Name: 고립 된 미토콘드리아의 유동 세포 계측법에 의해 외부 막 단백질의 면역 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 학습하세요 쥐 척수에서 미토콘드리아를 분리하고 외막 단백질을 면역표지하는 방법을. 유동세포계측법으로 기능 분석을 동시에 수행하여 신경퇴행성 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 흐름 cytometer에 액세스 로리 Destroismaisons과 뛰어난 기술 지원을 사라 Peyrard 및 Dr.Alexandre 프라 감사합니다. 우리는 또한 준비에서 수초의 제거에 대한 그의 기여에 대한 박사 티모시 밀러를 인정하고 싶습니다. 이 작품은 건강 연구 (CIHR) 신경 근육 학 연구 파트너십, 혁신에 대한 캐나다 재단, 캐나다의 ALS 협회, ALS 연구를위한 프릭 재단, 미끼 재단과 퐁 드 라 공들인 엉 상테 퀘벡 (CVV)의 캐나다 연구소에 의해 지원되었다. 두 CVV 및 NA는 연구 학자 퐁 드 라 공들인 엉 상테 퀘벡 및 CIHR 새로운 수사. SP 캐나다의 ALS 협회에서 팀 노엘 재학 지원됩니다.

본 연구에 사용 된 동물은 캐나다에 의해 설명 된대로 국가 표준을 다음과 동물의 보호를위한 센터 드 공들인 뒤 센터 Hospitalier 드 난 4 대학 몬트리올 (CRCHUM) 기관위원회의 승인 프로토콜 (N08001CVsr)에 따라 엄격하게 처리하여, 동물 관리 협의회 (CCAC). 이 프로토콜 (표 1)을 수행하는 데 필요한 모든 시약을 준비합니다. 장비, 소모품 및 공급 업체에 대한 다른 모든 세부 사항은 재료의 목록에서 찾을 수 있습니다. <img alt="표 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51887/51887table1.jpg" width="500"> 표 1 버퍼 조성물은. 쥐 척수의 1 컬렉션 <ol><li> 깊이 4 % isoflorane와 쥐 (스프 라그)를 마취시키다. 일의 곤란에 반사의 부족에 의해 진통제를 확인전자 앞발. 단두대를 통해 잘린 쥐를 안락사. 안락사이 방법은 척수 왜곡이있는 다른 사람들보다 더 선호된다. </li><li> 척추를 노출 뒤의 피부를 잘라. 다만 골반 뼈 위의 뼈 가위로 척추를 잘라. 척주의 개통을 시각화. </li><li> 척추에, 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)로 채워진 200 μL 피펫 팁 (불꽃을 통해 약간 녹는 통해 부착)로, 10 ML의 주사기를 삽입합니다. </li><li> 플런저 압력의 매체 량을 적용하여 척수 세척. </li><li> 모든 혈액 척수에 존재하는 경우, 다음 단계로 진행하기 전에 PBS로 헹군다. 참고 :이 방법은 또한 뇌와 간을 위해 검증되었습니다. 이러한 조직을 포함하는 경우, 절반 안락사 래트에서 뇌 및 척수에서 동일 간 중량의 조각을 모은다. 다른 모든 단계는 동일 남아있다. </li></ol> 척수에 Mit의 2 절연ochondria (반데 Velde 외 각색. 4) <ol><li> 5 볼륨 (~ 3.25 ml)에 균질화 버퍼 (HB) 5 ㎖의 유리 균질의 전체 손상 척수과 장소를 수집합니다. 격리 된 미토콘드리아의 최적의 복구의 경우, 얼음 또는 차가운 방에서 모든 단계를 수행합니다. 조직의 더 큰 조각이 남아 있지 않을 때까지 손으로 약 8 스트로크를 조직을 균질화. 둘 (2 ㎖) 또는 셋 (1.7 ml)에 마이크로 원심 튜브에 균질를 놓습니다. 벤치 탑 마이크로 원심에서 4 ° C에서 10 분 동안 원심 분리기 1300 XG. </li><li> 5 ML의 초 원심 분리기 튜브에 상층 액과 장소를 복구 할 수 있습니다. 펠릿 함유 microcentrifuge 관에 750 μL (~ 0.5 권) HB를 추가하고 부드럽게 펠렛을 재현 탁. 원심 분리를 반복하고 재 부상은 두 번 더 반복합니다. 위의 수영장 같은 5 ML의 초원 심 분리기 튜브에 모든 상층 액 (S1A 및 S1B). 이 단계는 작은 파편을 제거하는 역할을한다. </li><li> 원심 분리기는 S1이 스윙 버킷 부패가 장착 된 초 원심 분리기를 사용하여 풀링또는 4 ° C에서 15 분 동안 17,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 세포질 분획 (웨스턴 블롯 분석을위한 예를 들어) 관심사 인 경우 추가 처리를 위해 상등액 (S2)를 유지한다. 4 ML의 HB + 50 mM의 KCl을 펠릿에 (P2), 조 미토콘드리아 분획을 재현 탁. 스윙 버킷 로터에서 4 ° C에서 15 분 동안 원심 분리기 17,000 XG. 뜨는을 취소하고 부드럽게 800 μL의 HB에서 펠렛 (P3)을 재현 탁. NOTE : 미토콘드리아 어떤 비특이적 미토콘드리아 관련 오염 물질을 제거하기 위해 HB + 50 mM의 KCl을로 세정된다. </li><li> 새로운 5 ㎖의 초 원심 분리기 튜브에서 재 부유 펠렛 (P3)의 정확히 800 μl를 추가합니다. </li><li> 이에 의해이 튜브에 12 % Iodixanol의 최종 농도를 만들어, Iodixanol (밀도 구배 배지) 200 μl를 추가한다. 온화하지만, 철저 P1000 피펫을 통해 함께 튜브의 내용물을 혼합한다. 제 Iodixanol 첨가하고 재현 탁 펠릿 (P3)의 철저한 혼합을 촉진하는 것이 바람직 할 수있다. ULT에서 원심 분리기4 ° C에서 15 분 동안 17,000 XG에서 스윙 버킷 로터가 장착 racentrifuge. </li><li> NOTE : 간이 미엘린을 제공하지 않으며, 단지 간 처리되는 경우에는, 따라서이 단계는 필요하지 않다. CNS 간 미토콘드리아와 동시에 처리되는 경우, 그것은 동일하게 모든 조직을 치료하는 것을 권장한다. </li><li> 튜브의 상단에 미엘린의 레이어를 대기음 조심스럽게 제거하고 상층 액을 버린다. 펠렛이 느슨 할 수 있습니다. 4 ML의 HB에서 펠렛을 재현 탁. 원심 분리기 다시 4 ℃에서 10 분 동안 17,000 XG에. 뜨는을 취소하고 4 ML의 HB에서 펠렛을 재현 탁. 원심 분리를 반복하여 상층 액을 제거합니다. </li><li> 100 ~ 200 μL의 HB에 최종 펠릿 (P7)을 재현 탁하고, 1.7 ml의 microcentrifuge 관에 전송합니다. 이 샘플은 격리 된 미토콘드리아가 포함되어 있습니다. </li><li> 단백질 정량 진행합니다. 미토콘드리아 두리의 충분한 용해를 보장하기 위해 샘플 및 2 % 도데 실 황산나트륨 (SDS)의 표준 곡선을 희석NG 단백질 정량. </li></ol> 유동 세포 계측법에 대 한 격리 된 미토콘드리아의 3 Immunolabeling <ol><li> 각 염색 믹스를 테스트하기 위해서는, 피펫 1.7 ML microcentrifuge 관에 고립 된 미토콘드리아의 25 μg. 각 실험에서 흠없는 샘플을 포함; 각 항체에 대한 적절한 이소 타입 제어를위한 샘플을 포함해야합니다. </li><li> 벤치 탑 마이크로 원심에서 4 ° C에서 2 분 동안 17,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 제거하고 4 ° C (차단 단계)에서 15 분 동안 10 % 지방산 무료 BSA와 보충 50 ㎕의 미토콘드리아 버퍼 (M 버퍼)에 격리 된 미토콘드리아를 재현 탁. 참고 : 라벨 동안 4 ° C에서 냉장고에 인큐베이션을 수행합니다. </li><li> 튜브에 차 항체 (토끼 항 Mfn2, ML 당 20 μg)을 추가하고 4 ℃에서 30 분 동안 배양한다. 참고 : 적정에 의해 경험적으로 각 항체의 최적 농도를 결정합니다. 집중력 및 / 또는 P의 변동urity, 동일한 제조업체의 같은 항체의 다른 많은 다른 결과가 발생할 수 있습니다; 따라서 적정 항체의 새 많이 필요합니다. </li><li> 언 바운드 차 항체를 씻어 : 원심 분리기를 17,000 XG에서 2 분 동안 4 ° C에서. 상층 액을 제거하고 부드럽게 200 μL M 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 4 ° C에서 2 분 동안 17,000 XG에 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 50 ㎕의 M 버퍼에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 튜브에 차 항체 (당나귀 항 - 토끼 IgG의 피코 에리 트린 (PE) ML 당 0.5 μg)을 추가하고 빛으로부터 보호 4 ° C에서 30 분, 위해 샘플을 배양한다. </li><li> 언 바운드 차 항체를 씻어 : 원심 분리기를 17,000 XG에서 2 분 동안 4 ° C에서. 상층 액을 제거하고 200 ㎕의 M 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 4 ° C에서 2 분 동안 17,000 XG에 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 500 ㎕의 M 버퍼에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 이벤트가 사실 미토콘드리아에있는 보장하기 위해,와 얼룩 고립 미토콘드리아빛으로부터 보호 RT에서 15 분 동안 미토콘드리아 특정 형광 염료. 다른 기능 매개 변수 (미토콘드리아 막 횡단 전위 또는 슈퍼 옥사이드 생산)의 염색이 필요한 경우가 아닌 경우, 수집을 위해 5 단계로 진행 4 단계로 진행합니다. 참고 :이 차 항체의 발광 스펙트럼은 기능 염료의와 호환되는지 확인하는 것이 중요합니다. (: 예 650 내지 / 엠 660 nm의 APC)를 예를 들어, 테트라 메틸 메틸 에스테르 (TMRM)와 FITC 및 횡단 전위 유사한 스펙트럼 특성을 갖는 상용 염료 미토콘드리아 순도를 확인하는 경우, 가능한 이차 항체 알로 피코된다. 보상 컨트롤을 추가, 즉, 샘플 immunolabeled 또는 적용 할 때 하나의 형광 물질로 염색. </li><li> 사이토로드 흐름에 적합한 튜브에 전송합니다. (. 작은 샘플 크기, 미세 적정 튜브 ML 튜브의 유동 세포 계측기 (3) 내부에 배치를 용이하게하기 위해) 얼음에 샘플을 유지하고 즉시 진행취득 흐름 cytometer. </li></ol> 4 시금 미토콘드리아 막 횡단 잠재력 및 유동 세포 계측법에 의해 미토콘드리아 과산화물 생산 <ol><li> 격리 된 미토콘드리아가 빛으로부터 보호 실온에서 15 분, 대한, 단계 3.8에서, 100 nm의 TMRM (예 548 nm의 / 엠 574 nm의) 오 염색하여 그대로 횡단 잠재력을 가지고 있는지 확인합니다. 샘플 및 인구, TMRM (1-30 nm의)의 상 / 비 담금질 농도의 사용 사이 횡단 잠재력의 비교를 위해, 6 더 적합 할 수있다. <ol><li> TMRM 염색법, 100 μM 카르 보닐 시아 나이드 m-클로로 페닐 하이드라진 (CCCP)의 존재하에 100 nM의 TMRM 가진 얼룩 절연 미토콘드리아 미토콘드리아 탈분극 것이다 미토콘드리아 uncoupler 대 대조군. 낮은 농도의 염료가 사용되는 경우 미토콘드리아 탈분극 필요 CCCP의 농도는 작을 수있다. </li></ol></li><li> 격리 된 미토콘드리아가 성하여 미토콘드리아 과산화물을 생성되었는지 확인빛으로부터 보호 RT에서 15 분에 대해, 또한 단계 3.8에서, 적합한 미토콘드리아 과산화물 표시기 7 aining. <ol><li> 미토콘드리아 수퍼 옥사이드 생산, 10 μM Antimycin A, 미토콘드리아 수퍼 옥사이드 생성을 보강한다 호흡 연쇄의 복합체 III의 억제제의 존재 하에서 염료 얼룩 절연 미토콘드리아 대 대조군. </li></ol></li></ol> 유동 세포 계측법에 의해 미토콘드리아를 고립 Immunolabeled의 5 수집 및 분석 <ol><li> 악기 설정 : 선형에서 스위치 전압 절연 미토콘드리아 및 설정 전압의 분석을 용이하게하기 위해 모드를 기록 (FSC : 450, SSC : 250). 이벤트가 FSC-A (영역) 모드뿐만 아니라 FSC-W (폭) 및 FSC-H (높이)에 수집되어 있는지 확인, 이중선을 (배제 할 수 있어야합니다 즉, 같은 시간에 검출기를 통과하는 두 개의 이벤트, ) 분석 후 데이터 수집. 이벤트의 설정 번호는 100000로 수집합니다. 보상 컨트롤 획득(해당되는 경우). </li><li> 데이터 수집 : 데이터 수집하기 전에 샘플을 텍싱 마십시오. 대신에 부드럽게 튜브를 활용하여 혼합한다. 처음 게이팅하는 동안, 낮은 압력에서 이벤트를 수집. 전체 인구에 문입니다. 이에 따라 히스토그램의 전압을 조정 일반적으로 흠없는 샘플의 피크는 두 번째 10 년 (10 두)에 해당됩니다. 게이트가 확립되고, 샘플이 처리되고 나면, 높은 압력으로 전환 할 수있다. </li><li> 분석 : FSC-W FSC 대 플롯에 의해 이중선을 시각화. 단봉과 이중선을 확인합니다. 단봉에 문입니다. 미토콘드리아 선택적 염료 긍정적으로 염색 이벤트에 게이팅에 의해 미토콘드리아 인구를 선택합니다. </li><li> 이소 타입 컨트롤에서 배경 표시를 확인합니다. 이소 제어 샘플을 사용 Mfn2 항체 양성 미토콘드리아 인구 라벨의 비율을 결정합니다. </li></ol>

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</ol>

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이는 미토콘드리아가 정상적인 생리와 질병 모두에서 핵심 선수임을 점점 더 분명하다. 면역 블로는 특정 조건에서 미토콘드리아 내에서 또는 미토콘드리아 표면에 전체 인구의 평균이 방법 보고서를 발견되는 단백질을 확인할 수있다. 이 방법은 미토콘드리아 개체군 또는 부분 집합의 상대적 농도에 대한 정보를 얻을 수 없습니다. 이 왔지만 이전에 모든 미토콘드리아가 동등하게 필드가 점점 세포 내 미토콘드리아 인식되어 만든 형태 및 / 또는 기능 (10)의 측면에서 광범위한 변화를하고 있다고 가정. 형광 현미경의 접근 방식이 계정에 미토콘드리아의 이질성을 않습니다. 그러나, 이러한 유형의 데이터의 정량화는 노동 집약적이다. 또한,이 접근법은 / 반응계에서 기인 exces하기 어려운 생체 내 미토콘드리아의 표지로서, 배양 된 세포를 사용하는 연구에 더 적합현재 미토콘드리아의 시브 수, 개별 세포 기관의 분화가 본질적으로 어렵게 만든다. 대부...

미토콘드리아는 높은 에너지 수요의 사이트로 이송 및 생리 학적 자극 하나에 빠르게 반응하는 핵분열 및 융합의 여러 라운드를 거쳐 매우 동적 인 세포 소기관이다. 그것이 점점 다른 조직에서 미토콘드리아를 인식하고 있기 때문에, 심지어 다른 세포 구획, 새로운 방법은 이러한 고유 한 미토콘드리아의 하위 집합을 식별하는 데 필요한 별개의 기능 프로파일을 가지고있다. 현미경 개별 미토콘드리아가 가시화 될 수있다 수단 및이 면역에 의해 결정될 수있다이나 미토콘드리아에서 단백질의 존재를 제공한다. 그러나,이 방법에 의해 정량 분석​​은 노동 집약적이고, 일차 또는 무한 증식 세포주를 이용한 실험에 더 적합하다. 조직에서 파생 된 개별 미토콘드리아의 연구는 훨씬 더 어렵고 대부분의 방법은 evalu과 동시에 미토콘드리아 부분 집합을 쉽게 식별 할 수 있도록하지 않습니다미토콘드리아 기능 3의 ation. 이 장애물, 유동 세포 계측법에 의해 짐승 조직으로부터 분리 및 후속 분석 미토콘드리아 immunolabel하는 신규 한 방법을 해결하기 위해 개발되었다. 이는 신속한 검출 및 현미경으로 분석하여 비교 미토콘드리아 외막으로 지역화 단백질의 정량화를 허용 훨씬 덜 노동 집약적이고, 단일 샘플에서 미토콘드리아의 수천의 분석을 허용한다. 이 분석은 미토콘드리아에서 항시 존재하는 것으로 생각되는 미토콘드리아 외막 단백질의 거동 및 상대적인 양을 모니터에 적용 할 수있는, 미토콘드리아 표면 단백질의 채용, 또는 병리학 적 조건의 미토콘드리아에 mislocalized 단백질의 검출. 또한, 종래의 형광 인디케이터 염료의 혼입은 별개의 미토콘드리아에서 미토콘드리아 기능의 특정 측면의 동시 평가를 가능하게소집단.

<table><tbody><tr><td>쥐</td><td>Charles River</td><td>Strain code 400</td><td>성체(9주에서 18주) 수컷 또는 암컷 쥐를 격리 프로토콜에 사용할 수 있습니다. 쥐의 체중은 성별과 연령에 따라 다르며 일반적으로 (수컷은 300-500g, 암컷은 200-350g)이 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Dounce 균질화 업체</td><td>Kontes Glass Co.&nbsp;</td><td>885450-0022</td><td>Duall 22</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Sorvall Legend Micro 17 R</td></tr><tr><td>Ultra-Clear 초원심분리기 튜브</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td>투명하고 얇은 벽&nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall 초원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Sorvall WX UltraSeries</td></tr><tr><td>AH-650 로터 및 버킷&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-prep</td><td>Axis-Shield</td><td>1114542</td><td>Iodixanol, 밀도 그라데이션 매체</td></tr><tr><td>지방산 무료 소 세럼 알부민</td><td>시그마</td><td>A8806</td><td>미토콘드리아를 위해 지방산이 없어야 함</td></tr><tr><td>나트륨 숙신산 이염기성 육수화물&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9637</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-Mitofusin2 항체</td><td>Sigma</td><td>M6319</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno Research&nbsp;</td><td>011-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4739-81</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 역가 튜브</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9391</td><td>유세포 분석에 의한 샘플 수집용&nbsp;</td></tr><tr><td>MitoTrackerGreen (MTG)</td><td>Invitrogen</td><td>M7514</td><td>100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm</td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Invitrogen</td><td>T668</td><td>100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm</td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX Red</td><td>Invitrogen</td><td>M36008</td><td>5 &micro; M: Ex 540 nm/Em 600 nm</td></tr><tr><td>안티마이신 A</td><td>시그마</td><td>A8874</td><td></td></tr><tr><td>LSR II 유세포 분석기</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva 소프트웨어</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>TreeStar Inc.&nbsp;</td><td></td> BCA 단백질 분석 키트<td>를 분석하는 데 사용되는 소프트웨어</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Pierce/Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Bradford 분석은 고농도의 SDS와 호환되지 않으므로 권장하지 않습니다.</td></tr></tbody></table>

고립 된 미토콘드리아의 유동 세포 계측법에 의해 외부 막 단백질의 면역

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

방법은 검색과 동물의 조직은 미토콘드리아 생리학 및 병태 생리를 연구하는 필수적인 미토콘드리아 외막 단백질 구성 요소를 모니터링 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 쥐의 조직에서 분리 된 미토콘드리아가 immunolabeled 및 유동 세포 계측법에 의해 분석하는 기술에 대해 설명합니다. 미토콘드리아는 설치류 척수로부터 단리 미엘린, 신경 조직으로부터 제조 미토콘드리아 분획의 주요 오염 물질을 제거하기 위하여 빠른 농축 공정을 실시한다. 고립 된 미토콘드리아는 다음 선택의 항체와 형광 접합 된 이차 항체로 표시되어 있습니다. 유동 세포 계측법에 의한 분석은 검출 및 immunolabeled 단백질의 정량 하였다 미토콘드리아 특정 염료로 염색하여 미토콘드리아 제제의 상대적 순도를 검증한다. 이러한 기술은 샘플 당 미토콘드리아 수십만의 분석을 허용 급속한 정량화 및 높은 처리량이다. 이 소설의 페이지를 평가에 적용 할 수있다정상적인 생리적 조건하에 미토콘드리아 표면 roteins뿐 아니라 병리 과정이 소기관에 mislocalized 될 수 단백질. 중요한 것은,이 방법은 미토콘드리아 개체군의 특정 활동에 대한보고를 형광 표시 염료에 결합 및 중추 신경계 (뇌와 척수)뿐만 아니라 간에서 미토콘드리아에 대한 가능하다 할 수있다.

래트 척수 유래의 미토콘드리아는 Mitofusin2 (Mfn2), (8)의 미토콘드리아 외막의 융합에 관여 단백질에 표적 항체 immunolabeled 수있다. Mfn2 특정 항체와 형광 접합 된 이차 항체 분리 및 라벨에 따라, 미토콘드리아는 유동 세포 계측법 (그림 1)에 의해 처리된다. 데이터 수집 후, 샘플은 제 도트 플롯 (도 2A)에 수집 된 모든 이벤트를 가시화하여 분석 소프트웨어를 이용하여 유세포 분석된다. 이벤트가 FSC, 폭 (W) 대 영역 (A) (그림 2B)에서 플롯 할 때 이중선과 단봉는 차별화된다. 단일체가 FSC / SSC (그림 2C)을 통해 게이트에게 미토콘드리아 인구 선택에 의해 미토콘드리아 특정 염료에 대한 긍정적 인 염색 이벤트의 수 확인되면 미토콘드리아-SPE 물들 샘플 흠 샘플의 히스토그램을 공동 - 플로팅cific 염료. 미토콘드리아 이벤트를 확인...

여기서 설명하는 것은 감지하고 유세포 짐승 조직으로부터 분리 및 분석 미토콘드리아 immunolabeling 의해 미토콘드리아 외막 단백질을 정량하는 방법이다. 이 방법은 미토콘드리아 개체군의 기능적 측면을 평가하기 위해 확장 될 수있다.

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

이 절차의 가장 중요한 목표는 ER 미토콘드리아 막에서 관심 단백질을 선택한 항체로 면역 라벨링하고 미토콘드리아 기능과 동시에 분석하는 것입니다. 이것은 먼저 쥐에서 뇌, 척수 또는 간과 같은 관심 조직을 수집하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 미토콘드리아를 조직, 이 경우 척수에서 분리하는 것입니다.척수는 춤으로 균질화됩니다. 균질화 장치 및 기타 세포 기관 및 세포일 파편은 미토콘드리아와 12% opti prep 및 원심 융합 용액을 혼합하여 중추 신경 조직의 주요 오염 물질인 미엘린이 제거될 때까지 일련의 원심분리 단계를 통해 제거됩니다. 다음으로, 분리된 미토콘드리아는 선택한 1차 항체로 표지된 후 Fluor에 접합된 2차 항체로 표지됩니다.마지막 단계는 형광 염료를 첨가하여 미토콘드리아 정체성 또는 기능적 매개변수를 확인하는 것입니다. 궁극적으로, 유세포 분석은 정상적인 생리학 또는 질병 전반에 걸쳐 미토콘드리아 알토막의 상대적 풍부함을 보여주는 데 사용됩니다. 현미경 검사와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 수천 개의 개별 미토콘드리아에 대한 높은 처리량과 빠른 정량화가 가능하다는 것입니다.이 연구에 사용된 동물은 캐나다 동물 보호 위원회(Canadian Council on Animal Care Air)에서 설명한 국가 표준을 따르는 동물 보호를 위한 C-R-C-H-U-M 기관 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 엄격하게 처리되었습니다. 이 절차를 시작하려면 쥐에서 채취한 온전한 척수 전체를 5가지 부피의 균질화 완충액이 들어 있는 5밀리리터 유리 균질기에 넣습니다. 유리 균질화기를 얼음 위에 놓고 더 큰 조직 조각이 남지 않을 때까지 손으로 조직을 균질화하면 약 8번의 스트로크가 필요합니다.균질액을 2개 또는 3개의 마이크로 원심분리기 튜브에 옮기고 섭씨 4도에서 10분 동안 1, 300회 G에서 원심분리한 다음 S 피펫을 5밀리리터 초원심분리기 튜브에 넣습니다. 펠릿에 750마이크로리터의 균질화 완충액을 추가하고 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 그런 다음 현탁액을 원심 분리하고 펠릿을 다시 현탁시킵니다.두 번 더 반복하여 작은 파편을 제거하고 모든 상층액을 동일한 5mm 초원심분리기 튜브에 당긴 다음 튜브를 초원심분리기 로터에 넣습니다. 그네 물통 장비해, 17, 4 섭씨 온도의 15 분 동안 000 시간 G에 관을 원심분리기. 원심분리가 완료되면 세포질 분획이 관심 있는 경우 추가 처리를 위해 상등액을 저장합니다.다음으로, resus는 50 밀리몰 염화칼륨 원심 분리기를 포함하는 4 밀리리터의 균질화 완충액에 있는 조잡한 미토콘드리아 분획인 펠릿을 현탁시킵니다. 스윙 버킷 로터에서 섭씨 4도에서 15분 동안 17, 000배 G에서 재현탁된 펠릿을 재부유시킨 다음 supinate를 버리고 정확히 800마이크로리터의 현탁액에서 새로운 5밀리리터 초원심분리기 튜브의 800마이크로리터의 균질화 완충액에 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 다음으로 200마이크로리터의 iod dal을 재현탁된 펠릿 800마이크로리터에 피펫팅하여 12%iod Dal의 최종 농도를 생성합니다.튜브의 내용물을 P 1000 피펫으로 부드럽지만 철저하게 혼합한 다음 스윙 버킷 로터에서 섭씨 4도에서 15분 동안 17, 000배 G로 원심분리하고 튜브 상단의 수초층을 흡인하고 팔레트가 헐거워질 수 있으므로 초피네이트를 조심스럽게 폐기합니다. Resus는 펠릿을 4ml의 균질화 완충액에 현탁시킵니다. 다음 17, 000 시간 G에 그네를 진동하는 물통 회전자에 있는 4 섭씨 온도에 15 분 동안 당신의 이익을 원심 분리하십시오.supinate를 버리고 다시 사용하십시오. 펠릿을 4ml의 균질화 완충액에 현탁시킵니다. 그런 다음 원심분리를 다시 반복하고 앙와위 제인 reus를 제거합니다.100-200마이크로리터의 균질화 완충액에서 최종 펠릿을 구부리고 1.7ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 바이오닉산 분석 또는 BCA와 같은 표준 단백질 정량 분석을 사용하여 각 샘플의 단백질 양을 측정합니다. 정량 분석을 위해 샘플을 준비할 때 샘플과 표준 곡선을 2%sodium sulfate로 희석하여 미토콘드리아의 적절한 가용화를 보장합니다.테스트할 각 염색 혼합물에 대해 25마이크로그램의 분리된 미토콘드리아를 1.7ml 마이크로 센트리 튜브에 피펫팅합니다. 각 실험에 염색되지 않은 샘플과 각 항체 테스트 원심분리기에 대한 적절한 동형 대조군을 포함시켜야 하며, 벤치탑 마이크로 원심분리기에서 섭씨 4도에서 2분 동안 각 샘플을 17, 000배 G로 원심분리기합니다. 그런 다음 supinate를 제거하고 분리된 미토콘드리아를 50마이크로리터의 미토콘드리아 완충액에 재현탁시킵니다.10% 지방산이 없는 BSA가 보충되어 섭씨 4도에서 15분 동안 용액을 배양한 다음 용액 1밀리리터당 1차 항체 20마이크로그램을 추가합니다. 분리된 미토콘드리아를 1차 항체와 함께 섭씨 4도에서 30분 동안 배양하여 결합되지 않은 항체를 씻어내고 각 샘플을 원심분리한 다음 앙와위 natant를 버립니다. 다음으로, 펠릿을 200마이크로리터의 미토콘드리아 완충액에 부드럽게 재현탁시킨 다음 원심분리 단계를 반복하고 앙와위 natant를 버리고 펠릿을 50마이크로리터의 미토콘드리아 완충액에 재현탁합니다.샘플 1ml당 0.5마이크로그램의 2차 항체를 추가합니다. 그런 다음 빛을 차단한 상태에서 섭씨 4도에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 배양이 완료되면 각 샘플을 원심분리하고 결합되지 않은 2차 항체가 포함된 supinate를 폐기합니다. 리스.펠릿을 200마이크로리터의 미토콘드리아 완충액에 현탁시키고 샘플을 원심분리합니다. 다시. 그런 다음 supinate와 Reese를 제거합니다. 관찰된 이벤트가 실제로 미토콘드리아인지 확인하기 위해 500마이크로리터의 미토콘드리아 완충액에 펠릿을 현탁시킵니다.in Vitrogen의 MIT tracker green과 같은 미토콘드리아 특이적 형광 염료로 샘플을 어두운 곳에서 15분 동안 염색합니다. 다른 기능 파라미터를 조사하기 위해 더 이상의 염색이 필요하지 않은 경우, 라벨링된 샘플을 유세포 분석기에 적재하기에 적합한 튜브로 옮깁니다. 샘플을 얼음 위에 보관하고 수집을 위해 유세포 분석기로 진행하여 분리된 미토콘드리아가 온전한 막관통 전위를 가지고 있는지 확인하고 테트라에틸 막대 도민으로 염색하기 위한 대조군으로 실온에서 15분 동안 실온에서 15분 동안 테트라에틸 막대 도민 메틸 에스테르를 염색합니다.메틸 에스테르는 100 마이크로 몰 카르 보닐 시안화물 m 클로로 페놀 HydroOne의 존재하에 100 나노 몰 테트라 에틸 막대 도민 메틸 에스테르로 분리 된 미토콘드리아를 염색합니다. 이 화학 물질은 미토콘드리아 분리이며 미토콘드리아를 탈분극하여 분리된 미토콘드리아가 미토콘드리아 과산화물 생성을 위한 제어로 실온에서 15분 동안 시험체에서 붉은색 미토시스와 같은 적절한 과산화물 지시자로 미토콘드리아를 염색하는지 확인합니다. 10 마이크로몰 항마이신이 있는 상태에서 염료가 함유된 격리된 미토콘드리아에 머무릅니다.항마이신 A는 호흡 사슬의 복합체 3을 억제하는 물질이며 획득이 시작되기 전에 미토콘드리아 과산화물 생성을 증가시킵니다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 기기를 설정합니다. 그런 다음 튜브를 부드럽게 두드려 샘플을 혼합하되 소용돌이치지 마십시오.게이팅 중에 낮은 압력에서 초기 이벤트 수집을 시작합니다. 총 인구에 대한 게이트를 확인하십시오. 그런 다음 히스토그램의 전압을 적절하게 조정합니다.염색되지 않은 샘플의 피크는 일반적으로 두 번째 10 년에 해당합니다. 그런 다음 게이트가 설정되고 샘플이 처리되면 압력을 고유량 세포 분석으로 전환합니다. 척수 제제를 분석한 결과, 94%의 사례가 미토콘드리아 특이적 염료에 대해 양성인 것으로 확인되었습니다.이 실험에서 미토콘드리아 양성 반응의 30%는 미토콘드리아의 외막 융합과 관련된 단백질인 MIT 융합 2에 특이적인 항체로 표지되었습니다. 테트라에틸 루민 메틸 에스테르를 사용하여 미토콘드리아 막횡단 전위를 분석한 결과, 분리된 미토콘드리아의 95%가 온전한 막횡단 전위를 가지고 있는 것으로 나타났습니다. 이 염색은 미토콘드리아 unco functional 미토콘드리아의 존재 하에서 수행되었을 때 염색의 현저한 감소가 관찰됨에 따라 특이적인 것으로 나타났으며, 막 투과성 염료를 사용하여 측정한 바와 같이 기저량의 SUP 산화물을 생성하는 것으로 밝혀졌습니다.그것은 SUP 산화물과 형광 P 반응이 됩니다. 미토콘드리아를 항마이신 a로 처리하면 과산화물 생산이 약 10% 증가합니다. 이 기술은 적절하게 수행되면 6-7 시간 안에 완료 할 수 있습니다.

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이 동영상은 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체, 미토콘드리아 DNA 관련 단백질 및 미토콘드리아 외막 단백질에 대한 항체로 신경 세포를 라벨링한 후 유세포 분석을 통해 그 수준을 정량화하는 방법을 보여줍니다.

유세포분석을 사용한 뉴런의 다중 미토콘드리아 파라미터 측정

샘플 간의 미토콘드리아 막 전위를 비교하면 세포 상태에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있습니다. 형광을 사용하여 미토콘드리아를 분리하고 억제제 및 언커플러에 대한 반응을 평가하기 위한 자세한 단계가 설명되어 있습니다. 이 프로토콜의 방법과 유용성은 세포 배양 및 세포 스트레스의 동물 모델을 사용하여 설명됩니다.

분리 및 배양 세포 및 마우스 조직에서 미토콘드리아의 기능적 분석

여기, 선물이 hypoxia/reoxygenation 또는 보호 에이전트 없이 노출 되 고 후 세포의 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 평가 하기 위해 JC 1 염료를 사용 하는 프로토콜.

Hypoxia/Reoxygenation 후 심장 Myocytes에서 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 측정 하기 위한 교류 Cytometry 기반 분석

Mitophagy, 미토 콘 드리 아, 선택적 저하 미토 콘 드 리아 항상성에 연루 되어 고 다양 한 인간 질병에 폐지. 그러나, mitophagy 활동을 측정 하기 위한 편리한 실험적인 방법을 매우 제한 됩니다. 여기, 우리는 cytometry를 사용 하 여 mitophagy 활동을 측정 하기 위한 중요 한 분석 결과 제공 합니다.

형광 기자 흐름 Cytometry 사용 pH-종속 mt-Keima에 의해 Mitophagy의 중요 한 측정

이 문서에서는 미토 콘 드리 아 또는 살아있는 세포에서는 리소좀을 계량 하는 강력한 방법을 보여 줍니다. 표면 표식에 놓여있는지 활용 된 항 체와 리소좀 또는 미토 콘 드리 아 특정 염료의 조합 사용 하 여 조직 샘플에서 수확 하는 1 차 셀 같은 혼합된 세포 인구에 이러한 세포의 부 량 수 다 색 cytometry입니다.

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본 문서는 S. 세레비시아 및 HEK293T 세포 모두에서 단백질 자가 조립을 정량화하는 FRET 기반 유동 세포 분석 프로토콜에 대해 설명합니다.

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Xenobiotic efflux 펌프는 조혈 줄기와 전구 세포 (HSPC)에서 매우 활성화되어 미토콘드리아 막 잠재적 형광 염료인 TMRM의 압출을 유발합니다. 여기서, 우리는 유출 펌프 억제제인 Verapamil의 존재 에 있는 TMRM에 의하여 HSPC에 있는 미토콘드리아 막 전위를 정확하게 측정하는 프로토콜을 제시합니다.

에플로프 펌프 억제를 통해 조혈 줄기 및 전조 세포에서 미토콘드리아 막 전위성 유동 세포 측정 평가의 정확도 향상

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우리는 프로테옴 규모에서 단백질 발견 및 정량화와 호환되는 고품질 미토콘드리아 분리를 위한 2단계 프로토콜을 제시합니다. 우리의 프로토콜은 유전 공학을 필요로하지 않으므로 모든 일차 세포와 조직에서 미토콘드리아를 연구하는 데 적합합니다.

단백질 발견 및 정량 분석을 개선하기 위한 미토콘드리아의 2단계 태그 없는 분리

미토콘드리아 접촉 부위는 미토콘드리아 내막 및 외막 단백질과 상호 작용하는 단백질 복합체입니다. 이 부위는 미토콘드리아 막과 세포질과 미토콘드리아 기질 사이의 통신에 필수적입니다. 여기에서는 이 특정 종류의 단백질에 적합한 후보를 식별하는 방법을 설명합니다.

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학습하세요 쥐 척수에서 미토콘드리아를 분리하고 외막 단백질을 면역표지하는 방법을. 유동세포계측법으로 기능 분석을 동시에 수행하여 신경퇴행성 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

고립 된 미토콘드리아의 유동 세포 계측법에 의해 외부 막 단백질의 면역

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