장용 신경계의 제자리 칼슘 이미징에서

이 절차의 전반적인 목표는 형광 칼슘 지시약 염료를 사용하여 장의 살아있는 전체 마운트 제제에서 장 뉴런과 신경교세포의 활동을 이미지화하는 것입니다. 이것은 먼저 동물에서 장의 일부를 절제하여 예열 배지에 넣음으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 장간막 경계를 따라 장을 열고 점막 표면이 위를 향하도록 가벼운 장력으로 평평하게 고정하는 것입니다.

myenteric plexus의 전체 마운트 제제는 현미해부에 의해 준비되고 이미징 접시에 배치됩니다. 다음으로, 전체 마운트 준비물은 인큐베이터에 형광 지시약 염료 flu oh four가 적재됩니다. 마지막 단계에서, 적재된 제제는 이미지 획득 및 분석 소프트웨어로 제어되는 고해상도 카메라가 장착된 형광 이미징 현미경을 사용하여 이미지화되어 기준선 활동을 기록합니다.

그런 다음 연구 중인 약물을 추가하고 뉴런과 신경교세포의 칼슘 과도 현상을 기록합니다. 궁극적으로는 현장에서 말이죠. 장 신경계의 칼슘 영상은 뉴런과 신경교세포의 세포 활동이 장 병태생리학에서 생리적 장 기능 조절 및 장 신경계 기능 장애에 어떻게 기여하는지 연구하는 데 사용됩니다.

이 기술의 의미는 NC 두 칼슘 이미징을 사용하여 뉴런과 장 아교세포 사이의 복잡한 상호 작용을 조사하는 간단하고 강력한 방법을 사용하여 기능적 장 질환 및 염증성 장 질환의 생리학 및 병태 생리학에 대한 이해를 확립하는 방향으로 확장됩니다. 실험 동물의 조직과 관련된 다음 절차는 2013년 동물 안락사에 대한 A VMA 지침과 일치하며, 승인된 절차에 따라 동물을 안락사시킨 후 동물을 누운 자세로 눕히고 70% 에탄올로 복부 피부를 청소합니다. 집게를 사용하여 복부 정중선을 꼬집은 다음 수술용 가위를 사용하여 선형 팔꿈치를 따라 6cm 내측을 절개하여 내부 소화 기관을 노출시킵니다.

다음으로, 뭉툭한 집게를 사용하여 복막 내부의 결장을 찾아 노출시킵니다. 회장 결장 장간막을 가위로 자르고 장을 풀기 시작합니다. 장의 길이가 적절하게 풀리면 대장 준비를 위해 맹장 원위부와 직장 근위

그런 다음 장 분절을 빠르게 제거하고 얼음 위에 3개의 마이크로몰 니카르디핀 염산염과 1개의 마이크로몰 S 스코폴라민 염산염이 보충된 DM EMF 12 Media가 들어 있는 비이커에 넣습니다. 이러한 억제제를 추가하면 장 평활근을 마비시켜 현저해부와 후속 이미징을 용이하게 합니다. 원하는 장 분절의 작은 4-6cm 분절을 제거하고 냉장 보충 매체로 채워진 실 가드 코팅된 페트리 접시에 넣습니다.

그런 다음 곤충 핀으로 장 분절의 근위부와 원위 끝을 고정하고 장간막 경계를 따라 세로로 직선으로 잘라 장관을 엽니다. 이제 점막면이 위로 향하게 하여 가벼운 장력으로 조직을 평평하게 고정하고 5번 가는 집게로 점막을 들어 올리고 아주 가는 스프링 가위로 아래를 잘라 점막층을 조심스럽게 절개합니다. 조직을 약 0.5cm 정사각형의 더 작은 제제로 자르고 각 조각을 보충 매체로 채워진 이미징 접시에 넣고 얼음 위에 놓습니다.

원형 근육 층이 위를 향하도록 하여 각 준비물을 네 모서리에 고정합니다. 원형 근육을 가는 핀셋으로 놀려서 조심스럽게 해부합니다. myenteric plexus를 노출시키려면 과도한 스트레칭을 피하고 이미징 접시를 얼음 위에 다시 놓고 각 접시의 용액을 새로 보충된 매체로 교체하십시오.

다음으로, 얼음에서 접시를 꺼내고 각 접시에 2ml의 효소 혼합물을 넣고 5% 이산화탄소와 95% 공기로 실온에서 15분 동안 배양합니다. 마지막으로, 1.5 밀리리터의 보충 매체와 1.2 마이크로 리터의 250 밀리 몰 프로빗 스톡에서 1.5 마이크로 리터의 Eloqua 4 밀리 몰 플루로 4 스톡에서 이미징 접시에 로딩 용액을 이미징 플레이트에 로딩하고 45 동안 섭씨 37도의 어두운 인큐베이터에서 45 동안 배양하기 위해 제한된 빛 조건에서 작업하는 동안 조직 준비물을 세 번 세척하고 모서리를 고삐를 늦춥니다 분. 인큐베이터에서 접시를 꺼낸 후 미디어로 준비물을 세 번 씻으십시오.

그런 다음 200마이크로몰 프로산이 포함된 새로운 배지를 추가하여 신경 신경 세포 표지를 강화하고 이전과 같이 15분 동안 배양합니다. 배양 중에 프로토콜의 서면 부분에 있는 지침에 따라 변형된 크렙스 완충액을 만들고 근육 수축을 억제하기 위해 3개의 마이크로몰 니카르디핀과 1개의 마이크로몰 스코폴라민을 추가합니다. 칼슘 투 플러스 이미징 및 전체 마운트 해부 중에는 기록 챔버를 형광 현미경 아래에 배치하고 여러 개의 가열된 주사기 저장소가 있는 중력 흐름 관류 시스템을 사용합니다.

섭씨 37도 크렙스 완충액의 분당 2-3밀리리터의 연속 관류 속도를 설정합니다. 진공 트랩에 연결된 흡입 라인과 흡입 라인 모두에 기포가 형성되지 않도록 하십시오. 명시야 조명 아래에서 원하는 plexus에 초점을 맞춥니다.

광표백을 유발할 수 있는 조직을 과도하게 노출시키지 마십시오. 신경절 내 독감 4개 부하를 검사하고 이미징을 위해 건강한 신경절을 선택합니다. 건강하지 않은 손상된 신경절은 자가형광 또는 반점 형태를 나타내므로 이미징에 사용해서는 안 됩니다.

일단 신경절이 선택되면, 빛의 경로를 카메라로 전환하고 라이브 이미지를 얻습니다. 이미지 획득 소프트웨어를 사용하여 신경절에 초점이 맞춰져 있는지 확인하고 이미지 획득 속도와 노출 시간을 설정합니다 이미지 획득 속도와 시간은 조사자가 기록하고자 하는 이벤트에 따라 달라집니다. 대부분의 실험에서 이미지는 전통적으로 신경교세포의 경우 0.5-1헤르츠, 최대 2-10헤르츠에서 획득됩니다.

뉴런의 경우, 신경교세포 칼슘 일시가지(glial calcium transient)가 칼슘 일시적 뉴런만큼 빠르지 않기 때문에, 기록을 시작하고 30초 동안 실험적 자극이 없을 때 선택한 신경절의 기준선 생리학적 활성을 확립합니다. 그런 다음 약물에 최적화된 프로토콜에 따라 분당 2-3밀리리터의 속도로 중력 흐름 관류 시스템을 사용하여 수용체 작용제 및 길항제와 같은 예열 약물을 적용합니다. 녹화를 중지하고 실험의 타임랩스 동영상을 봅니다.

적절한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 관심 영역 또는 ROI를 신중하게 선택하십시오. 마지막으로, 적절한 이미징 소프트웨어를 사용하여 관심 영역의 형광 강도를 정규화하고 초기 기준선과 비교합니다. 정규화된 형광의 값 변화는 칼슘의 변화에 정비례합니다. 다음 세 가지 이미지는 기니피그의 장 신경교세포가 TP in situ에 반응하는 것을 보여줍니다.

기초 조건에서는 점선으로 윤곽이 그려진 낮은 수준의 fluoro four 형광이 보입니다. 화살표는 리터당 100 마이크로 mo A TP 신경교세포로 자극 시 두꺼운 신경절 간 섬유관을 가리키지만, 뉴런은 칼슘의 증가를 나타내는 형광 4 형광을 빠르게 증가시키지 않습니다. 반응하는 세포는 작고 별표로 표시된 어두운 공간으로 표시된 훨씬 더 큰 뉴런을 둘러싸고 있습니다.

이 히스토그램은 장 신경교세포가 용량 의존적 방식으로 TP에 반응하며 리터당 1밀리몰이 최대 반응을 이끌어낸다는 것을 보여줍니다. 이 비디오는 칼슘 2 플러스 지표 염료 독감 오 4로 가득 찬 쥐 원위 결장의 myenteric ganglion을 보여줍니다. 신경교세포 작용제(glial cell agonist) DP는 지시가 있을 때 수조에 추가됩니다.

DP는 세포 내 칼슘 2 플러스 장의 신경교세포의 증가를 유도하며, 이는 독감 오 4 형광의 일시적인 상승에 의해 관찰됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 칼슘 이미징을 사용하여 뉴런 간의 복잡한 상호 작용을 정확하게 검사하고 경험적으로 검사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 전체 마운트 제제에서 칼슘 반응의 메커니즘과 잠재적인 기능적 결과를 특성화하려면 이상적인 이미징 품질을 위한 정밀한 해부가 필요합니다.

이 현미경 기반 기술 내에서 형광 표지 및 약리학적 자극을 사용하면 고유한 다세포 환경에서 이러한 세포에 대한 평가를 개선할 수 있습니다.