Name: 장용 신경계의 제자리 칼슘 이미징에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 학습하세요 장용 신경계의 칼슘 이미징 방법을 통해 장 신경세포와 신경교세포 활성을 실시간 관찰하는 기술입니다. 이 프로토콜은 소화기 생리학 및 장 질환 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 미국 제약 연구 및 제조업체 협회(PhRMA) 재단(B. Gulbransen), 미국 국립보건원(Building Interdisciplinary Research Careers in Women's Health), K12 HD065879(B. Gulbransen) 보조금 및 Michigan State University(B. Gulbransen)의 창업 기금의 지원을 받았습니다.

참고 : 실험 동물에서 조직을 포함하는 다음 절차는 동물 2013 년 안락사에 대한 AVMA 가이드 라인과 일치하고 미시간 주립 대학 IACUC의 사전 승인되었다. 1. 조직 준비 <ol><li> 산소 또는 물리적 배리어는 이소 플루 란과의 직접적인 접촉으로부터 동물을 막을 수 있도록, 상기 챔버의 바닥에 흡수성 재료 상에 액체 이소 플루 3-5 mL로 배치하여 2.5 %의 이소 플루 란을 포함하는 챔버에서 연구 동물을 마취. 발바닥을 곤란하게하여 마취의 깊이를 테스트합니다. 주 : 뒷다리의 움츠림 반사가 없을 때 마취 깊이가 적절하다고 인정된다. 적절하게 마취되면, 자궁 경부 전위로 마우스를 안락사 </li><li> 앙와위에서 동물을 배치하고 70 % 에탄올로 복부 피부를 청소합니다. 중간 선에서 복부 피부를 꼬집어 집게를 사용하여 6cm 미디어를 만들기 위해 수술 가위를 사용원격 교육 알바를 따라 L 절개 내부의 소화 기관을 노출. </li><li> 찾아 복막 내부의 회장을 노출 무딘 집게를 사용합니다. 가위로 회장 / 결장 장간막을 잘라 소장을 무너 시작합니다. </li><li> 소장의 길이를 충분히 풀어지면, 회장 제제에서 맹장 위장 근위 및 원위 부위를 잘라. 대장 준비 기간, 직장에 맹장과 근위 대장 원위부를 잘라. </li><li> 신속 장내 세그먼트를 제거하고 3 μM의 카르 디핀 염산염 1 μM 스코 폴 아민 하이드로 클로라이드로 보충 DMEM / F12 미디어를 비커에 배치 얼음 (이하 &quot;용지&quot;라한다). 이러한 억제제의 첨가는 소화관 평활근 마비하여 미세 절제 및 후속 영상화를 용이하게한다. </li><li> 설립 해부학 적 마커를 기반으로 관심의 컷 세그먼트 (예를 들면, 공장, 회장 원위부 또는 근위부 대장). 일반적으로 utiliz말단 회장 원위부 대장의 전자 조직. 그러나 모든 장 지역에서, 부하 및 이미지 myenteric 신경 세포와 아교 세포를 분리하기 위해 동일한 기본 절차를 사용합니다. </li><li> 냉장 미디어 가득 실 가드 코팅 된 배양 접시에 원하는 장 세그먼트과 장소의 작은 부분 (4-6cm)를 제거합니다. </li><li> 근위 및 곤충 핀 장 세그먼트의 말단부를 안전하고 직선을 만들어 장 관을 열고, 길이 장간막 국경을 따라 잘라. </li><li> 미세 집게 (# 5, # 최고의 45분의 5 일)과 아주 좋은 봄 가위를 사용하여 점막 층을 멀리 해부까지 조심스럽게 점막면이 빛 장력 평면 핀 조직. 주 : 제대로 수행하지 않을 경우 점막의 제거는 ENS에 대해 매우 충격적인 일 수있다. 품질 준비를 들어, 박 리나 긁어 점막의 갑작스러운 제거를 제한하기 위해주의를 기울입니다. 가장 좋은 방법은 점막을 들어 올려 미세 가위로 아래 절단하는 것입니다. </li><li> 작은 준비로 조직을 잘라의 영상 요리로 (약 0.5 cm 2) 핀 신선한 미디어와 얼음에 배치 (원형 근육 층이 위를 향 4 코너). </li><li> 조심스럽게 myenteric 신경 얼기를 노출 미세 핀셋으로 떨어져 괴롭 히고 의해 원형 근육을 멀리 해부하다. 과도한 스트레칭을 피하십시오. </li><li> 신선한 미디어와 얼음과 변화 솔루션을 다시 이미징 요리를 놓습니다. </li><li> 접시 당 효소 믹스 2 ㎖를 준비 [스파 아제 (Dispase) 1 U / ㎖ (4.48 ㎎ / 8 ㎖), 콜라게나 제 유형 II 150 U / ㎖ (5.45 ㎎ / 8 ml)에 미디어]. </li><li> 얼음에서 요리를 제거하고 단계 1.13에서 효소 믹스를 추가합니다. </li><li> 5 % CO 95분의 2 % 공기와 함께 실온에서 15 분 동안 인큐베이션을 요리. </li><li> 미디어 3 회 다시 핀 모서리 씻을 조직 준비. </li></ol> 2.로드 FLUO-4 염료 참고 : 표시 염료로드 형광 염료 및 조직을 처리하는 동안 제한된 빛과 협력하여 photobleaching에 피하십시오. <ol><li> 4 μM FLUO-4 로딩 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 4 mM의 FLUO-4 주식의 1.5 μL 나누어지는 1.5 ml의 미디어 및 250 mM의 프로 베네 시드 주식의 1.2 μl를 추가합니다. FLUO-4 AM로 50 μg의 (0.25 % cremaphor-EL 보충 된 DMSO 중 20 %) 4- FLUO-4 mM의 스톡 플루로 닉 F-127 11.4 μl를 첨가하여 제조된다. </li></ol></li><li> 37 ° C에서 어두운 배양기에서 45 분 동안 로딩 FLUO-4 용액 상태로 준비 부화. </li><li> 인큐베이터에서 제거 및 미디어 3 회와 준비를 씻는다. </li><li> 미디어가 200 μM의 프로 베네 시드를 포함 및 이미징 전에 37 ° C에서 15 분을 품어의 환율 미디어. 참고 : 프로 베네 시드가 신경 세포에 약제 내성 수송을 억제하는 약물이다. 이 약물의 첨가는 염색을 돌출 뉴런의 기능을 억제하고 신경 라벨링을 향상시킨다. 프로 베네 시드가없는 상태에서 칼슘 2 + 지표 염료의 대량로드는 주로 아교 세포로드를 생성합니다. 프로 베네 시드의 추가는 신​​경 세포와 신경 교세포의 답변 시각화 할 수 있습니다. </li><li> 준비 KRE 수정학사 버퍼입니다. <ol><li> 확인 구성 요소 (MM)에 최종 농도는 다음과 같습니다 것을 수정 크렙스 버퍼와 같은 : (121)의 NaCl, 5.9의 KCl, 2.5 CaCl2를, 1.2의 MgCl 2, 1.2의 NaH 2 PO 4, 10 HEPES, 21.2의 NaHCO3, 1 피루브산을 산 (NaOH로 7.4로 조정 산도) 8 포도당. 칼슘 동안 2 + 이미징 근육의 수축을 억제하는 3 μM의 니 카르 디핀 (nicardipine) 및 1 μM 스코 폴라 민을 추가하고 해부를 전체 마운트합니다. </li></ol></li></ol> 3. 이미징 및 분석 참고 : 형광 광원, 현미경, 품질 CCD 카메라와 적절한 수집 소프트웨어와 함께 적어도 기본 이미징 장비를 사용합니다. 광원과 특정 응용에 따라 다른 구성 요소의 추가를 변화한다. 필터 휠과 셔터가 전통적인 크세논 아크 광원과 함께 사용되어야한다. 그러나, LED 광원 및 조명 시스템은 이러한 구성 요소가 필요하지 않습니다. <ol><li> 녹화를 배치현미경 챔버를 가열 ORDING 복수 주사기 저수지 중력 유동 관류 시스템을 사용하여 37 ° C, 크렙스 완충액 2-3 ml / 분의 속도로 연속 관류를 확립한다. 진공 트랩에 연결된 모두 입력 및 흡입 라인에 공기 방울 형성​​을 방지해야합니다. </li><li> 밝은 필드 조명 아래에서 초점이 원하는 총을 가져와. 사진 표백 될 수 있습니다 조직, 과도한 노출을 피하십시오. </li><li> 신경절 내에서 FLUO-4로드 검사 및 이미징 건강한 신경을 선택합니다. 건강에 해로운 / 손상된 신경은 자기 형광 또는 반점 형태를 전시하고 영상에 사용되어서는 안된다. </li><li> 신경절가 선택되면, 카메라에 빛의 경로를 전환하고 화상 취득 소프트웨어 라이브 화상을 획득. 그 신경절가 포커스와 설정 이미지 수집 속도와 노출 시간에 있는지 확인하십시오. 참고 : 이미지 수집 속도와 시간이 수사 기록 할 이벤트에 따라 달라질 수 있습니다. 대부분의 실험, 이미지아교 칼슘 응답이 칼슘 뉴런에서 2 + 과도만큼 빠른하지 않기 때문에 전통적으로 뉴런 2-10 Hz로 신경 교세포에 대한 0.5 Hz에서까지 취득. </li><li> 실험을 시작하고 30 초 동안 기본 활동을 설정합니다. </li><li> 예컨대 2-3 ml / 분의 속도로 중력 유동 관류 시스템을 이용하여 수용체 작용제 및 길항제로서 관심 예열 약물을 적용한다. 정상 버퍼의 관류에 반환하여 작용제 / 길항제의 응용 프로그램에 따라 적어도 10 분 세척 / 회복 기간을 수 있습니다. 참고 : 약물 응용 프로그램 시간은 개별 화합물 및 실험 설계에 따라 달라질 수 있습니다. 일반적으로, 효능 제의 20 ~ 30 초 애플리케이션은 뉴런 및 아교 세포에서 G 단백질 결합 수용체를 활성화하기에 충분하다. 하지만, (예 : 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체와 같은) 리간드 관문 이온 채널은 더 이상 적용 5-10 초의 시간을 필요로한다. 또한 기간 노출 리간드 게이트 이온 채널이 빠르게 발생할 것이다 DESEnsitize. 길항제는 수용체 경로의 완전한 차단을 보장하기 위해 약 3-15 분 동안 적용되어야한다. 그러나,이 총 일반화와 연구자들은 항상 특정 패러다임에 어떤 실험 약물을 최적화해야한다. </li><li> 실험의 기록 및보기 시간 경과 영화를 중지합니다. 적절한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 관심 엄선 영역 (ROI &#39;S). </li><li> 정상화의 초기 기준 형광 값과 ROI 형광 강도를 비교하는 소프트웨어를 사용합니다. 정규화 된 형광의 변화는 [칼슘]의 변화에 직접적으로 비례한다. <ol><li> ROI - ΔF / F = (F 0) / F 0 (F 1) - 사용하여 이전에 (26)를 설명하는 방법의 변경 사용 ((F 1 - F 0) / F 0) F1은 형광 주어진에있는 배경, 포인트 및 F0는 평가의 정확도를 향상시키기 위해,베이스 라인 형광이다. 이 수정 보조myenteric 신경총 기초가 근육층의 이동을 나타내는 조직의 준비 형광 변화로부터 노이즈를 감소한다. </li></ol></li></ol>

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이 원고에 설명된 방법론은 ENS에서 뉴런과 장 아교세포를 효과적으로 연구하기 위한 일관된 접근 방식을 제공합니다. 배양 중인 뉴런과 장 아교세포를 이미징하여 개별 세포의 기능에 대한 풍부한 통찰력을 얻었지만, 이러한 세포를 고유의 다세포 환경에서 연구하는 것은 생리학과 병태생리학을 이해하는 데 중요합니다. 형광 현미경은 ENS에서 세포의 다방향 상호 작용을 평가하는 데 중요한 기술입니다. 선택적 형광 마커로 ENS의 셀을 로딩하고 고해상도 현미경을 사용한 이미지 획득을 통해 ENS의 세포 활동을 정량적으로 관찰할 수 있습니다. ENS의 살아있는 조직 샘플을 이미징하는 것은 비교적 빠르게 수행되며 대량의 심층적인 기능 및 공간 데이터를 생성합니다. 이러한 실험에 사용된 마우스 근장 및 점막하 신경총 제제는 분자 및 유전적 조작 접근법을 허용합니다. 전체 마운트 준비의 Ca2+ 이미징은 뉴런-아교세포 상호 작용 평가에 유용한 도구를 제공합니다.
고급 실험 패러다임에서는 여러 프로브를 결합하여 세포 내의 다양한 사건에 대한 정보를 얻을 수 있습니다. 형광 현미경은 적절한 형광 표지를 사용하는 경우 특정 분자의 대비가 향상된 이미지를 기록할 수 있습니다. Fluo-4는 다이내믹 레인지가 넓기 때문에 선택되었습니다. ENS에서 AM 염료를 사용할 때는 충분한 배양 시간이 중요합니다. 최상의 결과를 얻으려면 염료 농도 및 로딩 방법을 조정해야 할 수 있습니다. 이상적인 제제에는 형광의 변화를 시각화할 수 있을 만큼 충분한 염료가 함유되어야 하지만 염료가 표적 이온을 킬레이트화하고 세포 내 신호 전달을 방해할 정도로 많지는 않아야 합니다. 세포의 광독성과 염료의 광표백을 방지하기 위해 형광등에 대한 노출을 제한해야 합니다. 
조사관은 이 실험의 여러 단계, 특히 용액 및 조직 준비에 주의해야 합니다. 세포 기능을 유지하기 위해 ENS 조직을 처리하고 해부하는 동안 특별한 주의를 기울여야 합니다. 위장관에는 여러 층과 조직 종류가 포함되어 있으며, 이는 이러한 전체 마운트 준비에서 해부 및 이미징 품질에 문제를 제기합니다 27. 또한 MP의 상호 연결 섬유관은 SMP 2보다 넓고 신경절이 큽니다. 근장 신경총의 신경 밀도는 점막하 신경총의 밀도에 비해 높습니다 28. 느리고 부정확한 해부는 신경총 준비의 품질과 그에 따른 실험의 전반적인 성공에 해로운 영향을 미칩니다. 따라서 깨끗한/손상되지 않은 도구, 연습 및 손재주가 이 절차에 매우 중요합니다. 
전체 마운트 조직 준비에서는 원하는 세포 유형의 형광 강도에서 관찰된 동역학 및 변화 정도를 정확하게 평가하기 위해 관심 영역(ROI)을 그릴 때 신중하게 고려해야 합니다. 신경절은 수축성 근육층에 위치하기 때문에 장 운동성으로 인한 모션 아티팩트는 현장 이미징 중 주요 관심사입니다. 따라서 효소와 함께 배양한 후 조직 제제를 다시 고정하고 완충액에 약리학적 억제제(니카르디핀/스코폴라민)를 추가하여 이러한 동작 장애를 억제하면 명확하고 신뢰할 수 있는 이미지 획득이 가능합니다. 조직 이동을 방지하기 위한 약리학 및 기계적 접근 외에도 최근 연구는 기록에서 잔류 조직 이동을 수정하고 분석의 정확도를 향상시키기 위해 고급 소프트웨어 방법론 및 세포 유형 반응 특성을 적용하는 것을 보여줍니다 29. 이러한 기술적 장애물을 제외하고, 이 방법은 ENS에서 뉴런과 장 아교세포의 형태학적 및 정량적 특성을 평가하기 위한 생리학적으로 관련된 조건을 제공합니다.

장 신경계 (ENS)는 소화 기관 (1)의 벽에 내장 된 두 개의 ganglionated 얼기으로 구성되어 있습니다. 이 근육 내 신경 회로는, myenteric 신경 얼기 (MP) 및 점막하 신경총 (SMP)은 신경 세포와 장 아교 세포 (그림 1)이 구성된다. MP와 SMP는 장 운동 및 상피 흡수와 분비, 각각 3과 위장관 (GI)의 기능을 조절한다. 장내 아교 세포가 신경 내의 신경 세포 만 장 아교 세포의 인구 가까이에 위치하고 있습니다 또한 섬유 책자 및 창자 벽 3,4의 추가-신경절 부분을 상호 연결 내에 존재한다. 장내 아교 세포는 원래 신경 세포 만 영양 지원을 제공하기 위해 믿었다. 그러나 최근의 연구는 강하게 ENS는 5,6 기능에 대한 신경 세포 - glia 상호 작용이 필수적하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 데이터는 장 아교 세포가 신경 세포의 활동 7 &quot;수신&quot;보여그리고, 신경 회로 6,8- 변조 산화 스트레스 (9)로부터 장용성 뉴런을 보호하고 10,11 부상에 응답하여 새로운 장용성 뉴런을 생성 할 수있다. 이 기술 검토에 제시된 프로토콜은 현장 세포 내 칼슘 이미징 사용 신경과 장 아교 세포 사이의 복잡한 상호 작용을 조사하는 간단하고 강력한 방법을 제공한다. 칼슘은 흥분성 세포에서 유비쿼터스 신호 분자와 신경 시스템 (12)에서 시냅스 신호 이벤트에 필수적인 역할을한다. 신경 세포 또는 장내 아교 세포의 여기 어느 유입에 의해 칼슘 -permeable 채널 또는 CA를 통해 세포 내 칼슘 상점에서 2 + 릴리스 세포 내 칼슘 농도의 상승을 이끌어 낸다. 이미징 CA의 형광 염료와 뉴런과 교세포에서 2 + 과도은 설립과 기능 조직과의 역학을 연구하는 널리 사용되는 기술이다ENS 13-17. 칼슘 이미징은 ICC의 심장 박동 네트워크 18 장 평활근 (19, 20)을 통해 흥분의 확산을 명료하게 그대로 GI 조직 세그먼트를 공부하는 중요한 도구가 될 것으로 나타났다. 그것은 생리 학적 매개 변수의 넓은 스펙트럼을 조사하는 연구를 가능하게하고 자신의 공간 분포와 시간적 동력학에 대한 정보를 제공합니다. 세포를 효율적으로 막 투과성 형광 염색 지표와 최적화 프로토콜 (21)을 이용하여 최소 침습 방식으로 염색 할 수있다. 이는 생체 내 23뿐만 아니라 기능적으로 보존 제제 14-16,22에 다수의 뉴런 및 신경교 장용성를 모니터링 할 수있는 기회를 제공한다. 전체 - 마운트 조직 제제는 칼슘 결합하면 그 형광을 증가 FLUO-4로 고친 화성 칼슘 지시 염료 로케이션 벌크있다. 형광의 변화는 CCD 카메라와 아나 기록디지털 6 분석하였으며. 칼슘의 출현은 다양한 자극에 대한 신경 세포 및 글 리아 세포의 상호 작용, 응답을 모니터링 할 수있는 기회 및 실시간 프로세스 위장관에서 이러한 세포 유형의 개입을 제공 하였다. 현장에서 칼슘 이미징은 장 신경 세포와 아교 세포의 신호 전달 메커니즘에 큰 통찰력을 산출하고 세포 배양 모델 6,24에 비해 몇 가지 뚜렷한 장점을 가지고있다. 먼저, 반응계에서 제제는 뉴런 및 신경교의 기본 매트릭스 환경을 그대로 유지하고 조직을 대상으로 그 커넥터의 대부분을 떠난다. 둘째, 유전학 및 배양 장 아교 세포의 형태는 크게 생체 6,24에 비해 변경된다. 셋째, 많은 이형 상호 작용 1 차 세포​​ 배양 손실과 세포 - 세포 상호 작용을 평가하는이 제한됩니다. 배양 된 세포는 잘 기본적인 특성 조사, 그들의 usefulne에 적합하지만장 아교 ​​세포와 신경 세포 사이의 복잡한 상호 작용을 연구 SS 제한됩니다. 시냅스 경로 (25) 그대로 남아있는 현장에 접근 방법을 사용하여 조사하는 신경 세포 - glia의 상호 작용은 더 생리 학적으로 관련이있다. 세포 배양 방법에 비하여 시츄 접근 체계적 신경원과 신경교 장용성 간의 복잡한 상호 작용을 이해하기위한 개선 된 조건을 제공한다. 또한, 전체 마운트 준비에 ganglionated 신경총의 평면 조직은 세포 내 칼슘 과도의 형광 이미징에 이상적이며,이 기술은 ENS에서 신경 세포 아교 세포의 활동을 평가하기위한 간단한 방법을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>버블스톱 시린지 히터&nbsp;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>10-4-35-G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소, II형, 분말</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42613-33-2</td><td></td></tr><tr><td>해부 도구</td><td>Roboz&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>고정 스테이지 현미경</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM 염료</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>곤충 핀</td><td>미세 과학 도구</td><td>Minutien 핀</td><td></td></tr><tr><td>iQ 라이브 셀 이미징 소프트웨어</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Neo sCMOS 카메라</td><td>Andor</td><td>Neo 5.5 sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipine</td><td>Sigma</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>관류 챔버</td><td>맞춤형</td><td></td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>하버드 장치</td><td>모델 720</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>분자 프로브</td><td>P36400</td><td></td></tr><tr><td>스코폴라민</td><td>시그마</td><td>S1013&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Lambda DG-4</td><td>Sutter</td><td>DG-4</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>온도 컨트롤러</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344C</td><td></td></tr></tbody></table>

장용 신경계의 제자리 칼슘 이미징에서

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

장의 반사 행동은 장 신경계(ENS)에 의해 제어됩니다. ENS는 장 벽에 있는 두 개의 신경절 신경총에 있는 뉴런과 신경교세포의 통합 네트워크입니다. 장 뉴런(enteric neuron)과 장 신경교세포(enteric glia)는 장 신경절 내의 유일한 세포 유형입니다. 장 뉴런과 신경교세포의 활동은 장 기능을 조정하는 역할을 합니다. 이 프로토콜은 형광 지표 염료로 세포 내 칼슘(Ca2+) 과도 현상을 이미징하여 온전한 ENS 내에서 뉴런과 신경교세포의 활동을 관찰하는 방법을 설명합니다. 우리의 기술적 논의는 설치류 장에서 myenteric plexus의 전체 마운트 준비에서 Ca2+ 이미징 방법에 중점을 둡니다. Fluo-4와 같은 친화성이 높은 Ca2+ 지시자가 있는 ENS 전체 마운트의 대량 로딩을 통해 개별 뉴런 또는 신경교세포에서 Ca2+ 반응을 측정할 수 있습니다. 이러한 반응은 반복적이고 신뢰할 수 있게 유발될 수 있으며, 이를 통해 약리학적 도구를 사용한 정량적 연구가 가능합니다. ENS 세포의 Ca2+ 반응은 냉각식 전하 결합 소자(CCD) 카메라가 장착된 형광 현미경을 사용하여 기록됩니다. 전체 마운트 제제에서 Ca2+ 이미징을 사용하여 얻은 형광 측정은 장 뉴런 및 신경교세포에서 Ca2+ 반응의 메커니즘과 잠재적인 기능적 결과를 특성화하는 간단한 방법을 제공합니다.

이 기술의 올바른 사용을 위해 조직 준비를 마운트 전체 조사자가 정확하게 세포 내 칼슘 2 + [칼슘 2 +] 나는 장 신경 세포의 과도와의 아교 세포를 측정 할 수 있습니다. 마우스 콜론에서 myenteric 신경절 내에서 아교 세포의 효능-유발 칼슘 반응의 대표적인 예는 비디오 1에 표시됩니다. 다음과 같은 결과가 우리가이 방법을 사용하여 얻은 몇 가지 대표적인 결과를 설명하기위한 것입니다. 첫째, 그림 2 장 폐해를 측정하는 실험의 결과를 보여줍니다 [칼슘] 내가 기니피그 결장 종 myenteric 근육 신경총 (LMMP) 준비 내 ATP에 의한 자극에 대한 반응의 변화. 구체적으로는,이 도면은 분석 myenteric 신경절 뉴런 및 장용성의 위치를​​ 나타내는 별표의 윤곽을 포함하여 상기 열거 실험 프로토콜의 적절한 분석을위한 방법을 도시한다. 또한 이러한 결과 전[칼슘 2 +] 난 기니 돼지 myenteric 아교 세포의 동원에 100 마이크로 몰 ATP의 최적 복용량을 llustrate. 이 응답은 장용성 신경교 자극을 교정 및 테스트 자극에 대한 반응을 정규화하기 위해 사용될 수있다. 다음으로,도 3이 제대로이자 (로아) 신경 교세포 주변 지역을 선택하는 방법 해명, 노란색 동그라미 주변으로 표시. 이러한 결과는 또한 기저 조건 및 약리학 적 자극에 대한 응답에서 원하는 형광 변화를 보여줍니다. 마지막으로, 그림 4는 전체 마운트 준비에 [칼슘] 내가 응답을 장내 아교 세포와 신경 세포를 선택하기위한 공간 고려 사항을 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig1highres.jpg" /> ENS 그림 1. 조직. ENS는 두 가지 주요 ganglionated 얼기가 포함되어 있습니다. myenteric 신경 얼기는 L 사이에 위치ongitudinal 원형 근육 층. 점막하 신경총은 점막과 원형 근육 층 사이에 위치하고 있습니다. ENS는 유일하게 신경과 장 아교 ​​세포로 구성되어 있습니다. 신경 섬유 책자가 신경을 연결합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig2highres.jpg" /> 기니피그 결장 myenteric 신경 얼기 응답 그림 2. 장내 글리는 현장에서 ATP합니다. (A) myenteric 신경절 FLUO-4 형광 기저 조건 하에서 (점선으로 윤곽). 화살표는 100 μmol / L의 ATP, 신경 교세포로 자극시 (B). 두꺼운 절간 섬유 책자를 가리 아니라 신경, 빠르게 증가 FLUO-4 [칼슘]의 증가를 나타내는 형광 <sUB&gt; 전. 응답 세포가 작은 것을 참고 (별표로 표시 어두운 공간을) 훨씬 더 큰 신경을 둘러싸고 있습니다. (C) 장내 아교 세포는 1 밀리몰 / L은 최대 응답 (24)를 도출과 용량 의존적으로 ATP에 응답합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig2large.jpg" target="_blank">를 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig3highres.jpg" /> 현장에서 ATP 할 수있는 대장 myenteric 신경 얼기 응답 그림 3. 설치류 S-100-GFP는 + 세포. (A) S-100-GFP + 마우스 대장 myenteric 신경절의 신경 교세포 (녹색) (점선으로 설명). 이자 (로아) 신경 내의 신경 교세포 주변의 6 개 지역은 노란색 동그라미로 표시됩니다. 화살표는 신경절으로 이어지는 두꺼운 섬유 책자를 나타냅니다. 별표 D2 장 신경 세포의 enote 위치. (B) 기저 상태에서로드와-2 형광을 나타내는 같은 신경절. (C) 100 μmol / L의 ATP 자극에 따라, 신경 교세포는 [칼슘 2 +] 나는이 같은 증가 Rhod-으로 표시 증가로 응답 이 형광. (D)는 A-C에 표시된 각각의 투자 수익 (ROI)에 해당하는 추적합니다. (E) D (24)에 표시된 6 개의 ROI의 응답을 (SEM 평균 ±) &#39;평균. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig4highres.jpg" /> 장 신경 세포 간 아교 세포 통신의 현장 영상에서 그림 4. 칼슘 이미징 실험에서 (A) 대표 이미지 (모조) 여기서 전체 마운트myenteric 신경총의 제조 신경 P2X7 수용체 효능 BzATP (100 μM, 30 초)에 도전했다. 신경 작용제 주변 장용성 교세포 (A &quot;) 이전 뉴런 (A &#39;)에서 Fluo4 형광의 증가를 초래 있습니다. (B)을 신경교 (블루)과 뉴런의 경시 형광의 변화를 분석 (적색 ) 정상 버퍼 (실선에 BzATP에 신경 작용제, BzATP. (C) 신경 세포와 신경 교세포의 답변 응용 프로그램 다음) 및 버퍼에 신경 P2X7 수용체 (13)을 강화시키는 낮은 칼슘과 마그네슘 2+ (점선)를 포함. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig4large.jpg" target="_blank">하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 장내 아교 세포에서 비디오 1 작용제-유발 칼슘 응답현장.이 비디오는 칼슘 지시 염료, FLUO-4로드 마우스 원위부에서 myenteric 신경절을 보여줍니다. 표시된 경우 신경교 세​​포 작용제, ADP는 욕에 첨가된다. ADP가 FLUO-4 형광의 과도 상승에 의해 관찰 장 아교 세포의 세포 내 칼슘의 증가를 2+ 이끌어 낸다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/JOVE.mp4" target="_blank">이 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

장 신경계(ENS)는 장 반사를 제어하는 장 벽에 위치한 뉴런과 신경교세포의 네트워크입니다. 이 프로토콜은 Ca2+ 이미징을 사용하여 ENS의 실시간 제제에서 장 뉴런 및 신경교세포의 활동을 기록하는 방법을 설명합니다.

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 형광 칼슘 지시약 염료를 사용하여 장의 전체 마운트 생체 표본 내 장 신경세포와 글리아 세포의 활성을 이미징하는 것입니다. 이를 위해 먼저 동물로부터 장의 일부를 절제하여 미리 데워둔 배지에 넣습니다. 두 번째 단계는 장의 장간막 경계를 따라 절개한 후, 점막 표면이 위를 향하도록 가벼운 장력을 주어 평평하게 고정하는 것입니다.근층간 신경총(myenteric plexus)의 whole mount 표본을 미세절제술로 제작하여 이미징 디시에 넣습니다. 다음으로, 인큐베이터 내에서 whole mount 표본에 형광 지시 염료인 flu oh four를 로딩합니다. 마지막 단계로, 로딩된 표본을 이미지 획득 및 분석 소프트웨어로 제어되는 고해상도 카메라가 장착된 형광 이미징 현미경을 사용하여 촬영함으로써 기저 활성도를 기록합니다.그런 다음 연구 대상 약물을 첨가하고 뉴런과 글리아의 칼슘 과도 현상을 기록합니다. 궁극적으로, 장신경계의 in situ 칼슘 이미징을 통해 뉴런과 글리아의 세포 활동이 생리적 장 기능 조절 및 장 병태생리학에서의 장신경계 기능 장애에 어떻게 기여하는지 연구합니다.이 기술의 시사점은 NC 두 칼슘 이미징을 사용하여 신경세포와 장 신경교세포 사이의 복잡한 상호작용을 조사하는 간단하고 견고한 방법을 통해, 기능성 장 질환 및 염증성 장 질환의 생리학 및 병태생리학에 대한 이해를 확립하는 방향으로 확장됩니다. 이 절차를 시연할 사람은 본 연구실의 과학자 두 명인 David입니다. 실험 동물의 조직을 사용하는 다음 절차는 2013년 AVMA 안락사 가이드라인을 준수하며, 미시간 주립대학교 IACUC의 사전 승인을 받았습니다. 승인된 절차에 따라 동물을 안락사시킨 후, 동물을 앙와위로 놓고 복부 피부를 70% ethanol로 닦아냅니다. 핀셋을 사용하여 복부 정중선의 피부를 집어 올린 다음, 외과용 가위로 정중선을 따라 6 cm 길이의 내측 절개를 가하여 내부 소화 기관을 노출시킵니다.다음으로, 둔단 가위를 사용하여 복막 내의 결장을 찾아 노출시킵니다. 가위로 회결장 간막을 절개하고 장을 풀기 시작합니다. 장의 길이가 충분히 풀리면, 이 비디오에서 보여줄 대장 표본 제작을 위해 맹장 원위부와 직장 근위부 사이의 결장을 절단합니다.그런 다음 장 분절을 빠르게 제거하여 3 µM nicardipine hydrochloride와 1 µM S scopolamine hydrochloride가 첨가된 DM EMF 12 Media가 담긴 비커에 넣고 얼음에 보관하십시오. 이러한 억제제를 첨가하면 장 평활근이 마비되어 미세 절제 및 후속 이미징이 용이해집니다. 원하는 장 분절에서 4~6 cm의 작은 분절을 절단하여 냉각된 첨가 배지가 채워진 syl guard 코팅 페트리 접시에 넣으십시오.그런 다음 곤충 핀으로 장 분절의 근위단과 원위단을 고정하고, 장간막 경계를 따라 길이 방향으로 직선으로 절개하여 장관을 엽니다. 이제 조직을 가벼운 장력이 가해진 상태로 점막면이 위로 오게 하여 평평하게 핀으로 고정하고, 5번 미세 핀셋으로 점막을 들어 올린 후 매우 미세한 스프링 가위로 그 아래를 절개하여 점막층을 조심스럽게 분리합니다. 조직을 약 0.5 cm 제곱의 작은 조각으로 자른 뒤, 각 조각을 보충 배지가 채워진 이미징 디쉬에 넣고 얼음 위에 둡니다.원형근 층이 위를 향하도록 하여 각 준비물을 네 모서리에 핀으로 고정합니다. 미세 핀셋으로 원형근을 조심스럽게 떼어내어 분리합니다. 마이엔테릭 신경절(myenteric plexus)을 노출시키기 위해 과도한 신장을 피하고, 이미징 디쉬를 다시 얼음 위에 놓은 후 각 디쉬의 용액을 신선한 보충 배지로 교체합니다.다음으로, 디쉬를 얼음에서 꺼내고 각 디쉬에 2 mL의 효소 혼합물을 첨가한 후, 5% carbon dioxide와 95% air 조건의 상온에서 15분 동안 배양합니다. 마지막으로, 조직 표본을 배지로 3회 세척하고, 광퇴색을 방지하기 위해 제한된 조명 조건 하에서 1.5 mL의 보충 배지와 1.2 µL의 250 mM probit 스탁, 1.5 µL의 4 mM Fluro four 스탁이 포함된 1.5 mL의 flu oh four 로딩 용액을 이미징 디쉬에 넣고 37 °C의 암실 인큐베이터에서 45분 동안 배양합니다. 인큐베이터에서 디쉬를 꺼낸 후, 표본을 배지로 3회 세척합니다.그 다음, 신경세포 라벨링을 강화하기 위해 200 micromolar prop acid가 포함된 신선한 배지를 추가하고 이전과 동일하게 15분 동안 배양합니다. 배양하는 동안 프로토콜의 서술 부분에 기재된 지침에 따라 수정된 Krebs 완충액을 제조하고, 근육 수축을 억제하기 위해 3 micromolar nicardipine과 1 micromolar scopolamine을 첨가합니다. calcium two plus 이미징 및 전체 마운트 해부 시에는 기록 챔버를 형광 현미경 아래에 배치하고, 여러 개의 가열된 시린지 저장조가 연결된 중력 흐름 관류 시스템을 사용합니다.37 °C의 Krebs 완충액을 분당 2~3 mL의 속도로 지속적으로 관류하십시오. 유입 라인과 진공 트랩에 연결된 흡입 라인 모두에서 기포가 형성되지 않도록 주의하십시오. 명시야 조명 하에서 관찰하고자 하는 신경총의 초점을 맞추십시오.광퇴색을 유발할 수 있으므로 조직의 과도한 노출을 피하십시오. 신경절 내의 flu oh four 로딩 상태를 검사하고, 이미징을 위해 건강한 신경절을 선택하십시오. 건강하지 않고 손상된 신경절은 자가형광을 띠거나 점상 형태를 보이므로 이미징에 사용해서는 안 됩니다.신경절을 선택한 후, 광경로를 카메라로 전환하여 실시간 이미지를 얻습니다. 이미지 획득 소프트웨어를 사용하여 신경절의 초점을 맞추고, 이미지 획득 속도와 노출 시간을 설정합니다. 이미지 획득 속도와 시간은 연구자가 기록하고자 하는 이벤트에 따라 달라집니다. 대부분의 실험에서 이미지는 전통적으로 글리아 세포의 경우 0.5 ~ 1 Hz, 최대 2 ~ 10 Hz의 속도로 획득합니다.뉴런의 경우, 글리아 세포의 칼슘 일시적 변화(calcium transient)는 뉴런만큼 빠르지 않으므로, 기록을 시작하고 실험적 자극이 없는 상태에서 선택한 신경절의 기저 생리적 활성을 30초 동안 설정합니다. 그런 다음, 사용자의 약물에 최적화된 프로토콜에 따라 중력 흐름 관류 시스템을 사용하여 수용체 작용제 및 길항제와 같은 관심 약물을 분당 2~3 mL의 속도로 미리 가온하여 투여합니다. 기록을 중단하고 실험의 타임랩스 영상을 확인합니다.적절한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 관심 영역(ROI)을 신중하게 선택합니다. 마지막으로, 적절한 이미징 소프트웨어를 사용하여 관심 영역의 형광 강도를 초기 기저값에 대해 정규화하고 비교합니다. 정규화된 형광의 변화는 칼슘의 변화에 직접적으로 비례합니다. 다음 세 이미지는 기니피그의 장 신경교세포가 in situ 상태에서 TP에 반응함을 보여줍니다.기저 상태에서는 점선으로 표시된 낮은 수준의 fluoro four 형광이 관찰됩니다. 화살표는 100 µM ATP 자극 시 두꺼워진 신경절 간 섬유 다발을 가리킵니다. 뉴런이 아닌 글리아 세포에서 fluoro four 형광이 빠르게 증가하며, 이는 칼슘 농도의 증가를 나타냅니다. 반응하는 세포들은 크기가 작으며, 별표로 표시된 어두운 공간인 훨씬 더 큰 뉴런들을 둘러싸고 있음에 유의하십시오.이 히스토그램은 장 신경교 세포가 TP에 대해 농도 의존적으로 반응하며, 1 mmol/L에서 최대 반응을 유도함을 보여줍니다. 이 영상은 calcium two plus 지시약 염료인 flu oh four가 로딩된 마우스 원위 결장의 근층 신경절을 보여줍니다. 표시된 시점에 신경교 세포 작용제인 a DP를 배양액에 첨가합니다.DP는 Fluo-4 형광의 일시적인 증가로 관찰되는 바와 같이, 장 신경교세포 내의 calcium 이온 농도 증가를 유발합니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 칼슘 이미징을 사용하여 뉴런과 장 신경교세포 사이의 복잡한 상호작용을 정확하게 조사하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 전체 마운트 표본에서 칼슘 반응의 메커니즘과 잠재적인 기능적 결과를 규명하려면 최적의 이미징 품질을 위한 정밀한 해부가 필요합니다.본 현미경 기반 기술 내에서 형광 표지 및 약리학적 자극을 사용함으로써, 천연 다세포 환경 내에 있는 이러한 세포들에 대한 평가를 개선할 수 있습니다.

in-situ-ca2-imaging-of-the-enteric-nervous-system

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 염료가 조정 해상도 등 기니 돼지 장용 신경계의 plexuses으로 손상 신경망에서 전기 활동의 광학 녹음을 활성화하는 방법 전압에 민감한 개념 단일 세포에서 다중 ganglionic 회로 등을 꼽을 수 있습니다.

전압에 민감한 염료를 사용하여 기니 돼지 장용 네트워크에서 전기 활동의 광학 녹음

이 비디오는 쥐 장의 점막하 및 판막에서 장 신경교세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 점막하 및 얇은 판 propria 조직을 추출하고, 장 신경교세포를 분리하고, 코팅된 웰 플레이트에서 세포를 배양하여 장 신경교세포 배양을 확립하는 단계를 간략하게 설명합니다.

쥐의 점막하부(submucosa and lamina propria)에서 장 신경교세포(enteric glial cells)를 분리(isorating enteric glial cells from the submucosa and lamina propria of a mouse)

이 비디오는 면역형광 및 컨포칼 현미경을 사용하여 신경 세포 집단 분포를 시각화하고 분석하기 위해 배아 쥐 위장관의 면역 염색을 보여줍니다.

Immunofluorescent staining of neuronal populations in the embryonic murine gastrointestinal tract(배아 쥐 위장관에서 신경 세포 집단의 면역형광 염색)

출처: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+ 장 신경계의 영상. J. Vis. Exp. (2015)이 비디오는 칼슘을 보여줍니다. 마우스 Colonic Myenteric plexus 제제에서 장 뉴런 및 신경교세포의 활동을 시각화하고 분석하기 위한 이미징.

Calcium Imaging of enteric Neuron and Glia Activities in a Mouse Colonic Myenteric Plexus(마우스 결장 근육총에서 장 뉴런 및 신경교 활동의 칼슘 이미징)

출처: Doser, R., et al. 생체 내 신경 칼슘 처리의 세포 내 이미징. J. Vis. 경험. (2023년)이 비디오는 형질전환 Caenorhabditis elegans 균주의 복부 신경 코드 뉴런에서 세포내 칼슘 플럭스의 생체 내 이미징을 보여줍니다. 두 가지 별개의 칼슘 지표가 사용됩니다: 한 균주의 세포질 지표와 다른 균주의 미토콘드리아 지표. 뉴런은 자발적인 뉴런 활동 중 칼슘 플럭스를 반영하여 뉴런 세포질 및 미토콘드리아 내 형광 강도의 실시간 변화를 모니터링하기 위해 형광 현미경으로 관찰됩니다.

Caenorhabditis elegans의 뉴런에서 세포내 칼슘 역학 이미징

우리는 장용 신경계의 신경 세포 및 교세포 구성 요소의 직접적인 연구를위한 세포 배양 프로토콜을 보여줍니다. coverslips는에 신경 / glia의 혼합 문화, 면역 전기 생리학, 개별 신경 세포와 아교 세포 기능을 검사 할 수있는 기능을 제공하는 성인 마우스 myenteric 신경 얼기에서 준비가되어...

<em&gt; 체외</em성인 마우스 Myenteric 신경총에서 분리 된 장내 뉴런과 교세포의&gt; 준비

장 신경계는 장에서 증식하고 이동하고 군체화하는 신경능선세포에 의해 형성됩니다. 신경능선세포(neural crest cell)는 신경전달물질 표현형에 특이적인 마커를 가진 뉴런으로 분화합니다. 이 프로토콜은 장 신경계 신경전달물질 발현을 시각화하기 위해 쥐 배아 위장관을 해부, 고정 및 면역 염색하는 기술을 설명합니다.

쥐 장내 신경 시스템 개발을 시각화하는 면역 염색

이 기사에서는 성체 마우스에서 결장 운동성의 신경 조절 변화를 식별하기 위한 비디오 이미징 기술과 고해상도 시공간 매핑에 대해 설명합니다. 위장관(GI) 기능에 대한 미묘한 영향은 위장관 질환에 대한 이해를 증진하기 위해 분리된 조직 제제에서 이 접근법을 사용하여 감지할 수 있습니다.

비디오 이미징 및 시공간지도는 마우스에서 위장관 운동성을 분석하는

장간막 구심성 신경은 위장관에서 뇌로 정상적인 항상성과 병태생리학에 관한 정보를 전달합니다. 위장 구심성 신경 활동은 구심성 신경이 부착된 분리된 장 분절을 장기 욕조에 장착하고, 신경을 분리하고, 기저 활동과 자극 활동을 평가하여 평가할 수 있습니다.

마우스 Jejunal과 대장 세그먼트에서 장간막 구 심성 신경 활동의 생체 외 녹음에서

자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 특정 화학 결합의 고유 진동을 기반으로 생체 분자의 라벨 없는 이미징을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서, 통합 SRS 및 이광자 형광 현미경의 도구 셋업은 살아있는 마우스의 척수에서 세포 구조를 시각화하기 위해 기술된다.

생체 내 결합 된 이광자 형광 및 자극 된 라만 산란 현미경을 사용한 생물학적 조직 이미징

이 프로토콜은 후근 신경절(DRG)에 이어 GCaMP3(유전적으로 인코딩된Ca2+ 지표; 녹색 형광 단백질-칼모듈린-M13 단백질 3) 동측 뒷발에 다양한 자극을 가하면서 Pirt-GCaMP3 마우스를 사용하여 신경 앙상블의Ca2+ 이미징.

생체 내 온전한 등근 신경절에 있는 일차 감각 뉴런 네트워크에서 뉴런 앙상블의 칼슘 이미징

학습하세요 장용 신경계의 칼슘 이미징 방법을 통해 장 신경세포와 신경교세포 활성을 실시간 관찰하는 기술입니다. 이 프로토콜은 소화기 생리학 및 장 질환 연구에 활용됩니다.

장용 신경계의 제자리 ^칼슘 이미징에서

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