Name: 생체 내 온전한 등근 신경절에 있는 일차 감각 뉴런 네트워크에서 뉴런 앙상블의 칼슘 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 학습하세요 Pirt-GCaMP3 마우스에서 등근 신경절을 노출하고 공초점 현미경으로 칼슘 이미징을 수행하는 방법을. 이 기술은 통각 과민성 및 알로디니아 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 국립 보건원 보조금 R01DE026677 및 R01DE031477(YK), UTHSCSA 스타트업 펀드(Y.S.K.) 및 텍사스 대학교 시스템(YSK)의 Rising STAR Award의 지원을 받았습니다.

<ol><li>Rivero-Melián, C., Grant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+lumbar+dorsal+root+fibers+in+the+lower+thoracic+and+lumbosacral+spinal+cord+of+the+rat+studied+with+choleragenoid+horseradish+peroxidase+conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate.</a> The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).</li>
<li>Wessels, W. J., Marani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rostrocaudal+somatotopic+organization+in+the+brachial+dorsal+root+ganglia+of+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neurology+and+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats.</a> Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).</li>
<li>Schmalbruch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+number+of+neurons+in+dorsal+root+ganglia+L4-L6+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat.</a> The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).</li>
<li>Sørensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+further+loss+of+dorsal+root+ganglion+cells+after+axotomy+in+p75+neurotrophin+receptor+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).</li>
<li>Basbaum, A. I., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Pain.</a> Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).</li>
<li>Liu, Y., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+somatic+sensory+neuron+diversity+and+implications+on+sensory+coding%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).</li>
<li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li>
<li>Stucky, C. L., Mikesell, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+pain+in+disorders+affecting+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Cutaneous pain in disorders affecting peripheral nerves.</a> Neuroscience Letters. 765, 136233(2021).</li>
<li>Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+for+analgesic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging for analgesic drug discovery.</a> Neurobiology of Pain. 11, 100083(2022).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjacent+intact+nociceptive+neurons+drive+the+acute+outburst+of+pain+following+peripheral+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7651(2019).</li>
<li>Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+in+vivo+recording+of+sensory+neuron+activity+with+GCaMP6%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6.</a> eNeuro. 5 (1), (2018).</li>
<li>Emery, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+distinct+modality-specific+subsets+of+somatosensory+neurons+using+GCaMP%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP.</a> Science Advances. 2 (11), 1600990(2016).</li>
<li>Ishida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcium+imaging+visualizes+incision-induced+primary+afferent+sensitization+and+its+amelioration+by+capsaicin+pretreatment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+activation+of+primary+sensory+neurons+contributes+to+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li>
<li>MacDonald, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+cold-sensing+neurons+contribute+to+cold+allodynia+in+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain.</a> Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+afferents+use+different+coding+strategies+for+heat+and+cold%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold.</a> Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).</li>
<li>Kucharczyk, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+bone+cancer+on+the+peripheral+encoding+of+mechanical+pressure+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli.</a> Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).</li>
<li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+phosphoinositide-binding+protein%2C+functions+as+a+regulatory+subunit+of+TRPV1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1.</a> Cell. 133 (3), 475-485 (2008).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+terminal+sensitization+of+TRPV1+by+descending+serotonergic+facilitation+modulates+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain.</a> Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Mahadevan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cytoNet%3A+Spatiotemporal+network+analysis+of+cell+communities%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities.</a> PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846(2022).</li>
<li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).</li>
<li>Leijon, S. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+thermosensing+by+murine+trigeminal+neurons%3A+modulation+by+capsaicin%2C+menthol+and+mustard+oil%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil.</a> The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).</li>
<li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450(2016).</li>
<li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171(2015).</li>
<li>Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coding+of+cutaneous+temperature+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The coding of cutaneous temperature in the spinal cord.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).</li>
<li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li>
<li>Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+chronic+pain+of+predominantly+neuropathic+origin.+Results+from+a+general+population+survey%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey.</a> The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).</li>
<li>Shannonhouse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meclizine+and+metabotropic+glutamate+receptor+agonists+attenuate+severe+pain+and+Ca%282%2B%29+activity+of+primary+sensory+neurons+in+chemotherapy-induced+peripheral+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy.</a> The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).</li>
<li>Luiz, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+sensing+by+Na%28V%291.8-positive+and+Na%28V%291.8-negative+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).</li>
<li>Hartung, J. E., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GCaMP+as+an+indirect+measure+of+electrical+activity+in+rat+trigeminal+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons.</a> Cell Calcium. 89, 102225(2020).</li>
<li>Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+pain+from+facial+skin+and+oral+mucosa%3A+Unique+neurobiology+and+challenging+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810(2021).</li>
<li>Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin-1+mutations+increase+levels+of+ryanodine+receptors+and+calcium+release+in+PC12+cells+and+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).</li>
<li>Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+G-protein+signaling+in+receptor+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulators of G-protein signaling in receptor complexes.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 10 (6), 263-268 (2000).</li>
<li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+Ca%282%2B%29+responses+in+the+spinal+dorsal+horn+by+noxious+stimuli+to+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Astrocytic Ca(2+) responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 101-104 (2018).</li>
<li>Tan, C. H., McNaughton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TRPM2+ion+channel+is+required+for+sensitivity+to+warmth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth.</a> Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).</li>
<li>Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Knöpfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+brain+electric+signals+with+genetically+targeted+voltage-sensitive+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+recording+of+neural+spikes+in+awake+mice+and+flies+with+a+fluorescent+voltage+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor.</a> Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).</li>
<li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).</li>
<li>Harada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+fluorescent+protein-based+cAMP+indicator+applicable+to+optogenetics+and+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7351(2017).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

지속적인 통증은 다양한 장애에 나타나며, 약 8%의 사람들의 삶의 질을 쇠약하게 하거나 감소시킨다29. 일차 감각 뉴런은 피부의 유해한 자극을 감지하며, 그 가소성은 지속적인 통증에 기여합니다8. 뉴런은 세포 배양 및 외식편에서 연구할 수 있지만 그렇게 하면 정상적인 생리학적 맥락에서 제거됩니다. DRG의 외과적 노출에 이어 Pirt-GCaMP3 Ca2+ 이미징을 통해 뒷발에 가해지는 자극을 사용하여 정상적인 생리학적 맥락에서 일차 감각 뉴런을 연구할 수 있습니다. 이러한Ca2+ 이미징 방법의 주요한 이점은 많은 수의 뉴런이 동시에 모니터링될 수 있다는 것이다. 이 방법을 사용하면 모달리티, 뉴런 직경 및 결합 활성화 10,11,12,13,14,15,16,17,30과 같은 희귀 현상의 집단 수준에서 분석하여 정상 및 병리학적 체성 감각에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.<...

일차 감각 뉴런은 피부를 직접 자극하고 체성 감각 정보를 중추 신경계로 다시 전달합니다 1,2. 등근 신경절(DRG)은 10,000-15,000개의 일차 감각 뉴런으로 구성된 세포체 클러스터입니다 3,4. DRG 뉴런은 다양한 크기, 수초화 수준, 유전자 및 수용체 발현 패턴을 나타냅니다. 더 작은 직경의 뉴런은 통증을 감지하는 뉴런을 포함하며, 더 큰 직경의 뉴런은 전형적으로 통증이 없는 기계적 자극에 반응한다 5,6. 손상, 만성 염증 및 말초 신경 병증과 같은 일차 감각 뉴런의 장애는 이러한 뉴런을 다양한 자극에 민감하게 만들고 만성 통증, 이질통 및 통증 과민증에 기여할 수 있습니다 7,8. 따라서 DRG 뉴런에 대한 연구는 일반적으로 체성 감각과 많은 통증 및 가려움 장애를 이해하는 데 중요합니다.
생체 내에서 발화하는 뉴런은 체성 감각에 필수적이지만, 최근까지 생체 내에서 온전한 신경절을 연구하는 도구는 상대적으로 적은 수의 세포로 제한되어 왔다9. 여기에서 우리는 생체 내 인구 수준에서 뉴런의 활동 전위 또는 활동을 앙상블로 연구하는 강력한 방법을 설명합니다. 이 방법은 세포질Ca2+ 역학에 기초한 이미징을 사용한다. Ca 2+ 민감성 형광 지시약은 일반적으로 낮은 농도의 세포질 Ca2+ 로 인해 세포 활성을 측정하기 위한 좋은 프록시입니다. 이 지표는 마우스 9,10,11,12,13,14,15,16 및 래트 17에서 수백에서 수천 개의 일차 감각 뉴런을 동시에 모니터링 할 수있게 해주었습니다. 본 연구에 기술된 생체내 Ca2+ 이미징의 방법은 기계적, 저온, 열적 및 화학적 자극에 대한 집단 수준 반응을 직접 관찰하기 위해 사용될 수 있다.
포스포이노시티드-결합 막 단백질인 Pirt는 거의 모든(>95%) 일차 감각 뉴런(18,19)에서 높은 수준으로 발현되며, 생체 내에서 뉴런 활동을 모니터링하기 위해Ca2+ 센서인 GCaMP3의 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다(20). 이 프로토콜에서, 공초점 레이저 스캐닝 현미경(LSM)을 사용하여 Pirt-GCaMP3 마우스(14)의 우측 요추 5(L5) DRG에서 생체내 DRG 수술,Ca2+ 이미징 및 분석을 수행하기 위한 기술이 기재되어 있다.

<table><tbody><tr><td>Anased Injection (Xylazine)</td><td>Covetrus, Akorn</td><td>33197</td><td></td></tr><tr><td>C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC</td><td>Cal Zeiss</td><td>422642-9900-000</td><td></td></tr><tr><td>면 팁 애플리케이터</td><td>McKesson</td><td>24-106-1S</td><td></td></tr><tr><td>곡선형 Hemostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13007-12</td><td></td></tr><tr><td>DC 온도 컨트롤러</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>DC 온도 컨트롤러 가열 패드</td><td>FHC</td><td>40-90-2-05</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 세라믹 코팅 집게</td><td>정밀 과학 도구</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>FHC DC 온도 컨트롤러</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Fluriso (Isoflurane)</td> <td>MWI 동물 건강, Piramal Group</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16221-14</td><td></td></tr><tr><td>GelFoam</td><td>Pfizer</td><td>09-0353-01</td><td></td></tr><tr><td>Ketaset (Ketamine)</td><td>Zoetis</td><td>KET-00002R2</td><td></td></tr><tr><td>발광 녹색 무대 테이프</td><td>JSITON / Amazon</td><td>B803YW8ZWL</td><td></td></tr><tr><td>Matrx VIP 3000 Isoflurane 기화기</td><td>Midmark</td><td>91305430</td><td></td></tr><tr><td>Micro 해부 가위</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Micro 해부 스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 해부 스프링 가위</td><td>Roboz</td><td>RS-5677</td><td></td></tr><tr><td>미니 직장 서미스터 프로브</td><td>FHC</td><td>40-90-5D-02</td><td></td></tr><tr><td>작동 가위</td><td>Roboz</td><td>RS-6812</td><td></td></tr><tr><td>Pirt-GCaMP3 C57BL/6J 마우스</td><td>존스 홉킨스 대학교</td><td>N/A</td><td>어느 성별이든 똑같이 잘 이미지화될 수 있습니다. 생쥐는 생후 8주 이상이어야 하는데, 이는 어린 생쥐에서 약하거나 간헐적인 Pirt 프로모터 발현으로 인해 발생합니다.</td></tr><tr><td>SMALGO 소동물 알고리즘</td><td>Bioseb 생체 내 연구 기기</td><td>BIO-SMALGO</td><td></td></tr><tr><td>입체 구조</td><td>Kopf 모델 923-B</td><td>923-B</td><td></td></tr><tr><td>td-토마토 C57BL/6J 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>7909</td><td></td></tr><tr><td>상판, 6인치 x 10인치</td><td>Newport</td><td>290-TP</td><td></td></tr><tr><td>TrpV1-Cre C57BL/6J 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>17769</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 800 컨포칼 현미경</td><td>Cal Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen 2.6 블루 에디션 소프트웨어</td><td>Cal Zeiss</td><td>Zen (Blue Edition) 2.6</td><td></td></tr></tbody></table>

생체 내 온전한 등근 신경절에 있는 일차 감각 뉴런 네트워크에서 뉴런 앙상블의 칼슘 이미징

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ 이미징은 세포질 내로의 Ca2+ 진입 또는 세포내Ca2+ 저장소의 방출을 수반하는 활동 전위 및 다양한 신호전달 메카니즘을 포함하는 세포 활성에 대한 프록시로서 사용될 수 있다. 마우스에서 후근 신경절(DRG)의 일차 감각 뉴런의 Pirt-GCaMP3 기반Ca2+ 이미징은 많은 수의 세포를 동시에 측정할 수 있는 이점을 제공합니다. 최대 1,800개의 뉴런을 모니터링할 수 있으므로 뉴런 네트워크와 체성 감각 과정을 생체 내 인구 수준에서 정상적인 생리학적 맥락에서 앙상블로 연구할 수 있습니다. 모니터링되는 많은 수의 뉴런을 통해 다른 방법을 사용하여 감지하기 어려운 활동 패턴을 감지할 수 있습니다. 자극은 마우스 뒷발에 적용될 수 있으며, DRG 뉴런 앙상블에 대한 자극의 직접적인 효과를 연구 할 수 있습니다. Ca 2+ 과도 현상을 생성하는 뉴런의 수 및 Ca2+ 과도 현상의 진폭은 특정 감각 양식에 대한 민감도를 나타낸다. 뉴런의 직경은 활성화된 섬유 유형(무독성 기계 대 유해 통증 섬유, Aβ, Aδ 및 C 섬유)의 증거를 제공합니다. 특정 수용체를 발현하는 뉴런은 Pirt-GCaMP와 함께 td-Tomato 및 특정 Cre 재조합 효소로 유전적으로 표지될 수 있습니다. 따라서 DRG의 Pirt-GCaMP3 Ca2+ 이미징은 통증, 가려움증, 촉각 및 기타 체성 감각 신호를 연구하기 위해 인구 수준에서 앙상블 역할을 하는 특정 감각 양식 및 뉴런 하위 유형을 분석하기 위한 강력한 도구와 모델을 제공합니다.

<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64826/64826fig04.jpg"> 그림 4: Pirt-GCaMP3 마우스의 L5 등쪽 뿌리 신경절의 대표 이미지. (A,D) Pirt-GCaMP3 마우스의 L5 등쪽 뿌리 신경절의 단일 프레임 고해상도 스캔이 표시됩니다. (비,이) . 자극이 없는 경우 패널 A와 패널 D에서 각각 Pirt-GCaMP3 L5 DRG 신경절의 15프레임의 평균 강도 투영. 자발적인 Ca2+ 과도 현상을 생성한 일부 뉴런은 노란색 화살표로 호출됩니다. (C) 100g 뒷발 프레스 동안 패널 A에서 자극 전 2프레임 및 Pirt-GCaMP...

이 프로토콜은 후근 신경절(DRG)에 이어 GCaMP3(유전적으로 인코딩된Ca2+ 지표; 녹색 형광 단백질-칼모듈린-M13 단백질 3) 동측 뒷발에 다양한 자극을 가하면서 Pirt-GCaMP3 마우스를 사용하여 신경 앙상블의Ca2+ 이미징.

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

이 방법을 사용하여 모니터링되는 뉴런의 수는 이전 방법이나 다른 방법을 사용하여 불가능한 뉴런 네트워크 데이터를 수집할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 뒷발에 가해지는 자극에 직접 반응하여 한 번에 거의 2, 000 개의 1 차 감각 뉴런을 모니터링 할 수 있다는 것입니다. 이 절차는 말초 이질통 및 통증 과민증에 대한 치료 중재를 연구하는 데 특히 적합합니다.이 방법은 삼차 신경절 또는 슬상 신경절 연구에 적용하거나 순환 AMP와 같은 전압 또는 세포 신호 분자에 대해 유전적으로 인코딩된 센서와 함께 사용할 수 있습니다. 이 수술을 수행하려면 연습이 필요합니다. 한 마리의 동물에 대해 최대 6개의 등쪽 뿌리 신경절에서 연습할 수 있습니다.절차를 시연하는 것은 John Shannonhouse와 Mr.Ruben Gomez의 도움을 받아 제가 할 것입니다. 시작하려면 체온을 섭씨 37도로 유지하기 위해 가열된 패드에 마우스를 놓습니다. 마우스의 골반 뼈를 느껴 요추 확대를 찾습니다.그런 다음 요추 확대 부위 위로 마우스 뒤쪽을 면도하십시오. 가위를 사용하여 요추 확대 부위 위에 3면 직사각형 절개를하고 집게로 피부를 접습니다. 13mm 스프링 해부 가위를 사용하여 척추 오른쪽에 3-4mm 절개를 합니다.가위를 사용하여 피부와 근육을 옆으로 잘라 척추를 노출시킵니다. 그런 다음 8mm 가위를 사용하여 근육과 결합 조직을 잘라내어 오른쪽 L5 DRG의 횡돌기를 청소합니다. 면봉이나 Gelfoam을 사용하여 혈액을 흡수하여 출혈을 최소화하십시오.DRG를 만지지 않도록 주의하면서 Friedman-Pearson rongeurs 또는 강한 미세 집게를 사용하여 오른쪽 L5 횡단 프로세스를 잘라냅니다. 그런 다음 마우스와 가열 패드를 사용자 지정 단계로 이동합니다.tage. 사용 stage, 테이프를 사용하여 동물과 가열 패드를 제자리에 고정합니다.지속적인 이소 플루 란 마취를 위해 동물의 코를 코 콘에 놓습니다. 자극을 쉽게 적용할 수 있도록 오른쪽 뒷발을 무대에서 튀어나온 위치에 고정합니다. 스테이지 클램프로 척추를 제자리에 고정합니다.amp척추 또는 골반 뼈의 피부 위에 L5 DRG의 주둥이와 꼬리만 있습니다.클램프와 스테이지를 조정하여 DRG의 표면을 가능한 한 평평하게 만듭니다. 그런 다음 스테이지를 현미경 아래에 놓아 대물렌즈를 낮췄을 때 대물렌즈가 DRG보다 바로 위에 8mm 위에 오도록 합니다. 직장 체

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Shannonhouse, J., et al. 생체 내 온전한 배근 신경절의 1차 감각 뉴런 네트워크에서 뉴런 앙상블의 칼슘 이미징. J. Vis. 특급 (2023). 이 비디오는 형질전환 마우스의 배측근신경절(DRG)에서 신경 세포 활동을 모니터링하기 위한 생체 내 칼슘 이미징 기술을 보여줍니다. DRG 뉴런은 칼슘에 결합할 때 형광 강도를 증가시키는 칼슘 지표를 발현합니다. 뒷발에 가해지는 기계적 또는 열적 자극은 DRG로 전파되는 활동 전위를 생성하여 뉴런에 칼슘 유입을 유도하고 형광 방출을 증가시킵니다.

In vivo: Calcium Imaging of the Intact Dorsal Root Ganglia of a Mouse(마우스의 온전한 등뿌리 신경절에 있는 신경 앙상블의 생체 내 칼슘 이미징)

작은 투명 몸, 잘 문서화 neuroanatomy 및 의무 유전자 기술과 시약의...

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

양국 주 somatosensory corticies (S1) Thy1에서 위의 듀얼 광 창을 통해 신경 활동을 측정 하기 위한 실험 절차 설명-GCaMP6s 유전자 변형 쥐 2 광자 (2 P) 현미경에서 vivo에서를 사용 하 여.

Thy1를 사용 하 여 기본 Somatosensory 피 질에서 신경 활동을 이미징-GCaMP6s 유전자 변형 쥐

본 프로토콜은 체세포 및 내장 자극에 대한 요추-6 DRG 뉴런의 앙상블의 반응을 측정하기 위한 생체 내 칼슘 이미징을 간략하게 설명합니다. 다른 자극에 반응하는 뉴런 간에 철저한 비교가 이루어질 수 있습니다. 이 프로토콜은 침술과 같은 내장 통증 및 신체 자극의 메커니즘을 조사하는 데 유용합니다.

생체 내 체세포 및 내장 자극에 대한 배근 신경절 뉴런의 반응에 대한 칼슘 이미징

유전적으로 인코딩된 칼슘 지표(GECI)는 감각 뉴런 신호에 대한 강력한 집단 수준 분석을 가능하게 합니다. 여기에서 우리는 쥐의 삼차신경절 뉴런 활동의 생체 내 GECI 시각화를 가능하게 하는 새로운 접근 방식을 개발했습니다.

생체 내 쥐 삼차신경절(Rat Trigeminal Ganglion)의 감각 뉴런의 칼슘 이미징

이 연구는 동기식 ECG 기록과 함께 생체 내 칼슘 이미징을 위해 마취된 마우스의 T-DRG를 노출시키는 외과적 조작을 제시합니다. 이 방법은 말초 전기 신경 자극 및 흉부 내장 기관 입력뿐만 아니라 1차 감각 수준에서의 상호 작용을 연구하기 위한 최첨단 도구입니다.

말초 신경 자극 연구를 위한 생체 내 흉부 등근 신경절(DRG) 칼슘 영상 및 ECG 기록

이 프로토콜은 온전한 삼차신경절(TG) 뉴런의 생체 내 GCaMP 칼슘 이미징을 설명합니다. 이 설명에는 TG 노출 수술, TG 뉴런의 생체 내 공초점 현미경 이미징, TG 뉴런 현미경 이미징 중 체세포 자극 적용 및 생체 내 GCaMP 칼슘 이미징 데이터 분석이 포함됩니다.

생체 내 온전한 삼차신경절의 일차 감각 뉴런 네트워크에서 신경 앙상블의 칼슘 이미징

의 연결을 네트워크를 개발 자발적인 활동은 칼슘에 민감한 지표 염료의 AM - 에스테르 양식을 사용하여 측정할 수 있습니다. 의 연결을 활성화를 나타내는 세포 내 칼슘의 변화는 하나 또는 두 개의 광자 이미징과 형광 표시기에 일시적 변화로 감지됩니다. 이 프로토콜은 발달 종속의 연결 네트워크의 범위에 대해 적용할 수...

두피 네트워크 개발에 기능성 칼슘 이미징

이 문서에서 우리는 높은 공간과 시간적 정밀도 시냅스 신호의 통합을 조사하는 기술로 신경 전달 물질의 빠른 마이크로 이온 도입을 소개합니다.

글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

하나의 단위 전기 생리학 녹음에 사용하기 위해 microwires의 조직 배열을 주입하는 기술 문제를 안겨준다. 이 기술과 필요한 장비를 수행하는 방법이 설명되어 있습니다. 또한, 높은 공간 선택과 별개의 신경 하위 영역에서 기록하는 조직 마이크로 와이어 어레이의 유익한 사용을 설명합니다.

동물 행동하자, 깨어있는 단일 단위 레코딩을위한 Microwires의 조직 된 배열을 주입하기위한 절차

학습하세요 Pirt-GCaMP3 마우스에서 등근 신경절을 노출하고 공초점 현미경으로 칼슘 이미징을 수행하는 방법을. 이 기술은 통각 과민성 및 알로디니아 연구에 활용됩니다.

생체 내 온전한 등근 신경절에 있는 일차 감각 뉴런 네트워크에서 뉴런 앙상블의 칼슘 이미징

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