Name: 불연속 Percoll - 자당 밀도 구배를 사용하여 마우스를 접속에서 Synaptoneurosomes의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 배우세요 마우스 대뇌피질에서 불연속 Percoll-자당 밀도 구배를 이용해 번역 활성이 있는 시냅토뉴로솜을 분리하는 방법을. 이 기법은 기계적 손상을 최소화하고 세포 독성을 낮춰 고품질 시냅소솜을 준비합니다.

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우리는 전자 현미경에 대한 위스콘신 매디슨 전자 현미경 시설의 대학에서 BK 8 월 감사드립니다. 이 작품은 NIH 보조금 R01 - DA026067 및 P30 - HD03352 (JSM)을 지원했다.

1. 준비 1-4 <ol><li> 2.5 M의 자당 슬러리의 50 ML을 혼합하여 500 그라디언트 매체의 ML (GM) 버퍼를 준비, 1M 트리스 - HCL, pH7.5 주식 및 0.5 m EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.1 ML 2.5 ML, 산도와 8.0 주식 밀리 볼륨 Q 물. 솔루션 나누어지는 및 저장 냉동을 소독 필터. </li><li> 밀리 Q H 2 O.에서 1 ㎜ 솔루션을 만들어 테트로도톡신 (TTX)의 1000x 재고를 준비 TTX의 Aliquots는 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li><li> 밀리 Q 물 100 MM 트리스 (산도 7.5), 5 솔루션 MM 나 2 HPO 4, 4 MM KH 2 PO 4, 40 MM NaHCO 3, 800 MM NaCl을 만들어 10X 자극 버퍼를 준비합니다. 주식은 4 저장할 수 있습니다 ° C. </li><li> 사전 냉각 원심 분리기에 4 ° C. </li><li> 밀리 Q 물 2.5 M의 자당 (2 ML) 1 볼륨에 Percoll (18 ML) 9 볼륨을 추가하여 Isosmotic Percoll (SIP)의 주식 솔루션을 준비하고 잘 섞는다. </li><li> GM 버퍼 SIP의 각 금액을 추가하고 각각을 혼합하여 3, 10, 15, 23 %의 그라데이션 레이어를 준비 : </li></ol><img alt="표 0" src="/files/ftp_upload/3196/3196table0.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="표 0"><ol start="7"><li> P1000 Gilson Pipetman을 사용하여 대문자로 베크 만의 원심 튜브에 2 ML 23, 15, 10 각각 3 % isosmotic Percoll 솔루션을 pipetting하여 그라데이션 레이어를 붓고. 레이어 사이의 인터페이스는 레이어없이 혼합과 함께 명확하게 뚜렷한해야합니다. 사용하기 전에 적어도 20 분 4 ° C에서 그라디언트를 저장합니다. 당일 사용이 권장되지만 그라디언트 24까지 시간 동안 저장할 수 있습니다. [경험 실험실 인원은 레이어 인터페이스의 시각화를위한 isomotic Percoll 솔루션 파란색 염료를 추가하여 준비 그라디언트를 연습할 수 있습니다.] </li></ol> 2. 마우스 해부 1 <ol><li> 모든 마우스 축산과 안락사 절차 NIH 대학 지침에 따라 수행되었는지 확인합니다. 이산화탄소 질식이나 동물 프로토콜의 승인하는 방법으로 새​​끼 (연령 P13로 P21)를 안락사. </li><li> 해부 보드에 마우스를 핀과 에탄올과 목 및 머리의 뒤쪽을 스프레이. 두개골의 기지에서 척수를 통해자를 날카로운 가위를 사용하여, 두개골의 맨에서 피부를 제거 정수리 뼈 및 interparietal 뼈 사이에 또​​는의 꿈과 피질 영역 사이에 옆으로 두개골을 잘라. 그런 다음 기지에서 코 (sagital 봉합 따라)에 두개골을 잘라, 조심스럽게 옆으로 각 반구를 당겨 부드러운 정수리 뼈를 제거하고 주걱으로 피질을 제거합니다. 소뇌 위 두뇌에 주걱을 넣고 다음 피질을 꺼내서 얼음처럼 차가운 GM 버퍼에 넣습니다. 균질화 단계로 바로 진행합니다. cortices 이것이 부정적인 SNS의 형성에 영향을 미칩니다 매우 오랫동안 얼음처럼 차가운 버퍼에 앉히지 마십시오. </li></ol> 3. homogenate 및 SNS 1-4 준비 <ol><li> 얼음처럼 차가운 GM 버퍼에 cortices을 씻어 차가운 GM 버퍼의 5 ML을 포함하는 유리 다운스 호모 지 나이저 두 cortices을 전송하기만하면됩니다. </li><li> 부드럽게 풀어 유봉의 50-10 스트로크와 cortices를 균질 (유봉 "A"), 꽉 유봉 (유봉 "B")의 50-10 스트로크로 따라갔다. 뇌졸중은 신속한하지만 기포를 발생하지 않는 정도로 천천히해야합니다. 균질 후 homogenate의 사진이 계획 1입니다. 뇌졸중의 수는 각 균 질기와 함께 pestles에 따라 달라질 수 있습니다. 언제 그라디언트가 뇌졸중의 번호를하지 않을 경우 강력한 SN 밴드를 제공한다 조정 완료. </li><li> 펠렛 셀룰러 파편과 핵 4시 15 ML 원뿔 10 분 1000xg에서 원심 ° 스윙 버킷 로터에서 C (Allegra 6KR 원심 분리기)에 homogenate을 전송합니다. 스펀 homogenate의 사진이 계획 1입니다. </li><li> 4 5 분 32,500 XG에서 Percoll - 자당 기울기, 캡 튜브, 그리고 원심 당 뜨는의 레이어 2 ML ㆍ 고정 앵글 로터에서 C (베크 만 J2 - 21 원심 분리기, JA - 17 로터 ()는 적절한 어댑터를 사용 ) 시약 및 장비 표를 참조하십시오. </li><li> 오프 피펫과 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 SN 밴드 위의 솔루션을 폐기. 23분의 15 %의 인터페이스에서 SN 밴드에서 피펫, 얼음에 원뿔과 가게에 전송할 수 있습니다. 각각의 기울기 또는 한 피질 SN의 0.9-1.1 ML을 생산합니다. </li><li> 12 NM의 최종 농도 1000x CaCl 2를 추가하고 특이 현상이 여기을 억제 1 μm의의 최종 농도 1 MM TTX 주식을 추가 10X 자극 버퍼의 10 분의 1 볼륨을 추가하여 SNS의 ​​소금 농도를 조정합니다. (이것은 다운 스트림 SN 응용 프로그램에 영향을 줍니까 경우 CaCl 2의 추가는 선택 사항입니다.) </li><li> 마이크로 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 SNS의 단백질 농도를 결정합니다. (브래드 포드 단백질 분석이 때문에 Percoll에서 추론을 권장하지 않습니다.) </li><li> SNS는 단백질 transla 직접 신속하게 사용할 수 있습니다기 연구. 다른 응용 프로그램에 대한 SN lysate는 청소 또는 피어스 SDS - PAGE 샘플 준비 키트를 사용하여 집중 수 있습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 마우스 대뇌 피질이 불연속 Percoll - 자당의 그라디언트 (제도 1), 6 밴드 또는 분수에 균질하고 분리되었을 때 (그림 1) 볼 수 있었다. 그것은 이전에 높은 분자량 밴드의 성분이 멤브레인 및 myelin 상처와 pelleted 자료 (표 1) mitochondria 또는 organelles 포함된 것을 대뇌 피질 3,5 쥐에 대한 표시되었다. 23 % / 15 % 인터페이스 (밴드 5) 농축 SNS가 포함되어 있습니다. 그대로 SNS를 포함 23 % / 15 % 인터페이스에서 밴드는 등 이전에 설명한 전자 현미경 (EM)에 의해 제거되고 검사되었습니다. 2,6 그들이 그대로 시냅스 vesicles의 존재와 presynaptic 및 postsynaptic 요소의 보전 (그림을 보여주 2). 사전 및 postsynaptic 구획의 분리는 신호와 두 구획에서 발생 단백질 합성을 조사하는 것이 중요합니다. 7-13 Percoll - 자당 기울기 우리가 SN 분율의 작은 세포, 핵 및 organelle 오염을 보았다 그래서 원유 정제하지만 전체 분리 좋았어요. 서양 얼룩 검사를하면, Percoll의 분수는 SN 밴드 (그림 3, 표 2)에서 시냅스 순도 증가 예상 단백질 마커가 포함되어 있습니다. 시냅스의 연결과 마커는 풍부한 SN 밴드 (밴드 5) 유지했지만 다른 마커의 풍부한이 크게 감소되었다. 구조와 시냅스 마커가 유지 또는 개선하는 동안 특히, GFAP, glial 원산지 astrocyte와 종양 세포에 대한 표지 및 Lamin - B1, 핵 마커의 존재는 무시할 수 있었다. 또한, 단백질 합성에 역할을 같은 mitochondria와 잠돌군 Zz 등 organelles,에 대한 마커의 유지가 발생했습니다. BCA 단백질 분석에 의해 결정으로 SN 밴드에 대한 일반적인 수율은 μL 당 단백질의 250-500 NG했다. SNS가 50 μm의 glutamate/10 μm의 글리신과 자극을 때 SNS의 ​​활동이 드 노보 단백질 합성의 양에 의해 결정되었다 [35S] - 메트로의 설립 (그림 4)에 의해 같은 모니터링을 제시 2. 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 translational 활동은 1.56 배 증가했다 (GLU) 또는 Pin1 억제제의 juglone와 활성화 배 5.12. Pin1 억제는 [35S] - 메트로의 설립에있는 증가 드 노보 단백질 합성에 의한되었는지 확인하려면 증가의 단백질 합성 2. 초래하는 것으로 알려져 있습니다, 우리는 40 μm의의 anisomycin, 단백질 합성 억제제를 추가하고, 정관에 표시된 감소를 봤어요 기초 수준에 비해 GLU의 존재와 부재 인치 또한, 2 %는 SNS의 ​​무결성을 방해 트리톤 - X 100의 추가에 따라, 기초 번역 75 % 감소했다. 2 또한, 대부분의 시냅스 마커 농축을 보여주 밴드 (B4 - B6) 검사 때, SNS 또는 밴드 5 드 노보 단백질 합성 (그림 5)에 대한 가장 큰 활동을했다. 따라서 불연속 Percoll - 자당의 그라디언트 신속하게 단백질 번역을 공부하는 데 사용할 수있는 매우 적극적이고 풍부한 SN 밴드를 생산하고 있습니다. 기계적 손상이 엄격한 조건에 의해 발생되기 때문에 불연속 Percoll - 자당 기울기 절차는 다른 방법보다 더 유리합니다. 대뇌 피질의 homogenate를 통과하는 여과 방식에 비해 크기 감소가 3,14-15 Percoll 방법이 큰 활동을 더 SNS를 형성되는 일련의 필터를 통해 전달됩니다. 로 여과 방법으로 준비 SNS의 ​​나누어지는이 23분의 15 %의 인터페이스에서 훨씬 적은 SNS와 깨진 세포막의 큰 금액이있다 Percoll - 자당 기울기를 통해 전달되었다 그림 6에서 볼. 드 노보 단백질 합성이 S35 - 충족의 설립을 통해 측정되었을 때, 여과 방법으로 준비 SNS (그림 7) 훨씬 덜 활성화되었다. translational 활동을 극대화하기 위해 우리는 나이가 P14와 P18 사이 마우스를 사용합니다. SN은 성인 마우스에서 준비하지만, 우리는 청소년 생쥐 (그림 8)에서 준비 SN와 함께 크게 증가 translational 활동을 볼 수 있습니다. <img alt="표 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="표 1"> 표 1. 균질 마우스 피질의 불연속 Percoll - 기울기 fractionations에서 밴드의 성분. 3,5 <img alt="표 2" src="/files/ftp_upload/3196/3196table2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="표 2"> 표 2. 불연속 Percoll - 자당 기울기 밴드 성분 서양 볼트 분석 요약. 밴드 분수의 각각에 대해 상대 단백질 농도는 불연속 Percol를 사용하여 격리나 - 자당 기울기는 서양 얼룩에 의해 결정됩니다. 없음 단백질 선물 (-), 0 ≥ 0.2 (+), 0.2 ≥ 0.8 (++), 또는&gt; 0.8 (+++) 접어 N의 뜨는 (S, 피질 homogenate를 centrifuged) 대표의 단백질 선물보다 큰 = 3. <img alt="스킴 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196scheme1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="제도 1"> 계획 1 : 불연속 Percoll - 자당 밀도 구배를 사용하여 SN 준비의 도식 마우스 뇌 cortices가, 해부 균질, 비 균질 조직, 세포 등 핵 및 세포막과 같은 전체 organelles를 제거하는 낮은 속도로 centrifuged했다.. 불연속 기울기 명확하게 레이어를 정의해야합니다. 삽입 그림은 레이어를 시각화하기 위해 설명을 목적으로 파란 염색되어있는 레이어의 예제를 보여줍니다. 뜨는은 불연속 Percoll - 자당 기울기 위에 계층과 중간 속도 centrifuged입니다. SN 대역은 다음 그라디언트에서 검색하고 사용할 준비가됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 불연속 Percoll - 자당 기울기에 Homogenate 분별화. 마우스 대뇌 피질은 균질 6 밴드 또는 분수로 상승을주는 불연속 Percoll - 자당 기울기에서 분리되었다. 정화, 활성 SNS는 (*) 밴드 5 발견되었습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. SN의 준비는 presynaptic 및 postsynaptic 요소를 유지 SNS의 ​​이종 혼합주세요. C57BL / 6 마우스 (연령 P13로 P21)에서 준비 SN 준비의 전자 현미경을 보존 presynaptic과 postsynaptic 요소와 이전에 설명하고 보여주는 SNS로 수행되었다 2. 6 빨간색 화살표 지점 포스트 시냅스 밀도 수 있습니다. 스케일 바는 1 μm의 수 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. SN의 준비 서양 얼룩 분석 시냅스와의 연결 마커가 정화 SNS 유지다고했다 (밴드 5) 그러나 다른 마커의 풍부한이 크게 감소했습니다. 뜨는의 Immunoblots (S, 대뇌 피질의 homogenate를 centrifuged)과 불연속의 밴드 1-6은 Percoll - 자당 기울기는 (postsynaptic 밀도 β - 굴지 (구조,로드 컨트롤), GFAP (astrocytic), GP73 (잠돌군 Zz), HSC70 (세포질과 핵), Lamin - B1 (핵), Prohibitin (mitochondrial) PSD95에 대한 읽혔어요 ), SNAP25 (시냅스), Synaptophysin (시냅스)와 β3 - Tubulin (신경 세포 특정). 밴드는 N = 3 대표, 폭풍 860 Phosphorimager를 사용하여 시각되었습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. SNS가 활성화되고 [35S] - 메트로 정관을 통해 드 노보 단백질 합성을 나타냅니다. SNS는 ° C 10 분 37 미리 equilibrated되었습니다. 그렇다면 SNS 37 40 μm의의 anisomycin 또는 1 μm의의 juglone로 15 분에 대한 치료 또는 pretreated되었습니다 ° C 번 만났고, 20 μl 익스프레스 프로 라벨 플러스 또는 마이너스 GLU 37, S35 쉬운 태그 믹스 [35S]의 또한 다음 ° C 30 분. 샘플은, 피어스 SDS - PAGE 샘플 준비 키트를 사용하여 준비 15 % polyacrylamide 젤에서 실행, 건조 및 분자 역학 스톰 860 phosphorimager, N = 3 대표, ± SEM을 사용하여 quantitated되었습니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 불연속 Percoll - 자당 기울기에서 밴드 5 드 노보 단백질 합성의 최고 수준이 포함되어 있습니다. 밴드 4, 5 및 6 뜨는 (S, 대뇌 피질의 homogenate를 centrifuged가) 37 미리 equilibrated되었습니다 ° C 10 분. 그런 다음, [35S] - 만났고, 익스프레스 프로 라벨 믹스 S35 쉬운 태그가 추가, 플러스, 마이너스 37 GLU ° C 30 분했습니다. 샘플은, 피어스 SDS - PAGE 샘플 준비 키트를 사용하여 준비 15 % polyacrylamide 젤에서 실행, 건조 및 분자 역학 스톰 860 phosphorimager, N = 3 대표, ± SEM을 사용하여 quantitated되었습니다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 그림 6. 여과 방법에서 준비 SNS는 불연속 Percoll - 자당 기울기 방법에서 준비 SNS 이상 깨진 세포막 이하 모든 SNS가 포함되어 있습니다. SNS는 이전에 설명한대로 기공 크기를 감소로 필터 일련의를 통해 균질 피질을 전달하여 준비되었습니다. 여과 방법으로 준비 SNS의 ​​3,14-15 나누어지는가 불연속 Percoll - 자당 기울기를 통해 centrifuged과 이에 상응하는 금액에 비해되었습니다 불연속 Percoll - 자당 기울기 방법을 사용하여 소재. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 7"> 그림 7. 여과 방법에서 준비 SNS는 SNS가 서있 준비 미만 드 노보 단백질 합성 활동을 포함m 불연속 Percoll - 자당 기울기 방법. SNS는 이전에 설명한대로 감소 기공 크기로 필터 3,14-15 일련의를 통해 균질 피질을 통과하여하고 불연속 Percoll - 자당 기울기 방법에 의해 준비되었다. 모두 준비에서 SNS 37 미리 equilibrated되었습니다 ° C 10 분. 그런 다음, [35S] - 만났고, 익스프레스 프로 라벨 믹스 S35 쉬운 태그가 추가, 플러스, 마이너스 37 GLU ° C 30 분했습니다. 샘플은, 피어스 SDS - PAGE 샘플 준비 키트를 사용하여 준비 15 % polyacrylamide 젤에서 실행, 건조 및 분자 역학 스톰 860 phosphorimager, N = 3 대표, ± SEM을 사용하여 quantitated되었습니다. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig8.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 8"> 그림 8. 젊은 마우스 (P14)에서 SNS는 나이가 생쥐 (P85)보다 큰 translational 활동을했습니다. SNS가에 GLU와 함께 10 분 37 preequilibrated 불연속 Percoll - 자당 기울기 방법, ° C를 사용하여 서로 다른 세 생쥐의 준비를 취급 또는 치료했다 [35S]의 존재 - 메트로, 스냅 냉동, 30 분 (특급 프로 라벨 S35 쉬운 태그 믹스)와 나중에 피어스 SDS - PAGE 샘플 준비 키트와 청소. SNS는 다음 12% SDS - polyacrylamide 겔에서 실행 말린 N = 3, ± SEM의 분자 역학 스톰 860 phosphorimager, 대표에 몇 군데 있었다. P14 생쥐에서 SNS는 P85 생쥐보다 적어도 3 배 이상 활성화되었습니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 설명된 불연속 Percoll - 자당 기울기 준비는 시냅스 전송 실험의 다양한 사용할 수 있습니다 적극적인 SNS를 분리하기 위해 빠르고 안정적​​인 방법입니다. Dunkley 외., 3,4가 개발한 방법을 기반으로 그라데이션이 방법은 서로 관련된 두 - 사전 및 postsynaptic 멤브레인 - 파생 vesicles를 분리 subcellular 두뇌 분획화 절차입니다. 더 정화 않고 이러한 SNS가 immunoprecipitation, 서부 blotting, 유동세포계측법 [35S]를 통해 - 메트로 정관, 전자 현미경, 그리고 효소 활동 assays 다양한 아이 소 머라 아제 포함하여 모니터링 드 노보 단백질 합성과를 포함한 분자 생물학 기법, 다양한와 호환됩니다 키나제 활동 assays. 불연속 Percoll - 자당 기울기 절차는 비교적 정직하고 있으나, 그것은 4 솔루션과 두뇌 자료를 유지하는 열쇠입니다 ° C 준비를 통해...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 마이크로 BCA 단백질 분석 키트 </td><td> 찌르다 </td><td> 23,235 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 어부 </td><td> C79 - 500 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 가스 </td><td> Airgas (UW - MDS) </td><td> CD 50 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> RPI </td><td> E57020 </td><td></td></tr><tr><td> EtOH </td><td> 어부 </td><td> A407SK - 4 </td><td></td></tr><tr><td> HCL </td><td> 어부 </td><td> A142 - 212 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 어부 </td><td> P285 - 500 </td><td></td></tr><tr><td> PierceSDS 페이지 샘플 준비 키트 </td><td> 찌르다 </td><td> 89,888 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> RPI </td><td> S23020 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 어부 </td><td> BP328 - 500 </td><td></td></tr><tr><td> 나이 검사하고 사진을 사 </td><td> 어부 </td><td> S381 - 500 </td><td></td></tr><tr><td> 자당 </td><td> RPI </td><td> S24060 </td><td></td></tr><tr><td> 트리스베이스 </td><td> RPI </td><td> T60040 </td><td></td></tr><tr><td> 테트로도톡신 </td><td> 시그마 </td><td> T5651 </td><td></td></tr><tr><td> 익스프레스 프로 라벨 S35 쉬운 태그 믹스 </td><td> Perkin 엘머 </td><td> NEG772 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><th> 장비 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 해부 도구 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 다운스 호모 지 나이저, 7 ML (두 유리와 함께 제공 &quot;A&quot;와 &quot;B&quot;표시 pestles) </td><td> Wheaton의 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> P1000 Gilson Pipetman </td><td> Gilson </td><td> F123602 </td><td></td></tr><tr><td> Allegra 6KR의 원심 분리기 </td><td> 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> 366830 </td><td></td></tr><tr><td> GH 3.8 로터, 섹시한 버킷 로터 </td><td> 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> 360581 </td><td></td></tr><tr><td> 베크 만 J2 - 21 원심 분리기 </td><td> 베크 만 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 모자와 베크 만 튜브 </td><td> 베크 만 </td><td> 355672 </td><td></td></tr><tr><td> 흰색 벽으로 둘러싸인 어댑터 </td><td> 베크 만 </td><td> 342327 </td><td></td></tr><tr><td> 블루 벽으로 둘러싸인 어댑터 </td><td> 베크 만 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> JA - 17 로터, 고정 앵글 로터 </td><td> 베크 만 </td><td> 369691 </td><td></td></tr></tbody></table> 서부 blots에 사용되는 항체의 테이블 : <table border="1"><tbody><tr><th> 항체의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 호스트 종 </th><th> 희석 팩터 </th></tr><tr><td> β - 굴지 </td><td> 시그마 </td><td> A5441 </td><td> 마우스 </td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> 산타 크루즈 </td><td> SC - 65343 </td><td> 마우스 </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> GP73 </td><td> 산타 크루즈 </td><td> SC - 134509 </td><td> 토끼 </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> HSC70 </td><td> 산타 크루즈 </td><td> SC - 7298 </td><td> 마우스 </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Laminβ </td><td> 산타 크루즈 </td><td> SC - 6261 </td><td> 염소 </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Prohibitin </td><td> 산타 크루즈 </td><td> SC - 28259 </td><td> 토끼 </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> PSD95 </td><td> Millipore </td><td> MAB1596 </td><td> 마우스 </td><td> 5 μg / μL </td></tr><tr><td> SNAP25 </td><td> AbCam </td><td> ab5666 - 100 </td><td> 토끼 </td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td> Synaptophysin </td><td> Millipore </td><td> MAB368 </td><td> 마우스 </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> β - 3 - Tubulin </td><td> 산타 크루즈 </td><td> SC - 80016 </td><td> 마우스 </td><td> 1:200 </td></tr></tbody></table>

불연속 percoll - 자당 밀도 구배를 사용하여 마우스를 접속에서 synaptoneurosomes의 준비

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNS)는 마우스 뇌 피질의 균질화 및 분별화 후 얻을 수 있습니다. 그들은 vesicles 또는 대뇌 피질의 조직이 균질 때 축삭 터미널에서 멀리 휴식 격리 터미널을 resealed 있습니다. SNS는 시냅스 전달의 연구에 유용하게하는, 사전과 postsynaptic 특성을 보유합니다. 그들의 연결 신호에 사용되는 분자 기계를 유지하고 이해, 스토리지 및 신경 전달 물질의 릴리스 할 수 있습니다. 적극적인 SNS의 생산과 격리 세포 독성하고 의한 SNS의 기계적 손상이 낮은 활동에 발생할 수 고밀도, 그리고 여과 및 원심 분리 방식에 의한 확장 원심 분리를 요구할 수 Ficoll 같은 문제를 사용하여 medias 수 있습니다. 그러나, SNS를 분리 불연속 Percoll - 자당 밀도 그라디언트의 사용 translationally 적극적인 SNS의 좋은 수율을 생산하는 빠른 방법을 제공합니다. 이 펠렛 SNS 그리고이 기계 고장의 원인이되는, isotonic 조건을 고용하고 적은 짧은 원심 분리를 돌면서을 보유하고 원심 분리 단계를 피할 수로 Percoll - 자당 기울기 방법은 신속하고 부드러운 있습니다.

마우스 뇌 피질에서 translationally 활성화, 손상 synaptoneurosomes (SNS)를 준비하는 방법을 설명합니다. 이 메서드는 활성화된 SNS의 빠른 준비를 위해 허용하는 불연속 Percoll - 자당 밀도 기울기를 사용합니다.

불연속 Percoll - 자당 밀도 구배를 사용하여 마우스를 접속에서 Synaptoneurosomes의 준비

시냅토뉴로솜(Synaptoneurosomes, SNs)은 생쥐 뇌 피질을 균질화하고 분획하여 얻습니다. 이는 재밀봉된 소포 또는 분리된 말단으로...

이 절차의 전반적인 목표는 불연속 페랄 수크로스 밀도 구배(discontinuous peral sucrose density gradient)를 사용하여 마우스 뇌 피질로부터 번역 활성 시냅스 신경 구역(translationally active synap to neuro zones)을 준비하는 것입니다. 이는 먼저 마우스 피질을 수집 및 균질화한 다음, 균질액을 원심 분리함으로써 수행됩니다. 그 후, 원심 분리된 균질액 또는 상층액을 미리 준비된 페르코 수크로스 구배(per co sucrose gradients)에 적용합니다.마지막 단계는 원심분리를 통해 시냅토솜 분획을 수집하는 것입니다. 최종적으로, 웨스턴 블롯 분석과 S 35 메티오닌 통합 실험을 통해 시냅토솜 분획이 시냅스적으로 농축되어 있으며 번역 활성이 있음을 확인합니다. 원심분리 및 여과와 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 첫째, 밀도 구배를 활용함으로써 기계적 손상을 방지할 수 있다는 점이며, 둘째, Percoll은 세포 및 그 구성 성분에 대해 독성이 낮다는 점입니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 타이밍이 매우 중요하기 때문에 이 프로토콜을 수행하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 피질을 수확한 후에는 절차를 신속하게 완료해야 합니다. 절차를 시작하려면, 동반된 원고에 설명된 대로 GM 완충액에 각각의 SIP 양을 첨가하여 3, 10, 15, 23% 농도 구배 층을 준비하고 잘 혼합하십시오.캡이 닫힌 Beckman 원심분리관에 15%, 10%, 3% 등삼투성 perol 용액을 각각 2mL씩 피펫팅하여 농도 기울기 층을 만듭니다. P 1000 피펫을 사용하여 층 간의 경계가 층 섞임 없이 명확하게 구분되도록 해야 합니다. 제작된 농도 기울기는 사용 전 4°C에서 최소 20분 동안 보관하십시오.이 절차를 시작하기 전에, 동반된 원고에 설명된 대로 필요한 다른 용액들을 준비하십시오. P 13에서 P 21 연령의 마우스를 안락사시키고, 목 뒷부분과 머리에 70% ethanol을 뿌려 해부 준비를 합니다. 그 다음, 날카로운 가위를 사용하여 두개골 기저부의 척수를 절단하십시오.다음으로, 두개골 상단의 피부를 제거합니다. 두정골과 두정간골 사이, 또는 대뇌와 피질 영역 사이의 두개골을 측면으로 절개합니다. 그 후, 시상봉합선을 따라 기저부에서 코 방향으로 두개골을 절개합니다.이 단계에서, 각 반구를 옆으로 당겨 부드러운 두정골을 조심스럽게 제거합니다. 그 후, 소뇌 위쪽의 뇌에 스패튤라를 삽입하여 피질을 긁어냅니다. 이를 얼음처럼 차가운 GM 버퍼에 넣고, 더 많은 피질을 수집하기 위해 동일한 절차를 반복합니다.이제 피질을 얼음처럼 차가운 GM 완충액으로 헹굽니다. 그 다음 피질 두 개를 5 mL의 차가운 GM 완충액이 들어 있는 유리 호모게나이저로 옮깁니다. 느슨한 페스틀인 페스틀 A로 5~10회 부드럽게 균질화한 후, 타이트한 페스틀인 페스틀 B로 5~10회 균질화합니다.스트로크 횟수는 사용되는 균질기마다 다릅니다. 균질화된 시료를 15 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. 이를 1000 ×g에서 원심분리합니다.Allegra 6 KR 원심분리기를 사용하여 4 °C에서 10분간 원심분리하여 세포 파편과 핵을 펠렛화합니다. 각 페락소스(peroxisome) 또는 수크로스 밀도 구배당 2 mL의 상층액을 층층이 쌓고, 전체 피질 하나당 구배 하나를 배정하여 튜브의 캡을 닫습니다. 그다음 Beckman J 2-21 원심분리기의 고정각 로터를 사용하여 4 °C에서 32,500 ×g로 5분간 원심분리합니다.완료 후 적절한 어댑터를 사용하여 구배를 형성하면 강한 SN 밴드가 나타나야 하며, SN 밴드 위의 용액을 피펫으로 빨아내어 폐기합니다. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 15~23% 계면에 있는 SN 밴드를 추출하며, 일반적으로 하나의 구배에서 약 0.9~1.1 mL의 SN이 얻어집니다. 그 후, 이를 원추형 튜브로 옮겨 얼음 위에 보관합니다.그 다음, 10배 농축 자극 완충액을 1/10 부피만큼 첨가하여 SNS의 염 농도를 조절합니다. 선택 사항으로, 최종 농도가 12 nM이 되도록 1000배 농축 염화칼슘을 첨가합니다. 다음으로, 비특이적 흥분을 억제하기 위해 최종 농도가 1 µM이 되도록 1 mM TTX 스톡을 첨가합니다.다음 단계는 단백질 번역 연구와 같이 적절한 다운스트림 애플리케이션에 SNS를 사용하는 것입니다. 다른 애플리케이션의 경우, Pierce SDS page sample prep kit를 사용하여 SN 용해물을 정제하거나 농축할 수 있습니다. SNS의 단백질 농도는 micro BCA protein assay kit를 사용하여 결정할 수 있습니다.여기에 6개의 밴드 또는 분획의 예가 있습니다. 마우스 대뇌 피질을 균질화하여 불연속 퍼콜(percoll) 설탕 농도 구배로 분리했을 때, 농축된 SNS는 23%에서 15% 사이의 계면에 위치한 밴드 5에 포함되어 있었으며, 이 밴드를 제거하여 전자 현미경으로 관찰하였습니다. 온전한 시냅스 소포의 예와 시냅스 전 및 후 요소의 보존 상태가 여기 웨스턴 블롯에 나타나 있습니다.불연속 sucrose 구배 원심분리법의 SN 밴드에서 시냅스 마커의 증가와 불순물의 감소는 글루타메이트 첨가 시 S 35 methionine의 통합 증가가 단백질의 de novo 합성에 의한 것임을 확인시켜 줍니다. 단백질 합성 억제제인 40 micromolar anesa mycin을 첨가하였습니다. 이 그림은 글루타메이트의 존재 여부와 관계없이 anso mycin이 있을 때, 기저 수준과 비교하여 S 35 methionine의 통합이 현저히 감소함을 보여줍니다.따라서, 불연속 펄(peral) sucrose 구배법을 이용하면 단백질 번역 연구에 사용할 수 있는 활성이 높고 상대적으로 순수한 SNS를 빠르게 제작할 수 있습니다. 이 그림은 불연속 펄 sucrose 구배의 5번 밴드에서 de novo 단백질 합성이 가장 높은 수준으로 나타남을 보여줍니다. 균질화된 피질을 공극 크기가 점차 감소하는 일련의 필터를 통해 통과시킨 후 불연속 펄 sucrose 구배로 원심분리하여 준비한 SNS는, 비교 대상인 불연속 펄 sucrose 구배법으로 준비한 SNS보다 파손된 막이 더 많이 포함되어 있고 온전한 SNS는 더 적게 포함되어 있습니다. 불연속 펄 sucrose 구배법을 사용하여 준비한 SNS는 여과법을 사용하여 준비한 SNS보다 더 높은 de novo 단백질 합성 활성을 갖는 것으로 나타났습니다.젊은 생쥐에서 준비된 SNS는 고령의 생쥐보다 더 높은 번역 활성을 갖는 것으로 나타났습니다. 이 영상을 시청한 후에는 생쥐의 대뇌 피질을 균질화하고, 스윙 버킷 로터를 사용하여 균질액을 원심분리하며, 고정각 로터에서 퍼콜 sucrose 구배를 통해 상층액을 원심분리한 다음, 결과로 생성된 시냅스 뉴로존 밴드를 수집함으로써 번역 활성 시냅스 뉴로존을 분리하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

preparation-synaptoneurosomes-from-mouse-cortex-using-discontinuous

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 후반 배아와 초기 출생 후의 마우스 피질에서 문화의 연결을 생성하는 절차를 보여줍니다. 이러한 문화가 immunocytochemistry, 생화학, 전기 생리학, 칼슘, 나트륨 이미징에 사용되며 출생 후의 치명적인 유전자 변이를 가지고 유전자 변형 동물의 개발의 연결을 연구하는 플랫폼을 제공하실 수 있습니다.

Dissociated 마우스 두피 신경 세포 배양의 준비

이 동영상은 뇌졸중 연구에서 염증 반응을 연구하기 위해 허혈성 마우스 뇌 조직에서 뇌 세포와 침투한 면역 세포를 효소 분해로 분리한 다음 밀도 구배 원심분리로 세포 파편과 수초를 제거하는 절차를 보여줍니다.

허혈성 마우스 뇌 조직에서 세포 현탁액 얻기

출처 :  Lunelli, L., et. al. 원자력으로 뇌 폴리솜 들여다보기 현미경.J. Vis. 특급.(2016).이 비디오는 원자력 현미경을 사용하여 폴리솜의 이미징을 보여줍니다. 니켈 이온으로 코팅된 운모 시트는 리보솜이 부착된 RNA를 고정합니다. 샘플을 세척하고 건조시켜 현미경 스테이지에 장착합니다. 캔틸레버 팁은 샘플 표면을 스캔하고 레이저 편향을 기록하여 토폴로지를 매핑합니다. 소프트웨어는 왜곡을 수정하고 고해상도 폴리솜 구조를 시각화하는 데 사용됩니다.

 원자력 현미경을 사용하여 마우스 뇌에서 분리된 폴리솜 이미징

이 문서에서는 불연속 자당 기울기에 초 원심 분리에 의해 시냅스 세포막과 관련된 단백질의 농축을 자세히 설명합니다. 시냅스 밀도 단백질의 준비 과정도 설명한다. 단백질 제제는 서쪽 블로 팅 또는 2D DIGE 분석에 적합하다.

불연속 자당 구배를 사용 시냅틱 세포막과 시냅스 밀도 단백질의 제조

리보솜 구조는 광범위하게 규명되었지만 폴리솜의 조직은 여전히 연구가 부족합니다. 이러한 지식 부족을 극복하기 위해 공기 및 액체에서 원자력 현미경(AFM)에 의한 포유류 폴리솜의 정확한 이미징을 위한 자세한 준비 프로토콜을 제시합니다.

원자 힘 현미경과 뇌 Polysom​​es에서 피어링

시냅스 가소성과 기억을 제어하는 분자와 경로를 식별하는 것은 여전히 신경 과학의 주요 과제입니다. 여기에서는 청각 학습 패러다임에서 학습 및 기억 통합 중 시냅스의 분자 재편성에 관여하는 것으로 추정되는 시냅스 단백질의 상대적 정량화를 다루는 워크플로우에 대해 설명합니다.

청각 차별 학습 한 후 마우스 뇌 영역의 높은 해상도 양적 시냅틱 프로테옴 프로파일

여기, 우리는 다른 시냅스 구획에 속하는 단백질을 분리하는 강력한 절차를 나타내는 뇌막 분화 프로토콜을 제시합니다.

뇌막 분획 화 :<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localization 평가 방법

기본 microglia murine 두뇌에서의 격리에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 이 기술은 신경 상황의 현재 이해를 발전에 에이즈. 조밀도 기온 변화도 원심 분리와 자력 분리 매우 순수한 샘플의 충분 한 수확량을 생산 하기 위해 결합 됩니다. 또한, 우리 microglia의 특성에 대 한 단계를 설명합니다.

특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 Microglia의 절연

새로운 두뇌 지구에서 젊은 신경 도전 어떻게 환경 sculpts 신경 운명과 성숙에 중요 한 통찰력을 밝힐 수 있다. 이 프로토콜 interneuron 선구자 특정 두뇌 지역에서 수확 하 고 그들에 게 어느 homotopically를 이식 하는 절차에 설명 합니다 또는 출생 후 새끼의 뇌에 heterotopically.

이른 출생 후 마우스 두뇌로 Interneuron 선구자의 Homochronic 이식

포유류 뇌의 발달은 번역 수준에서 유전자 발현의 적절한 제어를 필요로한다. 여기서는 조립하기 쉬운 자당 그라데이션 및 분획 플랫폼을 갖춘 다각형 프로파일링 시스템을 사용하여 개발 중인 뇌에서 mRNA의 번역 상태를 평가합니다.

다각형 프로파일링을 사용하여 개발 마우스 뇌의 번역 분석

이 프로토콜은 마우스 뇌에서 고순도 시냅토솜, 시냅스 소포 및 기타 시냅스 분획을 얻는 강력하고 상세한 방법을 제시합니다. 이 방법은 단백질 국소화의 생화학적 분석을 포함한 시냅스 과정의 평가 및 구획 분해능을 통한 기능을 가능하게 합니다.

쥐의 뇌로부터 시냅스 성분의 분리를 위한 세포하 분획

배우세요 마우스 대뇌피질에서 불연속 Percoll-자당 밀도 구배를 이용해 번역 활성이 있는 시냅토뉴로솜을 분리하는 방법을. 이 기법은 기계적 손상을 최소화하고 세포 독성을 낮춰 고품질 시냅소솜을 준비합니다.

불연속 Percoll - 자당 밀도 구배를 사용하여 마우스를 접속에서 Synaptoneurosomes의 준비

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