시토크롬를 사용 Mitochondrial 호흡 기능의 시각화 C 데이스 / 호박산 탈수소 효소 (COX / SDH)를 두 번 라벨 Histochemistry

이 절차의 전반적인 목표는 신선 냉동 조직 절편에서 미토콘드리아 호흡 효소 결핍을 직접 시각화할 수 있도록 하는 것입니다. 이는 먼저 관심 기관에서 저온 유지 절편을 수집하여 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 Cox Histo 화학을 수행한 다음 SDH Histo 화학을 수행하는 것입니다.

마지막으로, 조직 부분을 탈수하고 장착하고 덮개를 미끄러뜨립니다. 궁극적으로 결과는 세포 블루 염색의 양을 통해 미토콘드리아 기능 장애의 양을 보여줄 수 있습니다. Hi.Today 우리는 Cox SCH 이중 라벨링 조직 화학 기술에 대해 이야기 할 것입니다.

이 방법은 미토콘드리아 질환을 연구하는 데 적용할 수 있지만 노화 및 노화 관련 장애에 대한 통찰력을 제공할 수도 있습니다. 윤리적 허가에 따라 희생된 동물의 뇌를 적출한 후, 드라이아이스에 급히 얼린다. 냉동 조직은 섭씨 영하 80도에서 절단할 준비가 될 때까지 알루미늄 호일로 싸서 보관할 수 있습니다.

뇌를 저온 유지 장치 척에 놓고 임베딩 컴파운드로 둘러싸서 동결 절편을 위한 조직을 준비합니다. 척을 저온 유지 장치에 빠르게 넣고 섭씨 영하 21도에서 14미크론 단면을 수집합니다. 가열 블록을 사용하여 슬라이드에 섹션을 해동한 다음 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 건조시킵니다.

젖은 종이 스트립이 있는 슬라이드 염색 챔버에 슬라이드를 놓습니다. 이 분석에서는 반응 시간이 중요하기 때문에 화학 후드 아래에서 실험당 최대 10개의 슬라이드를 처리하는 것이 좋습니다. PBS 및 와류에서 소량과 사이토크롬 C를 포함하는 배지인 배양을 준비합니다.

배지에 2마이크로그램의 소 CDE를 빠르게 첨가하고 볼텍싱으로 잘 혼합합니다. 후드 아래에서 여전히 작동 중인 CDE의 모든 입자를 분해하려면 피펫 팁을 사용하여 각 슬라이드에 150-200마이크로리터의 배양 배지를 적용하여 모든 섹션에 고르게 펴 바릅니다. 슬라이드를 섭씨 37도에서 40분 동안 배양합니다.

40분 후 슬라이드에서 배양 배지를 제거합니다. PBS에서 매번 10분 동안 슬라이드를 4번 세척합니다. 슬라이드를 세척한 후 화학 물질 후드 아래에서 작동하는 젖은 종이 스트립을 사용하여 슬라이드 염색 챔버에 다시 넣습니다.

PBS에서 NBT 용액을 준비하고, 광 소용돌이로부터 PMS를 보호하기 위해 주의하면서, 이 용액은 피펫 팁을 사용하여 모든 섹션에 고르게 펴 바르도록 각 슬라이드에 150-200마이크로리터의 NBT 용액을 빠르게 도포합니다. 40분 후 섭씨 37도에서 40분 동안 슬라이드를 배양하고 슬라이드에서 과도한 용액을 제거합니다. PBS에서 매번 10분 동안 슬라이드를 4번 세척합니다.

다음과 같은 순차적인 농도의 에탄올로 슬라이드를 각각 2분 동안 탈수합니다. 70%70%95%95%95% 및 99.5%마지막으로 추가로 99.5% 단계로 10분 동안 허용합니다. 슬라이드를 자일렌에 10분 동안 놓고 LAN으로 장착하고 커버 슬립을 적용합니다.

슬라이드를 밤새 말리거나 환기가 잘 되는 곳에서 최소 1-2시간 동안 말리십시오. 야생형과 조기 노화의 뇌 절편. 마운트. DNA 돌연변이 마우스는 COX 및 SDH 활성에 대해 순차적으로 표지되었습니다.

짙은 갈색 염색으로 나타나는 정상적인 콕스 활성은 야생형 마우스의 해마에서 볼 수 있습니다. 파란색 염색으로 표시된 콕스 결핍은 12주와 46주에 MT DNA 돌연변이 마우스의 해마에서 밝혀졌습니다. M-T-D-N-A 돌연변이 마우스에서 생후 46주까지 콕스 활성이 더욱 감소했는데, 이는 호흡기 사슬 기능 장애의 광범위한 악화를 시사합니다.

10분 및 25분의 부적절한 배양 시간으로 인해 갈색 소량 반응 생성물의 침착이 감소했습니다. 단축된 배양 시간은 SDH 배양 중에 blue Foran 최종 산물의 형성을 허용했으며, 이는 COX 결핍 커버 슬립이 있는 세포의 존재를 오도하게 암시합니다. COX 배양 중 슬라이드는 또한 DAB 반응 생성물의 부정확한 형성 및 증착을 초래했습니다.

Cox 및 SDH 활성은 여기에 표시된 것처럼 개별적으로 라벨링할 수 있지만, 순차적 라벨링은 미토콘드리아 기능 장애가 있는 세포를 찾는 데 유리한 것으로 입증되었습니다. 야생형 마우스의 뇌에서 COX 및 SDH 활동에 대한 특이성 제어의 예는 음성 라벨링을 보여줍니다. 따라서 Cox SCH 이중 라벨링의 화학 물질로 작업하는 것은 화학 프로토콜이 매우 위험하며 적절한 실험실 복장을 착용하고 화학 물질 후드 아래에서 작동하는 마스크와 같은 예방 조치와 같은 예방 조치를 취하고 배양 배지를 폐기하는 등의 예방 조치는이 분석을 수행 할 때마다 수행해야합니다.