고립 된 미토콘드리아의 유동 세포 계측법에 의해 외부 막 단백질의 면역

이 절차의 가장 중요한 목표는 ER 미토콘드리아 막에서 관심 단백질을 선택한 항체로 면역 라벨링하고 미토콘드리아 기능과 동시에 분석하는 것입니다. 이것은 먼저 쥐에서 뇌, 척수 또는 간과 같은 관심 조직을 수집하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 미토콘드리아를 조직, 이 경우 척수에서 분리하는 것입니다.

척수는 춤으로 균질화됩니다. 균질화 장치 및 기타 세포 기관 및 세포일 파편은 미토콘드리아와 12% opti prep 및 원심 융합 용액을 혼합하여 중추 신경 조직의 주요 오염 물질인 미엘린이 제거될 때까지 일련의 원심분리 단계를 통해 제거됩니다. 다음으로, 분리된 미토콘드리아는 선택한 1차 항체로 표지된 후 Fluor에 접합된 2차 항체로 표지됩니다.

마지막 단계는 형광 염료를 첨가하여 미토콘드리아 정체성 또는 기능적 매개변수를 확인하는 것입니다. 궁극적으로, 유세포 분석은 정상적인 생리학 또는 질병 전반에 걸쳐 미토콘드리아 알토막의 상대적 풍부함을 보여주는 데 사용됩니다. 현미경 검사와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 수천 개의 개별 미토콘드리아에 대한 높은 처리량과 빠른 정량화가 가능하다는 것입니다.

이 연구에 사용된 동물은 캐나다 동물 보호 위원회(Canadian Council on Animal Care Air)에서 설명한 국가 표준을 따르는 동물 보호를 위한 C-R-C-H-U-M 기관 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 엄격하게 처리되었습니다. 이 절차를 시작하려면 쥐에서 채취한 온전한 척수 전체를 5가지 부피의 균질화 완충액이 들어 있는 5밀리리터 유리 균질기에 넣습니다. 유리 균질화기를 얼음 위에 놓고 더 큰 조직 조각이 남지 않을 때까지 손으로 조직을 균질화하면 약 8번의 스트로크가 필요합니다.

균질액을 2개 또는 3개의 마이크로 원심분리기 튜브에 옮기고 섭씨 4도에서 10분 동안 1, 300회 G에서 원심분리한 다음 S 피펫을 5밀리리터 초원심분리기 튜브에 넣습니다. 펠릿에 750마이크로리터의 균질화 완충액을 추가하고 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 그런 다음 현탁액을 원심 분리하고 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

두 번 더 반복하여 작은 파편을 제거하고 모든 상층액을 동일한 5mm 초원심분리기 튜브에 당긴 다음 튜브를 초원심분리기 로터에 넣습니다. 그네 물통 장비해, 17, 4 섭씨 온도의 15 분 동안 000 시간 G에 관을 원심분리기. 원심분리가 완료되면 세포질 분획이 관심 있는 경우 추가 처리를 위해 상등액을 저장합니다.

다음으로, resus는 50 밀리몰 염화칼륨 원심 분리기를 포함하는 4 밀리리터의 균질화 완충액에 있는 조잡한 미토콘드리아 분획인 펠릿을 현탁시킵니다. 스윙 버킷 로터에서 섭씨 4도에서 15분 동안 17, 000배 G에서 재현탁된 펠릿을 재부유시킨 다음 supinate를 버리고 정확히 800마이크로리터의 현탁액에서 새로운 5밀리리터 초원심분리기 튜브의 800마이크로리터의 균질화 완충액에 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 다음으로 200마이크로리터의 iod dal을 재현탁된 펠릿 800마이크로리터에 피펫팅하여 12%iod Dal의 최종 농도를 생성합니다.

튜브의 내용물을 P 1000 피펫으로 부드럽지만 철저하게 혼합한 다음 스윙 버킷 로터에서 섭씨 4도에서 15분 동안 17, 000배 G로 원심분리하고 튜브 상단의 수초층을 흡인하고 팔레트가 헐거워질 수 있으므로 초피네이트를 조심스럽게 폐기합니다. Resus는 펠릿을 4ml의 균질화 완충액에 현탁시킵니다. 다음 17, 000 시간 G에 그네를 진동하는 물통 회전자에 있는 4 섭씨 온도에 15 분 동안 당신의 이익을 원심 분리하십시오.

supinate를 버리고 다시 사용하십시오. 펠릿을 4ml의 균질화 완충액에 현탁시킵니다. 그런 다음 원심분리를 다시 반복하고 앙와위 제인 reus를 제거합니다.

100-200마이크로리터의 균질화 완충액에서 최종 펠릿을 구부리고 1.7ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 바이오닉산 분석 또는 BCA와 같은 표준 단백질 정량 분석을 사용하여 각 샘플의 단백질 양을 측정합니다. 정량 분석을 위해 샘플을 준비할 때 샘플과 표준 곡선을 2%sodium sulfate로 희석하여 미토콘드리아의 적절한 가용화를 보장합니다.

테스트할 각 염색 혼합물에 대해 25마이크로그램의 분리된 미토콘드리아를 1.7ml 마이크로 센트리 튜브에 피펫팅합니다. 각 실험에 염색되지 않은 샘플과 각 항체 테스트 원심분리기에 대한 적절한 동형 대조군을 포함시켜야 하며, 벤치탑 마이크로 원심분리기에서 섭씨 4도에서 2분 동안 각 샘플을 17, 000배 G로 원심분리기합니다. 그런 다음 supinate를 제거하고 분리된 미토콘드리아를 50마이크로리터의 미토콘드리아 완충액에 재현탁시킵니다.

10% 지방산이 없는 BSA가 보충되어 섭씨 4도에서 15분 동안 용액을 배양한 다음 용액 1밀리리터당 1차 항체 20마이크로그램을 추가합니다. 분리된 미토콘드리아를 1차 항체와 함께 섭씨 4도에서 30분 동안 배양하여 결합되지 않은 항체를 씻어내고 각 샘플을 원심분리한 다음 앙와위 natant를 버립니다. 다음으로, 펠릿을 200마이크로리터의 미토콘드리아 완충액에 부드럽게 재현탁시킨 다음 원심분리 단계를 반복하고 앙와위 natant를 버리고 펠릿을 50마이크로리터의 미토콘드리아 완충액에 재현탁합니다.

샘플 1ml당 0.5마이크로그램의 2차 항체를 추가합니다. 그런 다음 빛을 차단한 상태에서 섭씨 4도에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 배양이 완료되면 각 샘플을 원심분리하고 결합되지 않은 2차 항체가 포함된 supinate를 폐기합니다. 리스.

펠릿을 200마이크로리터의 미토콘드리아 완충액에 현탁시키고 샘플을 원심분리합니다. 다시. 그런 다음 supinate와 Reese를 제거합니다. 관찰된 이벤트가 실제로 미토콘드리아인지 확인하기 위해 500마이크로리터의 미토콘드리아 완충액에 펠릿을 현탁시킵니다.

in Vitrogen의 MIT tracker green과 같은 미토콘드리아 특이적 형광 염료로 샘플을 어두운 곳에서 15분 동안 염색합니다. 다른 기능 파라미터를 조사하기 위해 더 이상의 염색이 필요하지 않은 경우, 라벨링된 샘플을 유세포 분석기에 적재하기에 적합한 튜브로 옮깁니다. 샘플을 얼음 위에 보관하고 수집을 위해 유세포 분석기로 진행하여 분리된 미토콘드리아가 온전한 막관통 전위를 가지고 있는지 확인하고 테트라에틸 막대 도민으로 염색하기 위한 대조군으로 실온에서 15분 동안 실온에서 15분 동안 테트라에틸 막대 도민 메틸 에스테르

메틸 에스테르는 100 마이크로 몰 카르 보닐 시안화물 m 클로로 페놀 HydroOne의 존재하에 100 나노 몰 테트라 에틸 막대 도민 메틸 에스테르로 분리 된 미토콘드리아를 염색합니다. 이 화학 물질은 미토콘드리아 분리이며 미토콘드리아를 탈분극하여 분리된 미토콘드리아가 미토콘드리아 과산화물 생성을 위한 제어로 실온에서 15분 동안 시험체에서 붉은색 미토시스와 같은 적절한 과산화물 지시자로 미토콘드리아를 염색하는지 확인합니다. 10 마이크로몰 항마이신이 있는 상태에서 염료가 함유된 격리된 미토콘드리아에 머무릅니다.

항마이신 A는 호흡 사슬의 복합체 3을 억제하는 물질이며 획득이 시작되기 전에 미토콘드리아 과산화물 생성을 증가시킵니다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 기기를 설정합니다. 그런 다음 튜브를 부드럽게 두드려 샘플을 혼합하되 소용돌이치지 마십시오.

게이팅 중에 낮은 압력에서 초기 이벤트 수집을 시작합니다. 총 인구에 대한 게이트를 확인하십시오. 그런 다음 히스토그램의 전압을 적절하게 조정합니다.

염색되지 않은 샘플의 피크는 일반적으로 두 번째 10 년에 해당합니다. 그런 다음 게이트가 설정되고 샘플이 처리되면 압력을 고유량 세포 분석으로 전환합니다. 척수 제제를 분석한 결과, 94%의 사례가 미토콘드리아 특이적 염료에 대해 양성인 것으로 확인되었습니다.

이 실험에서 미토콘드리아 양성 반응의 30%는 미토콘드리아의 외막 융합과 관련된 단백질인 MIT 융합 2에 특이적인 항체로 표지되었습니다. 테트라에틸 루민 메틸 에스테르를 사용하여 미토콘드리아 막횡단 전위를 분석한 결과, 분리된 미토콘드리아의 95%가 온전한 막횡단 전위를 가지고 있는 것으로 나타났습니다. 이 염색은 미토콘드리아 unco functional 미토콘드리아의 존재 하에서 수행되었을 때 염색의 현저한 감소가 관찰됨에 따라 특이적인 것으로 나타났으며, 막 투과성 염료를 사용하여 측정한 바와 같이 기저량의 SUP 산화물을 생성하는 것으로 밝혀졌습니다.

그것은 SUP 산화물과 형광 P 반응이 됩니다. 미토콘드리아를 항마이신 a로 처리하면 과산화물 생산이 약 10% 증가합니다. 이 기술은 적절하게 수행되면 6-7 시간 안에 완료 할 수 있습니다.