한 줄씩 배지를 교체하십시오. 배양물을 인큐베이터로 다시 옮기되, HSV 1 잠복 상태 유지 능력이 저해되지 않도록 최대한 조심스럽게 취급하십시오.

37°C에서 6일 동안 배양하며, 이 기간 동안 바이러스가 잠복기를 형성하게 합니다. 이 기간 동안 형광 현미경을 사용하여 lytic 복제의 지표로서 us 11 EGFP 발현을 모니터링하십시오.

예상대로 모의 감염 대조군에서는 GFP 발현이 나타나지 않아야 합니다. S 11 EGFP는 감염된 샘플에서만 검출되어야 합니다. CV 처리를 하지 않은 양성 대조군 웰은 1차 감염이 성공적으로 이루어졌으며 생산적인 용균성 복제가 일어났음을 나타냅니다.

DIV 14에서 재활성화를 평가하려면, 이전과 마찬가지로 CV가 포함된 배지를 CV가 없는 신선한 배지로 조심스럽게 교체하십시오. 피펫 팁을 웰 바닥이 아닌 웰 벽면을 향하게 하여 배지가 세포 위로 부드럽게 흘러내리도록 하십시오. 20 micromolar 농도의 LY 2 9 0 0 4와 같은 약리학적 또는 생물학적 변수를 포함하십시오.

A CV로 처리된 잠복 감염 배양물에서는 GFP 발현이 검출되지 않아야 합니다. 5~6일에 걸쳐 세포를 37 °C로 되돌립니다. 형광 현미경을 사용하여 살아있는 배양물을 관찰하며 재활성화가 일어나는 뉴런을 검출합니다.

재활성화 빈도는 EGFP 양성 뉴런이 포함된 웰의 수를 세어 이를 전체 샘플 웰 수에 대한 비율로 표시하여 계산합니다. 이 그림은 재활성화 유도제로 알려진 trigger statin을 감염 후기 단계의 SCG 배양물에 처리한 사례를 보여줍니다. 약물 처리 후 5일 동안 매일 형광 현미경을 사용하여 재활성화를 모니터링하고 점수를 매겼습니다.

TSA를 통한 재활성화는 2일 이내에 최대치의 50%에 도달하며, 5일째에는 60%에 도달합니다. DMSO로 나타낸 기저치 또는 자발적 재활성화의 경우, 본 실험에서의 대조군 배양물은 약 10%이며, 이 in vitro 시스템을 사용할 때 일반적으로 5%에서 20% 사이의 범위를 보입니다. 감염된 SCG 배양물 후기 단계에서도 LY 2 9 0 0 4를 처리하였습니다.

LY에 의해 재활성화가 유도된 재활성화 배양액을 바이러스 DNA 합성 억제제인 PAA 처리군, 무처리군, 그리고 두 화합물을 함께 처리한 군과 비교한 결과, 여기에서 보는 바와 같이 LY 2 9 4 0 0 2로 재활성화가 유도된 배양액에서 US 11 EGFP 발현이 PAA에 의해 저해되었으며, 이는 US 11 EGFP 발현이 바이러스 DNA 복제에 의존적임을 나타냅니다. 이 절차를 수행할 때는 멸균 기술에 세심한 주의를 기울여야 하며, 스트레스나 기계적 움직임으로 인해 유도되는 자발적 재활성화 증가를 방지하기 위해 CG 배양액을 가능한 한 부드럽게 다루는 것이 중요합니다. 배양된 뉴런에서 HSV one 잠복 감염을 확립하기 위한 이 절차 이후에, S-H-R-N-A 넉다운 및 야생형과 돌연변이 유전자의 이소성 발현과 같은 다른 방법들을 수행하여 HSV one 잠복 및 재활성화를 조절하는 뉴런 기능을 특성화할 수 있습니다.

HSV 1은 PSL 2 안전 예방 조치가 필요한 인간 병원체임을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하기 전에 PSL 2 조건에서의 작업 방식에 익숙해져야 합니다. 이 영상을 시청한 후에는 잠재적 HSV 1 감염을 설정하기 위해 SCG 배양을 확립하는 방법과 뉴런에서 재활성화를 효과적으로 유도하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.