Calcium Imaging of enteric Neuron and Glia Activities in a Mouse Colonic Myenteric Plexus(마우스 결장 근육총에서 장 뉴런 및 신경교 활동의 칼슘 이미징)

장 뉴런과 신경교세포의 네트워크로 구성된 신경절화된 신경총을 수용하는 고정된 마우스 결장 근장 신경총 조직이 포함된 이미징 챔버를 가져 가십시오.

이 세포는 칼슘 결합 시 형광을 발하는 칼슘 지시약으로 표지되어 있습니다.

다음으로, 챔버를 형광 현미경 스테이지에 놓습니다. 이미징 중 근육 수축을 억제하기 위해 억제제가 포함된 예열된 완충액으로 챔버를 관류합니다.

현미경을 사용하여 균일한 형광을 나타내는 건강한 신경절 영역을 식별합니다.

광 이미지를 획득하여 기본 활성을 측정하고 세포 내 칼슘 수치에 대한 참조를 제공합니다.

수용체 작용제로 조직을 관류하여 신경 수용체를 활성화하여 세포내 칼슘 유입과 형광 강도 증가를 유발합니다.

신경 활성화는 주변 신경교세포를 간접적으로 자극하여 칼슘 유입과 그에 따른 형광 증가로 이어집니다.

타임랩스 형광 이미지를 캡처하여 기준선 수준과 비교하여 뉴런과 신경교세포 모두에서 칼슘 역학 및 신호 전달 활동을 나타내는 형광 강도의 변화를 측정합니다.

배양하는 동안 프로토콜의 서면 부분에 있는 지침에 따라 수정된 Kreb's 완충액을 만들고 3마이크로몰 니카르디핀과 1마이크로몰 스코폴라민을 추가하여 칼슘 2 플러스 이미징 동안 근육 수축을 억제합니다. 기록 챔버를 형광 현미경 아래에 배치하고 여러 개의 가열된 주사기 저장소가 있는 중력 흐름 관류 시스템을 사용하여 섭씨 37도 크렙 완충액의 분당 2-3밀리리터의 연속 관류 속도를 설정합니다. 진공 트랩에 연결된 흡입 라인과 양쪽에 기포가 생기지 않도록 하십시오. 명시야 조명 아래에서 원하는 신경총에 초점을 맞춥니다. 광표백으로 이어질 수 있는 조직을 과도하게 노출시키지 마십시오.

신경절 내의 형광단 부하를 검사하고 이미징을 위해 건강한 신경절을 선택합니다. 건강에 해로운 손상된 신경절은 자가형광 또는 점상 형태를 나타내므로 이미징에 사용해서는 안 됩니다. 신경절이 선택되면 빛 경로를 카메라로 전환하고 이미지 획득 소프트웨어로 라이브 이미지를 얻습니다. 신경절에 초점이 맞춰져 있는지 확인하고 이미지 획득 속도와 노출 시간을 설정합니다.

이미지 획득 속도와 시간은 조사관이 기록하려는 이벤트에 따라 달라집니다. 대부분의 실험에서 신경교 칼슘 과도 현상은 칼슘 과도 뉴런만큼 빠르지 않기 때문에 전통적으로 신경교 세포의 경우 0.5-1 헤르츠, 뉴런의 경우 최대 2 - 10 헤르츠에서 이미지를 획득합니다.

기록을 시작하고 30초 동안 실험 자극이 없는 상태에서 선택한 신경절의 기본 생리적 활동을 설정합니다. 그런 다음 약물에 최적화된 프로토콜에 따라 분당 2-3밀리리터의 속도로 중력 흐름 관류 시스템을 사용하여 수용체 작용제 및 길항제와 같은 미리 예열된 관심 약물을 적용합니다. 녹화를 중지하고 실험의 타임랩스 동영상을 봅니다.

적절한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 관심 영역 또는 ROI를 신중하게 선택하십시오.

마지막으로, 적절한 이미징 소프트웨어를 사용하여 관심 영역의 형광 강도를 초기 기준선 값과 정규화하고 비교합니다. 정규화된 형광의 변화는 칼슘의 변화에 정비례합니다.